Ação de fração do hormônio paratireóideo no metabolismo ósseo: estudo experimental em ratos por Ana Cristina Ferreira Bassit - Versão HTML

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Ana Cristina Ferreira Bassit

Ação de fração do hormônio paratireóideo no

metabolismo ósseo: estudo experimental em ratos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências.

Programa de: Ortopedia e Traumatologia

Orientador: Prof. Olavo Pires de Camargo

SÃO PAULO

2010

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Ba s

sit, Ana Cristina Ferreira

Ação de fração do hormônio paratireóideo no metabolismo ósseo : estudo

experimental em ratos / Ana Cristina Ferreira Bassit. -- São Paulo, 2010.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Ortopedia e Traumatologia.

Orientador: Olavo Pires de Camargo.

Descritores: 1.Hormônio do crescimento 2.Fator de crescimento insulin-like I

3.Osso e ossos/metabolismo 4.Osteogênese 5.Ratos

USP/FM/DBD-473/10

Dedicatória

Aos meus filhos,

Rodrigo e Ricardo

Sumário

Resumo

Summary

1 INTRODUÇÃO

1

2 REVISÃO DA LITERATURA

7

3 METODOS

16

3.1 Desenho experimental

17

3.2 Modelo animal

18

3.3 Grupos experimentais

19

3.4 Tratamentos

20

3.4.1 Tratamento placebo

20

3.4.2 Tratamento com PTH

21

3.4.3 Marcadores histológicos

22

3.5 Eutanásia

22

3.6 Exame necroscópico e anatomopatológico

23

3.6.1 Distribuição de tecidos e amostras por ocasião da

23

necropsia

3.7 Avaliação das amostras

24

3.7.1 Avaliação do peso corpóreo e comprimento femoral

24

3.7.2 Tomografia óssea quantitativa periférica

25

computadorizada (pQCT)

3.7.3 Análise histomorfométrica

26

3.7.3.1 Vértebras lombares

27

3.7.3.2 Tibias

29

3.7.4 Dosagem sérica de IGF-I

31

3.8 Critérios de exclusão

32

3.9 Análise estatística

32

4 RESULTADOS

33

4.1 Avaliação do peso corpóreo e comprimento femoral

34

4.2 Tomografia óssea quantitativa periférica computadorizada

36

(pQCT)

4.3 Análise histomorfométrica

46

4.4 Dosagem sérica de IGF-I

55

5 DISCUSSÃO

58

6 CONCLUSÕES

66

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA

68

RESUMO

BASSIT, A.C.F. Ação de fração do hormônio paratireóideo no metabolismo

ósseo: estudo experimental em ratos [tese]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo, 2010.

O hormônio da paratireóide (PTH) tem sido utilizado como um agente

anabólico ósseo para o tratamento de condições de osteopenia / osteoporose,

prevenção e consolidação de fraturas. O papel do fator de crescimento

semelhante à insulina I (IGF-I), como um potencial mediador dos efeitos

anabólicos do PTH, é controverso. O rato dwarf pode ser adequado para o

estudo dessas interações in vivo, uma vez que a os níveis séricos de hormônio

do crescimento (GH) encontram-se reduzidos a cerca de 6% dos valores

normais em fêmeas e os níveis séricos de IGF-I, a cerca de 10% dos valores

normais, mas estes animais são saudáveis e sem malformações esqueléticas.

Os objetivos deste estudo foram: 1 - Avaliar o rato dwarf (dw-/dw-) como um

modelo animal para o estudo dos efeitos da deficiência do GH e do IGF-I sobre

o esqueleto e o metabolismo ósseo; 2 - Comparar os efeitos do tratamento com

PTH sobre o esqueleto e formação óssea em ratos dwarf e em ratos Lewis, sua

linhagem de origem. A partir de 9 semanas de idade, ratas Lewis e dwarf

receberam injeções por via subcutânea, diariamente, por duas semanas, com

medicamento placebo ou fragmento de hormônio paratireóideo humano, hPTH

1-34, na dose de 50 µg / kg de peso corpóreo (N = 7-13/grupo). Foram

realizadas avaliações do peso corpóreo semanalmente e, por ocasião da

eutanásia, na 11ª semana, foram coletadas amostras de sangue para

realização de dosagens séricas de IGF-I (ELISA). As vértebras lombares e as

metáfises proximais das tíbias foram avaliadas por meio de histomorfometria

óssea. Os fêmures direitos foram mensurados e analisados por tomografia

quantitativa periférica computadorizada (pQCT). Os níveis séricos de IGF-I

mostraram-se três vezes menores nas ratas dwarf quando comparados aos

observados nas ratas Lewis, a despeito do tratamento com PTH, que não

provocou aumento de IGF-I em nenhum dos dois grupos. No entanto, o PTH

aumentou significativamente o volume ósseo trabecular em ambos os grupos,

dwarf (p<0.003) e Lewis (p < 0.0001) comparados aos seus respectivos grupos

controle, efeito associado ao aumento da espessura e da distância

trabeculares. As ratas dwarf tratadas com PTH também exibiram aumentos de 7

a 13 vezes na superfície de mineralização e na taxa de formação óssea

respectivamente, quando comparadas às ratas dwarf tratadas com placebo,

enquanto as ratas Lewis tratadas com PTH mostraram aumentos de 3 e 4

vezes quando comparadas as ratas Lewis tratadas com placebo. A taxa de

aposição mineral, indicativa de atividade osteoblástica, estava aumentada nas

ratas dwarf e Lewis tratadas com PTH (p<0.0001) comparadas aos seus

respectivos grupos controle. As análises pela pQCT das metáfises femorais

distais revelaram que todos os parâmetros estruturais do osso trabecular (BMC

total, BMD total, BMC trabecular e BMD trabecular) também apresentaram

valores significativamente aumentados nas ratas, Lewis e dwarf, tratadas com

PTH, quando comparadas às ratas tratadas com placebo (p<0.0001). Ao se

considerar os parâmetros para o osso cortical, praticamente todos os valores

obtidos nas diáfises femorais (BMC total, BMD total, BMC cortical, BMD cortical,

área cortical, espessura cortical, circunferência periosteal e endosteal) não

mostraram qualquer efeito do tratamento com PTH nos dois grupos. Em

conclusão, o PTH induziu efeitos anabólicos altamente significativos no tecido

ósseo trabecular das tíbias e vértebras lombares, a despeito dos baixos níveis

circulantes de IGF-I em animais da linhagem dwarf. A resposta positiva ao

tratamento com PTH confirma a sua utilização terapêutica como potente agente

anabólico ósseo mesmo em face à deficiência no eixo GH/IGF-I.

SUMMARY

BASSIT, A.C.F. Effect of human parathyroid hormone fragment on bone

metabolism: experimental study in rats [thesis]. São Paulo: University of São

Paulo, College of Medicine, 2010.

The parathyroid hormone (PTH) has been used as a bone anabolic agent

to treat osteopenic/osteoporotic conditions, prevention and healing of fractures.

The role of insulin-like growth factor I (IGF-I) as a potential mediator for the bone

anabolic effects of PTH is controversial. The dwarf rat (dw-/dw-) may be suitable

to study these interactions in vivo, since GH synthesis is selectively reduced to

about 6% of normal in females, and serum IGF-I levels are about 10% of

normal, but these animals are healthy without skeletal malformations. The

objectives of this study were: 1- Evaluate the dwarf rat (dw-/dw-) as an animal

model for studies of the effects of GH and IGF-I deficiency on the skeleton and

bone metabolism; 2- Compare the skeletal effects of PTH treatment in dwarf rats

and their background strain, Lewis rats. At 9 weeks of age, female Lewis and

dwarf rats were injected SC daily for 2 weeks with vehicle or human parathyroid

hormone fragment, hPTH 1-34, at a dose of 50 µg/kg body weight (N=7-

13/group). The body weight was evaluated weekly and at the time of

euthanasia, at 11 weeks, blood samples were collected. Serum IGF-I was

measured by ELISA, and cancellous bone histomorphometry was performed in

the lumbar vertebral body and tibial proximal metaphysis. The right femurs were

measured, scanned and analyzed by peripheral quantitative computed

tomography (pQCT). Serum levels of IGF-I were nearly 3-fold lower in dwarf rats

compared with Lewis rats regardless of treatment, but PTH treatment did not

increase serum IGF-I in either Lewis or dwarf rats. However, PTH significantly

increased cancellous bone volume in both dwarf (P<0.003) and Lewis rats

(P<0.0001) when compared to vehicle-treated rats, which was associated with

increased trabecular width and decreased trabecular separation. PTH-treated

dwarf rats also exhibited 7- and 13-fold increases in mineralizing surface and

bone formation rate respectively, compared to vehicle-treated dwarf rats, while

PTH-treated Lewis rats showed 3- and 4-fold increases when compared to

vehicle-treated Lewis rats. Mineral apposition rate, an index of osteoblast

activity, was increased in PTH-treated dwarf rats (P<0.0001) and in Lewis rats

(P<0.0001) compared to their respective control groups. The pQCT analyses of

the distal femoral metaphysis revealed that cancellous bone structural

parameters (total BMC, total BMD, trabecular BMC, and trabecular BMD) also

presented significantly higher values in PTH-treated dwarf and Lewis rats, when

compared to vehicle treated rats (P<0.0001). When considering cortical bone

parameters, almost all the values obtained at the femoral shafts (total BMC, total

BMD, cortical BMC, cortical area, cortical thickness, periosteal and endocortical

circumferences) did not show any PTH treatment effect in either groups. In

conclusion, PTH induced highly significant anabolic effects in vertebral and tibial

cancellous bone despite low circulating levels of IGF-I in dwarf rats. The positive

response to PTH treatment confirms its therapeutic use as a potent bone

anabolic agent, even in the face of GH/IGF-I deficiency.

1. INTRODUÇÃO

2

1 INTRODUÇÃO

As enfermidades do sistema músculo esquelético, particularmente a

osteoporose, oneram os sistemas de saúde, devido aos elevados custos com seu

tratamento e reabilitação. Trata-se de uma enfermidade de caráter sistêmico,

caracterizada pela diminuição da densidade mineral óssea (BMD), ruptura da

microarquitetura do tecido ósseo, comprometimento da resistência óssea e

consequente aumento no risco de fraturas, como resultado do desequilíbrio entre

os processos de formação e de reabsorção óssea. De acordo com estudo,

baseado em evidências, publicado em 2010, pela Sociedade Norte Americana de

Menopausa (The North American Menopause Society – NAMS), a osteoporose

afeta principalmente os idosos, em particular indivíduos do sexo feminino, sendo

responsável por cerca de 90% das fraturas de quadril e coluna em mulheres

americanas, brancas, com idade entre 65 e 84 anos. Em 2005, somente nos

Estados Unidos, foram gastos cerca de US$ 17 bilhões com custos da

osteoporose e fraturas relacionadas, segundo relatório publicado pela “National

Osteoporosis Foundation” - Washington, DC. ( “Clinician Guide to Prevention and

Treatment of Osteoporosis”, 2008) .

Vale lembrar que, a osteopenia, ou densidade mineral óssea diminuída, não

é encontrada somente em mulheres no período de pós menopausa, mas também

em outras condições onde há perda óssea por deficiência de estrógenos, como

em pacientes com anorexia nervosa e amenorréia hipotalâmica, na osteoporose

juvenil (Grinspoon et al., 1999; Giustina et al. , 2008) e na diabete do tipo I 3

(Bereket et al., 1995). Pacientes oncológicos submetidos a tratamento

quimioterápico também devem ser considerados, uma vez que a quimioterapia

causa reações adversas no metabolismo ósseo (Davies et al., 2002).

O osso, a despeito de sua aparência estática, é um tecido dinâmico,

submetido a constantes processos de modelamento e remodelamento no decorrer

da vida. O propósito destes processos, durante o crescimento, é levar o esqueleto

a atingir o seu pico de força e resistência. Durante a vida adulta, o propósito passa

a ser a manutenção da resistência, removendo tecido ósseo danificado e

preservando a integridade mecânica do esqueleto. No transcorrer destes

processos, osteoblastos e osteoclastos são submetidos à ação de uma variedade

enorme de hormônios e fatores de crescimento. Em uma complexa cadeia de

reações, estas substâncias levam à formação de tecido ósseo (pelos osteoblastos)

ou à reabsorção óssea (pelos osteoclastos) e desempenham um papel importante

na consolidação de fraturas, na perda óssea ligada à menopausa e, também, nas

enfermidades do metabolismo ósseo.

O fator de crescimento ligado à insulina (IGF-I), o hormônio do crescimento

(GH) e o hormônio da paratireóide (PTH) estão incluídos neste grupo de

substâncias com importante participação no metabolismo ósseo. Elas agem como

moléculas sinalizadoras envolvidas no controle da diferenciação do crescimento

celular.

Atualmente, a maior parte das drogas utilizadas no tratamento da

osteoporose atuam inibindo a reabsorção óssea. Os estrógenos, os bifosfonatos,

os moduladores de receptores seletivos para estrógenos e a calcitonina são

exemplos de agentes com ação anti reabsorção, que atuam nos osteoclastos para

4

prevenir a perda óssea. Entretanto, estas drogas não tem grande atuação na

formação de novo tecido ósseo para, efetivamente, promover a restauração deste

tecido. Uma nova abordagem no tratamento refere-se ao uso de agentes

anabólicos que possam melhorar o remodelamento e a renovação do tecido ósseo

como um todo, tanto na formação quanto na reabsorção óssea. A evolução destes

recursos terapêuticos baseia-se, sobretudo, em estudos sobre os fatores de

crescimento envolvidos no metabolismo e na constante renovação do tecido

ósseo.

O GH é de fundamental importância no crescimento ósseo longitudinal,

na maturação do esqueleto e na aquisição de massa óssea (Ohlsson et al.,

1998). O IGF-I, produzido inicialmente no fígado, é considerado o principal

mediador dos efeitos do GH no esqueleto. O GH e o IGF-I atuam como

importantes reguladores da homeostase óssea também durante a vida adulta

(Giustina et al., 2008), envolvidos no remodelamento ósseo e seus ciclos

consecutivos de reabsorção e formação de tecido ósseo. Durante estes

processos, pre-osteoblastos migram para as lacunas de reabsorção formadas

pelos osteoclastos e diferenciam-se em osteoblastos, que então sintetizam a

matriz óssea.

O IGF-I pode estimular a proliferação de osteoblastos e de fibroblastos, e

estimular a produção de colágeno do tipo I por estas células (Mc Carthy et al.,

1989). Baixos níveis sistêmicos de IGF-I estão relacionados à diminuição da

densidade mineral óssea, e consequentemente aumento do risco de fraturas.

5

O PTH tem sido empregado como agente anabólico no tratamento da

osteopenia/osteoporose, prevenção e consolidação de fraturas (Barnes et al. ,

2008). Classicamente, este hormônio é considerado um agente catabólico no

tecido ósseo; no entanto, estudos em animais revelaram que, quando

administrado intermitentemente, e em doses baixas, o PTH estimula a formação

tanto do osso trabecular como cortical (Morley et al. , 2001). Nakajima e cols.

(2002) relataram ainda que a administração intermitente de PTH, durante a

cicatrização óssea experimental, resultava na formação de um calo ósseo maior,

com melhora na maturação do tecido e na resistência biomecânica. Os

mecanismos de ação envolvidos nos efeitos do PTH sobre o esqueleto ainda não

foram totalmente esclarecidos e o papel do IGF-I como um mediador potencial dos

efeitos anabólicos ósseos deste hormônio também é bastante controverso. Parte

das divergências, entre os resultados obtidos nos estudos relacionados à

influência do eixo GH/IGF-I sobre o metabolismo ósseo e atuação do PTH, deve-

se aos diferentes modelos experimentais utilizados, especialmente modelos

geneticamente modificados. Muitas das linhagens apresentam baixos índices de

sobrevivência, deficiências de outros hormônios que também agem sobre o

metabolismo ósseo, e estado geral de saúde debilitado, complicando a

interpretação dos dados obtidos.

O presente trabalho tem como objetivo avaliar o papel do IGF-I sistêmico na

estrutura e função do tecido ósseo, em condições patológicas, nas quais os níveis

séricos de IGF-I encontram-se diminuídos, assim como a interferência desta

deficiência na ação anabólica óssea do PTH. Assim, serão testadas as seguintes

hipóteses:

6

1) Ratos da linhagem dwarf (dw-4/dw-4, autossômicos recessivos) podem

ser utilizados como um modelo animal adequado aos estudos sobre a

deficiência do IGF-I e seus efeitos na estrutura e metabolismo do tecido

ósseo.

2) O IGF-I atua como potencial mediador dos efeitos anabólicos do PTH, e

consequentemente, sua deficiência bloqueia de maneira significativa a

resposta do esqueleto ao tratamento com PTH.

7

2. REVISÃO DA LITERATURA

8

2

REVISÃO DA LITERATURA

O GH ou somatotropina é secretado pelas células da glândula pituitária

anterior, sob o controle do hormônio liberador do hormônio do crescimento

(GHRH) e da somatostatina, que exercem, respectivamente, ação estimulatória e

inibitória. Durante anos o GH foi considerado o principal responsável pelo

desenvolvimento do esqueleto. Estudos posteriores, no entanto, revelaram que

muitos dos efeitos metabólicos do GH são mediados pelo fatores de crescimento

similares à insulina (IGFs) ou somatomedinas – “hipótese da somatomedina”, de

acordo com Salmon e Daughaday (1957) apud Daughaday (2000). Segundo esta

hipótese, o GH estimula indiretamente a síntese e secreção de IGF-I, que age

como principal mediador nas células-alvo do tecido ósseo, estimulando a

expansão longitudinal da placa de crescimento de uma maneira endócrina.

Em 1993, Powel -Braxton et al., desenvolveram camundongos

heterozigotos para IGF-I (IGF-I+/-) e camundongos homozigotos ou “knockout”

(IGF-I-/-), como modelos de experimentação para investigar o papel deste fator no

desenvolvimento. Os camundongos heterozigotos apresentaram redução de 37%

dos níveis séricos de IGF-I quando comparados aos da mesma linhagem, porém

não modificados geneticamente. Apesar da marcação pela tetraciclina não ter

demonstrado diferença significativa na placa de crescimento, estes animais

mostraram-se 10 a 20% menores por ocasião do nascimento e durante as 17

semanas de acompanhamento. Estes heterozigotos, machos e fêmeas,

mostraram-se férteis e puderam gerar camundongos homozigotos. Estes animais

apresentaram redução de 60% do peso corpóreo, distrofia muscular acentuada e

9

elevada letalidade perinatal (> 95%), demonstrando claramente o impacto

negativo da ausência de IGF-I .

O IGF-I passou a ser apontado como um dos mais importantes fatores

anabólicos no crescimento ósseo por diversos autores (Liu et al., 1993; Ohlsson et

al., 1998; Clemens e Chernausek, 2004; He et al., 2006; Giustina et al., 2008; Rosen, 2008).

Camundongos “knockout” para IGF-I também foram utilizados por Bikle et

al. ( 2001) para analizar os efeitos da ausência de IGF-I sobre o esqueleto, por

meio de histomorfometria óssea, tomografia óssea quantitativa periférica

computadorizada (pQCT) e tomografia microcomputadorizada (µCT). Houve

acentuado retardo no crescimento e diminuição no tamanho dos ossos avaliados

(tíbias e vértebras lombares – L1). A taxa de formação óssea (BFR, do inglês,

bone formation rate) mostrou-se 27% diminuída em relação aos animais do grupo

controle e, ao se administrar IGF-I, aumentou cerca de 5 vezes. Os valores

obtidos com a tomografia (pQCT), em sua maior parte, não foram considerados

confiáveis e a microtomografia (µCT) das tíbias e vértebras obteve resultados

contrastantes entre os dois ossos avaliados.

Em 1957, quando comecou a buscar um sistema que permitisse estudar os

efeitos anabólicos do GH em tecidos in vitro, Daughaday escolheu a cartilagem de

ratos, após ter observado o papel essencial que a cartilagem epifisária

desempenha no crescimento ósseo, e também porque a ação do GH na

cartilagem epifisária de ratos hipofisectomizados constituiu um dos ensaios

bilológicos mais sensíveis em seus estudos prévios. A cartilagem epifisária,

10

porém, não pode ser facilmente dissecada e ele acabou por conduzir seus estudos

utilizando segmentos de cartilagem costal.

Em trabalho recente, Hutchinson et al. (2007) utilizaram um modelo bovino

para avaliar a placa de crescimento, acreditando que esta pudesse apresentar

fisiologia mais semelhante à da epífise de uma criança em crescimento, que o

modelo com camundongos ou ratos. Os condrócitos foram coletados, corados,

microdissecados e separados nas quatro regiões de crescimento (ou frações

celulares) da placa epifisária e então expostos ao fator de crescimento

fibroblástico básico (bFGF), ao GH e ao IGF-I. As quatro regiões foram

identificadas como: região 1 ou R – reserva, região 2 ou P –proliferativa, região 3

ou PH – pre-hipertrófica, região 4 ou H - hipertrófica Posteriormente, os

condrócitos foram utilizados em culturas celulares e na realização de “real-time

RT-PCR” (do inglês, reação em cadeia pela polimerase através de transcripção

reversa em tempo real). O hormônio do crescimento isolado não provocou

aumento na proliferação de nenhuma das quatro frações celulares; a proliferação

estimulada pelo IGF-I foi observada nas células da fração 4 (células hipertróficas),

com um aumento de três vezes em relação ao controle; o bFGF isolado não

estimulou proliferação em nenhuma fração celular, mas a combinação de IGF-I

com bFGF levou ao aumento na proliferação das células das frações 1 e 2 (células

de reserva e células proliferativas). A análise das frações celulares pela técnica de

“real-time RT-PCR” demonstrou não haver contaminação por osteoblastos ou

células do pericôndrio. Estes resultados sugeriram que “o maior estímulo ao

crescimento em animais de grande porte é o IGF-I de origem sistêmica e não o

hormônio do crescimento”.

11

O IGF-I é sintetizado no fígado, onde ocorre sua maior expressão e é

posteriormente transportado a outros tecidos atuando como um hormônio

endócrino (Ohlsson et al., 1998). No tecido ósseo, o IGF-I estimula a formação

óssea e a síntese de proteínas, aumenta a replicação de células da linhagem

osteoblástica, a proliferação de osteoblastos e fibroblastos, a produção de

colágeno pelos osteoblastos, a deposição de matriz óssea e diminui a

degradação de colágeno (Thorngreen et al., 1975; Rajaram et al., 1997; Bou-

Gharios e Crombrugghe, 2008; Rosen, 2008).

Há que se considerar ainda a produção local de IGF-I em tecidos extra-

hepáticos. Afora o fígado, o osso é a fonte importante de IGF-I em mamíferos. O

IGF-I produzido no tecido ósseo atua como um fator de crescimento local,

exercendo, então, efeitos parácrinos específicos. Yakar et al. (1999) ressaltaram a

importância do IGF-I local, ao observar que o o crescimento ósseo longitudinal não

foi afetado em camundongos “knockout” para o IGF-I hepático, demonstrando que

o IGF-I local e/ou os efeitos diretos do GH podem substituir a ação do IGF-I

sistêmico. O IGF-I é encontrado nas células da linhagem osteoblástica, assim

como nos condroblastos e nos osteoclastos (Molina, 2006; Bou-Gharios e

Crombrugghe, 2008).

Embora já tenha sido demonstrado, de maneira consistente, que o IGF-I

desempenha um papel fundamental no desenvolvimento e função do esqueleto,

ele também é influenciado pela ação de outros hormônios (além do GH) que

atuam no metabolismo ósseo. O PTH, o hormônio tireoídeo (TH), o cortisol,

estrógenos e andrógenos, entre outros, são capazes de alterar os níveis de IGF-I

nas células ósseas, e ainda, como referido por Rosen (2008) em uma das mais

12

recentes revisões sobre este tema, “tanto os IGFs como os outros componentes

deste sistema regulatório estão sob a influência de um grande número de

determinantes genéticos, ambientais e hormonais”.

A ação biológica do IGF-I encontra-se ainda sob o controle de seis

diferentes proteínas ligantes (IGFBPs), que regulam a disponibilidade do IGF-I ao

seu receptor nos tecidos alvo. In vivo, aproximadamente 99 % dos fatores de

crescimento semelhantes à insulina do tipo I encontram-se associados a

proteínas de ligação na circulação (Baxter et al., 1989; Rechler, 1993). As IGFBPs

(1–6) podem inibir a ação do IGF-I ao ligar-se competitivamente, impedindo que o

IGF-I ligue-se ao seu receptor; em outras situações, podem aumentar a aitvidade

do IGF-I, ou ainda agir de forma independente. Em humanos, cerca de 80% do

IGF-I circulante encontra-se na forma de um complexo ternário, constituído por

uma molécula de IGF-I, uma molécula de IGFBP-3 e uma molécula de proteína

denominada ALS (do inglês, acid-labile subunit). Nesta forma, a IGFBP-3 retém o

IGF-I no sistema vascular, aumentando sua meia-vida e constituindo, assim, um

resevatório de IGF-I. A disponibilidade biológica do IGF-I também é influenciada

pela ação proteolítica de um família de proteases especíificas, responsáveis pela

clivagem das IGFBPs.

Enquanto o IGF-I sistêmico é diretamente dependente do GH, a produção

de IGF-I local no tecido ósseo não é tão influenciada pelo GH e também encontra-

se sob o controle de diversos outros hormônios, incluindo o PTH (Melmed, 1999;

Bikle et al., 2002).

O PTH é um hormônio polipeptídico, constituído por 84 aminoácidos, que

tem como principal efeito fisiológico a manutenção da homeostase de cálcio e

13

fosfato no organismo, além de participar da remodelação óssea, da excreção renal

de fosfato e da ativação da vitamina D. Para a manutenção destes processos, a

síntese e a liberação de PTH pelas glândulas paratireóides é contínua.

As principais respostas fisiológicas provocadas pelo PTH são mediadas

pela sua adesão a receptores da membrana celular nos orgãos-alvo e por

múltiplos mecanismos de sinalização celular . Apesar de três receptores para o

PTH (PTHR) terem sido identificados (PTHR1, PTHR2 e PTHR3), os principais

efeitos fisiológicos do PTH são mediados pelo PTHR1, em especial no sistema

esquelético, onde o PTHR1 é encontrado nos osteoblastos. Desta forma, a

atividade osteoclástica é indiretamente mediada pelos osteoblastos, levando ao

aumento da degradação óssea e à rápida liberação de cálcio pela matriz óssea.

Os efeitos do PTH são ainda mediados nos osteoblastos pela síntese ou atividade

de diversas proteínas, incluindo o fator de diferenciação osteoclástica (ODF),

também conhecido como ligante do receptor ativador do fator nuclear κ B (RANKL)

ou ligante da osteoprotegerina. O PTH estimula a expressão desta proteína nas

células osteoblásticas, que ao se ligar ao receptor ativador do fator nuclear κ B

(RANK) nas células precursoras hemopoiéticas, estimula a diferenciação destas

células em osteoclastos funcionais. No tecido ósseo, o PTH também estimula

genes vitais ao processo de degradação da matriz extracelular e remodelação

óssea (colagenase 3), a estimulação e recrutamento de osteoclastos (Molina,

2006).

Apesar de exercer uma ação catabólica sobre o tecido ósseo, ao

restabelecer os níveis séricos de cálcio, quando administrado em doses baixas e

de forma intermitente, o PTH apresenta efeitos anabólicos (Zhou et al., 2001;

14

Compston, 2007). Os mecanismos envolvidos não estão ainda totalmente

esclarecidos, sabe-se, porém, que o PTH ao ligar-se a receptores na membrana

de osteoblastos ativa uma cascata de sinalização de enzimas dependentes do

AMP cíclico (ou PKA, do inglês, protein kinase A), que por sua vez, levam a

ativação da transcrição de genes envolvidos na diferenciação e atividade dos

osteoblastos, como Runx2, osteocalcin, e ALP, ou ainda genes envolvidos na na

atividade osteoclástica ( RANKL).

IGF-I é considerado um mediador essencial para os efeitos anabólicos

ósseos do PTH in vitro e in vivo por diversos autores (Canalis et al., 1989; Linkhart e Mohan, 1989; Pfeilschifter et al., 1995; Watson et al., 1995; Bikle et al., 2002; Yamaguchi et al., 2005). No entanto, o papel desempenhado pelo eixo GH/IGF-I

na mediação dos efeitos anabólicos ósseos do PTH ainda é controverso. Hock e

Fonseca (1990) consideraram que o efeito anabólico do PTH encontrava-se

diminuído em ratos hipofisectomizados, enquanto outros estudos revelaram uma

influência menor do eixo GH/IGF-I (Gunness e Hock, 1995; Hock e Wood, 1995;

Shmidt et al., 1995). A razão desta discordância ainda não está clara, mas os

estudos com ratos hipofisectomizados são difíceis de serem conduzidos pela

condição física debilitada destes animais e pelas deficiências de outros hormônios

ativos no tecido ósseo como o hormônio estimulante da tireóide e também

corticosteroides. Mais recentemente, tem-se utilizado o camundongo “knockout”

para IGF-I nos estudos das interações esqueléticas entre IGF-I e PTH.

Wang et al. (2007) examinaram o papel do IGF-I como mediador das ações

do PTH. Camundongos com mutação genética específica no receptor de IGF-I

foram tratados com PTH (80 µg/kg de peso vivo por duas semanas) e comparados

15

a um grupo controle. Tomografia micro-computadorizada, histomorfometria, cultura

celular e provas de avaliação genética foram aplicadas às amostras de osso

obtidas após a eutanásia. Os resultados revelaram diminuição do volume ósseo,

da espesssura da camada cortical, da formação de periósteo e da mineralização,

indicando que “o receptor para IGF-I (IGF-IR) em osteoblastos maduros estava

envolvido como mediador das ações anabólicas do PTH”.

16

3. MÉTODOS

17

3

MÉTODOS

3.1

Desenho experimental

O projeto de pesquisa foi formulado com o objetivo de testar as seguintes

hipotéses:

1) Ratos da linhagem dwarf (dw-4/dw-4) fornecem um modelo animal

adequado aos estudos sobre a deficiência do eixo GH/IGF-I e seus

efeitos na estrutura e função do tecido ósseo.

2) A deficiência no eixo GH/IGF-I não bloqueia significantemente a

resposta do esqueleto ao tratamento com PTH.

O desenho experimental seguiu os princípios éticos do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA), da American Veterinary Medical Association

(AVMA) e do Institute of Animal Care And Use Comitee (IACUC), no que se refere

à manutenção dos animais, protocolos de anestesia, analgesia e eutanásia.

Pesquisador responsável (Principal Investigator - University of Florida) e

pesquisador executante foram credenciados pelo IACUC para atuar em

experimentos com modelos animais no Animal Care Services (ACS) - University of

Florida, sendo que o projeto foi submetido e aprovado pelo mesmo Comitê. O

projeto também foi avaliado e aprovado pela Comissão de Análise de Projetos de

18

Pesquisa – CAPPesq – do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo.

3.2

Modelo animal

O rato ( Ratus norvegicus) foi selecionado como animal de experimentação

nesta pesquisa, uma vez que tem demonstrado ser um modelo bastante útil nos

estudos envolvendo distúrbios ósseos e agentes anti-reabsorção óssea, como

estrógenos e bifosfonatos. Os resultados obtidos nesta espécie animal têm se

mostrado consistentes e transponíveis para a aplicação em seres em humanos.

Foram utilizados ratos da linhagem Lewis e dwarf (dw-4/dw-4), ambos

provenientes do Laboratório Harlan (UK). Ratos da linhagem dwarf (linhagem

mutante anã, dw-4/dw-4) são animais autossômicos recessivos para o gene dw-4,

descritos por Hedrich (1990). São resultantes de mutação ocorrida em colônias de

ratos da linhagem Lewis e foram avaliados quanto à sua utilização como modelo

animal em pesquisas para estudar os efeitos da deficiência do eixo GH/IGF-I

sobre o tecido ósseo. Nestes animais mutantes, a síntese de GH encontra-se

seletivamente reduzida a cerca de 6% dos níveis normais em fêmeas, e os níveis

de IGF-I a cerca de 10% do normal. O crescimento apresenta-se retardado, com

índices 40 a 50% menores. As concentrações de outros hormônios tróficos, como

hormônio luteinizante (LH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), prolactina

(PRL) e hormônio adrenocorticotrófico (ACTH ), não se apresentam alteradas.

19

3.3 Grupos experimentais

Os animais foram recebidos com 5 semanas de idade e mantidos sob as

mesmas condições nutricionais e de manejo, acondicionados aos pares em

gaiolas e estantes com sistema de filtragem e exaustão de ar, fornecimento

automatizado de água, sob condições de manutenção laboratorial padronizadas

com ciclo de 13 horas de luz e 11 horas de escuridão, temperatura de 25°C e

umidade de 48%. Em seguida, foram submetidos a período de aclimatação

durante um mês, tendo sido avaliados diariamente quanto às condições gerais de

saúde. O peso corpóreo foi aferido semanalmente, habituando-se os animais ao

manuseio pelos pesquisadores.

Os animais foram divididos em quatro grupos para avaliação das alterações

nos tecidos ósseos da linhagem mutante e, posteriormente, comparação da

resposta ao tratamento com PTH nas duas linhagens. A distribuição dos grupos

procedeu-se da seguinte forma:

Grupo 1 - Ratas da linhagem Lewis com padrão de desenvolvimento

normal, que receberam medicação placebo a partir de 9 semanas de idade,

injetada por via subcutânea, diariamente por 2 semanas, (N=13);

Grupo 2 - Ratas da linhagem mutante dwarf, que receberam medicação

placebo a partir de 9 semanas de idade, injetada por via subcutânea, diariamente

por 2 semanas, (N=13);

20

Grupo 3 – Ratas da linhagem Lewis com padrão de desenvolvimento

normal, que receberam hPTH 1-34, a partir de 9 semanas de idade, injetada por

via subcutânea, diariamente por 2 semanas, (N=10);

Grupo 4 - Ratas da linhagem mutante dwarf, que receberam fragmento de

hormônio paratireóideo humano, hPTH 1-34, a partir de 9 semanas de idade,

injetado por via subcutânea, diariamente por 2 semanas, (N=7);

3.4

Tratamentos

De acordo com o protocolo anteriormente proposto, todos os tratamentos

foram iniciados no momento em que os animais atingiram 9 semanas de idade,

utilizando-se as mesmas vias de aplicação, duração e volumes administrados,

conforme descrição a seguir.

3.4.1 Tratamento placebo

A solução placebo foi preparada a partir da dissolução de 0,1 ml de ácido

hidroclorídrico (HCl) em 1000 ml de água destilada apirogênica. Esta solução

ácida, foi posteriormente adicionada a 97,9 ml de solução salina estéril e filtrada

(filtro 0,22µ mil ipore para adesão de proteínas de baixo peso molecular).

Ao atingir nove semanas de idade, os ratos dos grupos 1 e 2 receberam

injeções diárias da solução placebo, na dose de 0,1 ml/kg de peso corpóreo, por

via subcutânea, durante duas semanas.

21

3.4.2 Tratamento com PTH

Por ocasião da eutanásia dos animais pertencentes aos grupos 1 e 2

(também utilizados como grupos controle para os grupos 3 e 4), foram obtidas

amostras de soro. As amostras de sangue, coletadas através da artéria aorta

abdominal, foram mantidas em temperatura ambiente para coagulação, durante 20

minutos e então centrifugadas por 15 minutos a 2000 rpm. Em seguida, foram

acondicionadas em tubos de ensaio fechados e mantidas em banho-maria por 1

hora, à temperatura de 50 °C, distribuídas em alíquotas de 2 ml em tubos

Eppendorf e estocadas à temperatura de -80 °C até a sua utilização. Especial

cuidado foi observado na individualização das amostras. As amostras de soro

obtidas de ratos Lewis foram utilizadas somente no preparo de soluções para

ratos Lewis e, da mesma forma, as amostras de soro provenientes de ratos dwarf,

utilizadas em soluções para animais da mesma linhagem.

Fragmentos de PTH com terminal amino têm sido utilizados como potentes

agentes anabólicos no tratamento de osteoporose (Fraher, 1999). Neste estudo,

foi utilizado o fragmento de PTH humano, hPTH (1-34) sintético, proveniente do

Laboratório Bachem Inc. (Torrance, CA), diluído no veículo de solução salina

ácida, ao qual se adicionou 2 ml soro inativado por calor, de acordo com a

linhagem de procedência, Lewis ou dwarf.

Desta forma, as ratas pertencentes aos grupos 3 e 4, receberam injeções

diárias de hPTH (1-34), na dose de de 50 µg/kg de peso corpóreo, por via

subcutânea, durante duas semanas.

22

3.4.3 Marcadores histológicos

Compostos de fluorocromo, declomicina e calceína (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), foram administrados como marcadores da formação de tecido

ósseo nas análises histomorfométricas. As administrações foram realizadas por

via subcutânea, na dose de 15 mg/kg, no 10º e 3º dias antecedentes à eutanásia,

respectivamente, de forma a marcar as superficíes com formação ativa de tecido

ósseo.

3.5

Eutanásia

Ao término do experimento, foi realizada eutanásia, segundo os critérios

estabelecidos pela Associação Americana de Medicina Veterinária – American

Veterinary Medical Association - AVMA Guidelines on Euthanasia - em 2007, e

aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Comitee (IAACUC). Os animais

foram submetidos à anestesia geral com quetamina (Ketaset® – Fort Dodge

Laboratories, Fort Dodge, IA) e xilazina (AnaSed® – Lloyd Laboratories,

Shenandoah, IA), nas doses de 50 e 10 mg/kg, respectivamente.

Após constatação de adequado plano anestésico, foi realizada

exsanguinação e coleta de sangue através da artéria aorta abdominal para

obtenção de valores de hematócrito e análises séricas de IGF-I, seguida de

deslocamento tronco-cerebral para confirmação de óbito.

23

3.6

Exame necroscópico e anatomopatológico

Foi realizado exame necroscópico para identificação de possíveis

alterações patológicas, previamente à retirada de tecidos para análise. A amostra

de sangue obtida foi utilizada para realização de hamatócrito logo após a

eutanásia, com aparelho de microhematócrito (Clay Adams, Parsippany, NJ), e

também para obtenção de alíquotas de soro, mantidas à temperatura de -80°C,

para posteriores análises bioquímicas e biomoleculares.

3.6.1 Distribuição de tecidos e amostras por ocasião da necrópsia

Foram coletadas ambas as tíbias, fêmures direitos, as extremidades

proximais dos fêmures esquerdos, as primeiras e segundas vértebras lombares, e

as quintas e sextas vértebras caudais de cada animal. Estas amostras tiveram

todo tecido músculo-esquelético removido e os espécimes de osso destinados à

realização de exame histomorfométrico (tíbias e vértebras), foram acondicionados

em recipientes com solução de formalina tamponada com fosfato (pH= 7,4) por 24

horas, transferidos para recipientes com etanol 70 % e, posteriormente,

submetidos a processo de descalcificação. Os fêmures direitos foram mantidos em

solução de formalina até obtenção dos valores de comprimento do osso em seu

eixo longitudinal e realização da tomografia óssea quantitativa periférica

computadorizada (pQCT). As extremidades proximais dos fêmures esquerdos,

assim como fragmentos de lobos hepáticos, foram acondicionados em tubos de

24

ensaio e mantidos em recipiente contendo nitrogênio líquido, até posterior

manutenção em freezer à temperatura de -80 °C.

3.7

Avaliação das amostras

Avaliação do peso corpóreo e comprimento femoral, tomografia óssea

quantitativa periférica computadorizada (pQCT), análise histomorfométrica e

dosagem sérica de IGF-I foram os métodos aplicados para avaliar os efeitos dos

tratamentos sobre a massa e a densidade de osso cortical e esponjoso, a

formação e a reabsorção ósseas, e os níveis endógenos de IGF-I nos diferentes

grupos de experimentação.

3.7.1 Avaliação do peso corpóreo e comprimento femoral

A avaliação do peso corpóreo e do comprimento femoral foi realizada como

uma primeira análise, indicativa dos efeitos da deficiência no eixo GH/IGF-I sobre

o desenvolvimento geral e, posteriormente, das diferentes respostas aos

tratamentos aplicados nas duas linhagens distintas consideradas na pesquisa. O

peso corpóreo foi avaliado semanalmente em todos os grupos, utilizando-se a

mesma balança de precisão. Os fêmures direitos foram mensurados com

paquímetro digital eletrônico (Fisher Scientific), considerando-se toda a extensão,

estipulando-se o trocanter maior e a cabeça femoral como limites proximais e as

extremidades dos côndilos femorais como limites distais.

25

3.7.2 Tomografia óssea quantitativa periférica computadorizada (pQCT)

A tomografia óssea quantitativa periférica computadorizada (peripheral

quantitative computed tomography – pQCT) foi utilizada por ser um método

desenvolvido para medidas do esqueleto apendicular que, além de fornecer amplo

leque de dados, permite avaliar isoladamente o osso cortical e o trabecular.

A obtenção de imagens foi realizada nos fêmures direitos, utilizando-se

equipamento Stratec XCT Research M instrument (Norland Medical Systems, Fort

Atkinson, WI), a uma distância de 5 mm e 4 mm da extremidade distal do fêmur,

para medidas estruturais de osso trabecular em ratos das linhagens Lewis e dwarf,

respectivamente. Foi considerada, desta forma a influência das diferentes medidas

de comprimento dos fêmures sobre a localização das regiões de interesse nas

diferentes linhagens de ratos. Semelhantemente, na avaliação do osso cortical, as

imagens foram tomadas a uma distância de 16 mm e 14 mm para ratos Lewis e

dwarf, respectivamente.

Os parâmetros avaliados na região metafisária dos fêmures foram:

- conteúdo mineral ósseo total (total BMC – total bone mineral content, mg/mm);

- densidade óssea total (total BMD - total bone mineral density, mg/cm3);

- conteúdo mineral ósseo trabecular (trabecular BMC - trabecular mineral content,

mg/mm);

- densidade mineral óssea trabecular (trabecular BMD - trabecular mineral density,

mg/cm3);

- área total (total area, mm2);

- área trabecular (trabecular area, mm2).

26

Na diáfise femoral, os valores obtidos para análise do osso cortical foram:

- conteúdo mineral ósseo total (total BMC - total bone mineral content, mg/mm);

- densidade óssea total (total BMD - total bone mineral density, mg/cm3);

- conteúdo mineral ósseo cortical (cortical content, mg/mm);

- densidade mineral óssea cortical (cortical density, mg/cm3);

- área cortical (cortical area, mm2);

- espessura cortical (cortical thickness, mm);

- circunferência periosteal (periosteal circumference, mm);

- circunferência endosteal (endosteal circumference, mm).

3.7.3 Análise histomorfométrica

A histomorfometria é um método que fornece consistente informação

quantitativa sobre a organização microscópica e estrutura do tecido ósseo

através de análise assistida por computador das imagens dos cortes

histológicos. Os valores histomorfométricos do tecido ósseo procedentes dos

segmentos proximais das tíbias e as vértebras lombares foram analisados nos

quatro diferentes grupos pertinentes ao estudo.

Os segmentos proximais das tíbias e as vértebras lombares passaram por

processo de desidratação em soluções com concentrações crescentes de etanol a

70 %, 95 % e 100 %. A seguir, foram descalcificadas, embebidas em

27

metilmetacrilato modificado e seccionadas longitudinalmente com micrótomos

Jung 2065 e 2165 (Leica Corp., Rockleigh, NJ) nas espessuras de 4 e 8 mm.

Os cortes com 4 mm de espessura foram corados de acordo com o método

de Van Kossa, utilizando-se tetracromo como corante (Polysciences, Warrington,

PA), enquanto os cortes com 8 mm de espessura permaneceram sem coloração

para posterior obtenção de dados relativos à marcação com fluorocromos sob

análise microscópica com luz ultra-violeta. As medidas do tecido ósseo foram

realizadas no osso esponjoso das metáfises proximais das tíbias, iniciando-se a

uma distância de 1 mm da junção da placa de crescimento com a região

metafisária, excluindo-se a região esponjosa primária. Nas vértebras lombares, a

região de interesse (ROI – region of interest) foi definida na porção central dos

corpos vertebrais, a uma distância de 0.5 mm da junção das placas de

crescimento com a região metafisária (comprimento máximo de 3 mm) e,

lateralmente, à distância de 0.25 mm do osso cortical. Todos os dados foram

obtidos através do sistema Bioquant Bone Morphometry System (R&M Biometrics

Corp., Nashvil e, TN) e Osteomeasure System (Osteometrics, Inc., Atlanta, GA).

Os índices morfométricos utilizados seguiram a nomenclatura padronizada por

Parfitt (1987) e adotada pelo Comitê Científico da American Society of Bone and

Mineral Research.

3.7.3.1 Vértebras lombares

Foram avaliados os seguintes parâmetros histomorfométricos estruturais

nos cortes das vértebras lombares com 4 mm de espessura:

28

- Volume trabecular – BV/TV (%): volume de osso trabecular ou esponjoso,

expresso como uma porcentagem do volume total ocupado pela medula e

trabéculas.

- Número trabecular - Tb.N (n°/mm): número de traves ou trabéculas ósseas, por

milímetro de tecido ósseo, sendo também um índice que expressa a densidade

trabecular.

- Espessura trabecular – Tb.Th (µm): e a espessura das traves ou trabéculas

ósseas, expressa em micra.

- Separação ou distância trabecular (µm): é a distância entre as traves ou

trabéculas ósseas, expressa em micra.

- Volume osteóide – OV/BV (%): volume ocupado pelo osso osteóide (não

mineralizado), expresso como porcentagem do volume ocupado pelo osso

trabecular total (mineralizado e não mineralizado).

- Superfície osteóide - OS/BS (%): porcentagem da superfície trabecular

recoberta por matriz osteóide, em relação à superfície trabecular total.

- Superfície osteoblástica – Ob.S/BS (%): porcentagem da superfície trabecular

que apresenta osteoblastos, em relação à superfície trabecular total ou perímetro

total de osso esponjoso .

- Superfície osteoclástica – Oc. S/BS (%): porcentagem da superfície trabecular

que apresenta osteoclastos, em relação à superfície trabecular total.

Os parâmetros dinâmicos, índices de formação óssea, avaliados através da

marcação com fluorocromo, foram obtidos a partir dos cortes com 8 mm de

29

espessura das vértebras lombares não corados. Foram mensuradas, através do

sistema Osteomeasure, as porcentagens de superfícies de osso trabecular com

dupla marcação por fluorocromo:

- Taxa de aposição mineral – MAR (µm/dia): espessura do novo osso mineralizado

depositado na unidadade de tempo, expressa em micra por dia. É considerada um

índice de atividade osteoblástica.

- Superfície mineralizante - MS/BS (%): é a porcentagem da superfície trabecular

que apresenta dupla marcação por fluorocromos.

- Taxa de formação óssea – BFR/BS (µm3/ µm2/dia): foi calculada multiplicando-se

a superfície mineralizante (MS/BS) pela taxa de aposição mineral (MAR).

3.7.3.2 Tíbias

Nos segmentos proximais das tíbias (cortes com 4 mm de espessura),

foram avaliados os parâmetros histomorfométricos estruturais: volume trabecular,

número trabecular, espessura trabecular e distância trabecular.

Como parâmetro dinâmico, foi avaliado o crescimento ósseo longitudinal

(µm/dia), na área de ossificação endocondral, da zona proliferativa até a linha

marcada pelo fluorocromo calceína, administrado no terceiro dia antecedente a

eutanásia, correspondente à transição da zona esponjosa primária.

As extremidades das porções distais das tíbias, por sua vez, foram

desidratadas e tiveram a gordura tecidual removida através de tratamento com

30

etanol a 100 % e acetona, sendo posteriormente descalcificadas e embebidas em

estireno monomérico, que se polimeriza em resina de polyester (Tap Plastics, San

Jose, CA). As diáfises tibiais foram então seccionadas a 1-2 mm proximais à

junção tibiofibular, em cortes tranversais com aproximadamente 150 mm de

espessura, utilizando-se uma serra de baixa velocidade (Isomet low-speed saw -

Buehler, Lake Bluff, IL). Estes cortes foram desgastados até atingir a espessura de

50 mm para realização das medidas histomorfométricas do osso cortical, também

com o sistema Osteomeasure, que incluíram parâmetros semelhantes aos

avaliados para o osso trabecular:

- Área de osso cortical (µm2): calculada através da subtração da área

correspondente à medula óssea da área total de osso cortical.

- Espessura da área de osso cortical (µm): obtida através da mensuração da

distância entre a superfície periosteal e a superfície endocortical, em quatro locais

equidistantes de cada corte.

- Taxa de aposição mineral – MAR (µm/dia): obtida através da divisão da distância

entre as marcações por fluorocromo pelo intervalo em dias entre as

administrações dos marcadores.

- Superfície mineralizante - MS/BS (%): índice de formação óssea ativa,

porcentagem da superfície com dupla marcação por fluorocromos.

- Taxa de formação óssea – BFR/BS (µm3/ µm2/dia): calculada para ambas as

superfícies, periosteal e endocortical, multiplicando-se MS/BS pela MAR.

31

3.7.4 Dosagem sérica de IGF-I

O método ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) foi realizado

para se obter os valores dos níveis séricos de IGF-I em todos os animais incluídos

na pesquisa. Foi utilizado o kit Rat/Mouse IGF-I ELISA, produzido pelo Laboratório

IDS – Immunodiagnostic systems para determinação quantitativa de IGF-I em soro

de ratos ou camundongos, através de ensaio imunoenzimométrico (IEMA).

Neste procedimento, as amostras foram incubadas brevemente com o

reagente para inativar as proteínas de ligação ao IGF-I e obter a diluição

adequada para o ensaio. O anticorpo monoclonal purificado anti-IGF-I de ratos

encontra-se revestindo a superfície interna de poliestireno das cubetas da placa

de titulação (fase sólida ou anticorpo de captura). Diluições das amostras foram

então incubadas, juntamente com anticorpo policlonal biotinilado de coelho anti

IGF-I de ratos, nas cubetas revestidas com o anticorpo e movimentadas por duas

horas à temperatura ambiente. As cubetas foram então lavadas e a enzima

peroxidase, obtida de raiz-forte marcada com avidina, foi adicionada, ligando-se

ao complexo de biotina. Após lavagem adicional, um componente substrato

cromogênico simples (formulação de tetrametil-benzidina) foi adicionado para

promover coloração. A absorbância da reação foi avaliada através de leitura da

placa de microtitulação, sendo a intensidade da coloração desenvolvida

diretamente proporcional à quantidade de IGF-I de ratos presente na amostra. A

concentração sérica de IGF-I foi expressa em ng/mL.

32

3.8

Critérios de exclusão

Foram considerados critérios de exclusão:

- Estado clínico debilitado e indicativo de possíveis interferências e/ou

distorções nas avaliações a serem realizadas posteriormente (desenvolvimento

geral, níveis séricos e amostras de tecidos);

- Mutilação entre os animais por comportamento agressivo.

Três animais, pertencentes ao grupo 4, vieram a óbito antes do término do

período de experimentação, sem causa determinada pela necrópsia e exame

anátomo-patológico e, consequentemente, seus dados não foram incluídos no

estudo.

3.9

Análise estatística

Os resultados estatísticos descritivos foram aplicados na construção de

gráficos representando a média ± desvio padrão para cada grupo, utilizando-se o

sinal asterístico (*) para designar ocorrência diferença estatística significante.

O teste estatístico utilizado na comparação dos resultados entre os grupos

consistiu de análise de variância (ANOVA), seguida de análise post-hoc de

Bonferroni, (SAS Software Institute Inc.). As diferenças foram consideradas

significantes para um valor de p < 0.05.

33

4. RESULTADOS

34

4

RESULTADOS

4.1

Avaliação do peso corpóreo e comprimento femoral

Os dois primeiros grupos foram utilizados inicialmente na avaliação da

linhagem de ratos dwarf como modelo animal para o estudo dos efeitos da

deficiência do eixo GH/IGF-I sobre o esqueleto. Diferenças fenotípicas evidentes

puderam ser observadas entre as duas linhagens de ratos, Lewis e dwarf, já no

período de aclimatação. Os animais da linhagem Lewis exibiram tamanho e peso

corpóreo superiores do que os da linhagem dwarf (Figuras 1 e 2).

Por ocasião da eutanásia, ao se comparar os animais dos grupos 1 e 2,

ambos submetidos a tratamento placebo, pode-se observar que o peso corpóreo

médio dos ratos Lewis era 52,9 % maior que dos ratos dwarf (187,6 ± 10,9 g vs.

122,7 ± 5,6 g, p<0,0001) e o comprimento dos fêmures esquerdos mostrou-se

14,8 % mais longo (31,32 ± 0.42 mm vs. 27.28 ± 0.32 mm).

No entanto, ao se comparar os valores dos animais pertencentes aos

grupos 3 e 4, observa-se que o tratamento com PTH não afetou de forma

significativa o peso corpóreo dos animais, independentemente da linhagem, Lewis

ou dwarf, como pode ser observado no gráfico a seguir (gráfico 1).

index-46_1.jpg

index-46_2.jpg

35

Fig. 1 Ratas das linhagens Lewis (à dir.) e dwarf (à

esq.) durante avaliação semanal do peso corpóreo.

Fig. 2

Animal da

linhagem

dwarf (à

dir.), com

desenvolvi

mento

inferior ao

da

linhagem

Lewis (à

esq.)

36

Gráfico 1 - Peso corpóreo. Diferença significativa entre ratos Lewis e dwarf (p <

0,0001), conforme já observado, mas não entre os animais que receberam

tratamento placebo (VEH) e PTH, tanto na linhagem Lewis como dwarf.

Peso corpóreo (g)

250.00

200.00

150.00

g 100.00

50.00

0.00

Lewis VEH

Lewis PTH

Dwarf VEH

Dwarf PTH

4.2 Tomografia óssea quantitativa periférica computadorizada (pQCT)

Em relação aos grupos 1 e 2, as análises realizadas através de pQCT nas

metáfises femorais distais (Fig. 3) revelaram que os mais importantes parâmetros

estruturais do tecido ósseo trabecular eram significantemente inferiores nos ratos

dwarf quando comparados aos ratos Lewis. O conteúdo mineral ósseo total (total

BMC), a densidade óssea total (total BMD), o conteúdo mineral ósseo trabecular

(trabecular BMC) e a densidade mineral óssea trabecular (trabecular BMD)

apresentaram diferença significativa, com p < 0,0001.

37

Considerando-se os mesmos parâmetros estruturais do tecido ósseo

trabecular na avaliação dos grupos 3 e 4, os resultados obtidos nos animais

submetidos ao tratamento com PTH foram superiores aos observados nos grupos

não tratados, tanto para a linhagem dwarf como para a linhagem Lewis,

apresentando diferença significativa com valor de p < 0,0001 ( gráficos 2 a 7). Na

análise post-hoc, os valores da densidade trabecular apresentaram interação entre

grupo e tratamento, sendo que os animais da linhagem dwarf submetidos ao

tratamento com PTH apresentaram um ganho maior do que o observado nos

animais da linhagem Lewis tratados com PTH.

Gráfico 2

Conteúdo mineral ósseo total - Total BMC

(mg/mm)

14

12

10

m 8

/m 6

gm 4

2

0

Lewis VEH Lewis PTH

Dwarf VEH Dwarf PTH

38

Gráfico 3

Densidade mineral óssea total - BMD (mg/cm3)

900

800

*

700

*

600

3

500

/cm 400

gm 300

200

100