Análise do perfil de expressão gênica de sarcomas de partes moles de extremidades de adultos... por Samuel Aguiar Junior - Versão HTML

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Samuel Aguiar Junior

Análise do perfil de expressão gênica de sarcomas

de partes moles de extremidades de adultos

submetidos a quimioterapia neoadjuvante com

doxorrubicina e ifosfamida

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Ademar Lopes

SÃO PAULO

2007

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Para Tiago e Isabela, sempre.

AGRADECIMENTOS

A D’us, acima de todas as coisas.

Aos meus pais e minha irmã, por terem me acompanhado durante toda a vida, incondicionalmente.

A minha esposa, Amanda, pelo apoio e compreensão presentes tanto nos momentos de felicidade como nos de turbulência.

Ao Prof. Ademar Lopes, pela orientação contínua desde a residência médica até conclusão desta tese.

À Dra. Isabela Werneck, pela realização e revisão de todos os exames anatomopatológicos e separação de todas as amostras.

Aos membros do Laboratório de Biologia Molecular do Hospital A.C.

Camargo, com atenção especial às Dras. Waleska Kerllen Martins, Sara Marques e Mariana Maschietto, cujo esforço e competência durante a fase de extração de RNA, amplificação e hibridização das amostras permitiu a realização desse estudo, e à Dra. Dirce Maria Carraro, pelas importantes orientações na fase de interpretação dos dados.

Aos Drs. Alex Fiorini de Carvalho e Luiz Fernando Lima Reis, por permitirem o uso da plataforma de “array”.

Ao grupo do laboratório de Bioinformática, em especial à Dra. Helena Brentani e ao César Torres pela realização das análises matemáticas e pela paciência em explicá-las.

Aos amigos do Departamento de Cirurgia Pélvica, Benedito Mauro Rossi, Wilson Toshihiko Nakagawa, Fábio de Oliveira Ferreira e Érika Monteiro, não só pela contribuição direta na condução da parte clínica do estudo, mas pelo imprescindível suporte paralelo nas atividades assistenciais.

“Sete coisas distinguem o sábio do ignorante: o sábio não fala em presença de quem o ultrapasse em ciência ou em idade; nunca interrompe quem fala; não responde com precipitação; interroga com método e responde com precisão; discute as questões segundo a ordem em que foram colocadas; quando não compreende, confessa com franqueza; e curva-se diante da verdade. O ignorante faz precisamente o contrário.”

Tratado da Ética dos Pais. Capítulo 5. Mishná 9.

Sumário

Resumo

Summary

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1

1.1- Evolução do tratamento dos sarcomas de partes moles em adultos: revisão da literatura....................................................................................................................... 1

1.2- Radioquimioterapia neoadjuvante: experiência do Hospital A.C. Camargo, São Paulo, Brasil................................................................................................................10

1.3- Fatores prognósticos e preditivos de resposta em sarcomas de partes moles de adultos.........................................................................................................................17

2 OBJETIVOS............................................................................................................23

3 MÉTODOS........................................................................................................... ..24

3.1- Tipo de estudo.....................................................................................................24

3.2- Seleção de pacientes............................................................................................24

3.2.1- Critérios de inclusão.........................................................................................24

3.2.1- Critérios de exclusão........................................................................................25

3.3- Termos de Consentimento Livre e Esclarecido..................................................26

3.4- Diagnóstico, avaliação inicial e estadiamento....................................................26

3.4.1- Coleta de material e diagnóstico anatomopatológico......................................26

3.4.2- Estadiamento....................................................................................................27

3.5- Plano terapêutico.................................................................................................27

3.5.1- Quimioterapia pré-operatória................................................................... .......28

3.5.2- Cirurgia........................................................................ ....................................28

3.5.3- Radioterapia pós-operatória.............................................................................29

3.6- Monitoração da toxicidade e avaliações periódicas durante a quimioterapia.....30

3.7- Avaliação da resposta clínica..............................................................................31

3.8- Avaliação da resposta anatomopatológica...................................................... ....32

3.9- Variáveis coletadas..............................................................................................33

3.10- Validação histopatológica das amostras............................................................36

3.11- Extração do RNA total......................................................................................36

3.12- Amplificação do RNA mensageiro e preparação das sondas............................37

3.13- RNA referência..................................................................................................38

3.14- Marcação indireta das sondas............................................................................39

3.15- Hibridização e digitalização das imagens..........................................................39

3.16- Análise estatística..............................................................................................40

3.17- Financiamento...................................................................................................42

4 RESULTADOS......................................................................................................43

4.1- Dados demográficos e clínicos............................................................................43

4.2- Dados do diagnóstico anatomopatológico e do estadiamento.............................45

4.3- Dados do tratamento pré-operatório....................................................................47

4.3.1- Adesão ao protocolo.........................................................................................47

4.3.2- Toxicidade........................................................................................................48

4.3.3- Resposta clínica à quimioterapia......................................................................49

4.4- Dados referentes à cirurgia..................................................................................51

4.5- Dados anatomopatológicos das peças operatórias...............................................51

4.6- Dados do seguimento...........................................................................................53

4.7- Análise da expressão gênica................................................................................56

4.7.1- Extração,amplificação, hibridização e normalização das

amostras......................................................................................................................56

4.7.2- Análise dos dados.............................................................................................58

5 DISCUSSÃO..........................................................................................................64

6 CONCLUSÕES.................................................................................... .................83

7 ANEXOS.................................................................................................................85

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................120

RESUMO

Aguiar Junior S. Análise do perfil de expressão gênica de sarcomas de partes moles de extremidades de adultos submetidos a quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007. 134p.

INTRODUÇÃO: A cirurgia associada à radioterapia proporciona altas taxas de preservação de membros e de controle local em sarcomas de partes moles de extremidade de adultos, mas ainda apresenta elevadas taxas de complicações locais e de metástases à distância. O valor da quimioterapia adjuvante ou neoadjuvante ainda é controverso e objeto de investigações clínicas. A identificação de fatores moleculares preditivos de resposta à quimioterapia pode selecionar pacientes que se beneficiem ou não da sua aplicação. OBJETIVOS: identificar perfis de expressão gênica capazes de diferenciar tumores respondedores e não respondedores a quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. Analisar os resultados preliminares relativos à efetividade de um esquema de quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. MÉTODOS: amostras foram coletadas a partir de um ensaio clínico fase II não controlado que testa um esquema de quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida em sarcomas de alto grau histológico, localizados em extremidades de pacientes adultos. O perfil de expressão gênica foi determinado pela análise de cDNA “microarrays”. RESULTADOS: 14 pacientes foram incluídos no estudo clínico e 6 amostras foram utilizadas para análise molecular. 222 seqüências diferentemente expressas entre respondedores e não respondedores foram identificadas. Entre os genes com maior diferença de expressão, foram observados genes envolvidos com via de sinalização de TGFβ, genes envolvidos com angiogênese, com degradação de matriz extracelular e com desenvolvimento. A taxa de resposta objetiva à quimioterapia neoadjuvante foi de 28,6%, a taxa de amputação foi de 7,1% e taxa de complicações relacionadas à ferida operatória foi de 23%. Complicações graus 3 e 4 ocorreram em 50% dos pacientes e nenhum deles faleceu ou teve a proposta cirúrgica suspensa em decorrência de complicações da quimioterapia. CONCLUSÕES: tumores respondedores a quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida apresentaram um perfil de expressão gênica diferente dos não respondedores, particularmente em genes envolvidos na via de sinalização de TGFβ. O esquema terapêutico testado mostrou-se efetivo e seguro para ser investigado em um estudo fase III.

Descritores: 1.Sarcoma/cirurgia 2.Expressão gênica 3.Análise de seqüência com séries de oligonucleotídeos 4.Quimioterapia 5.Quimioterapia adjuvante 6.Fator transformador de crescimento beta 1 7.Radioterapia

SUMMARY

Aguiar Junior S. Gene expression profile of adult extremity soft tissue sarcomas submitted to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin and ifosphamide [thesis].

São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2007. 134p.

INTRODUCTION: Surgery combined with adjuvant radiotherapy provides high rates of limb sparing and local control for adult extremity soft tissue sarcomas, but is still associated with high rates of local morbidity and distant recurrences. The role of adjuvant or neoadjuvant chemotherapy is still controversy and target of clinical investigations. The identification of molecular predictive factors of response to chemotherapy could select patients who have benefits or not with its use.

OBJECTIVES: to identify gene expression profiles that discriminate tumors with respect to response to neoadjuvant chemotherapy. Analyze the preliminary results of a protocol of neoadjuvant chemotherapy in soft tissue sarcomas. METHODS: samples were collected from subjects of a single-arm prospective clinical trial that investigates the effectiveness of a neoadjuvant doxorubicin and ifosphamide-based chemotherapy regimen in high grade extremity soft tissue sarcomas in adults. Gene expression profiles were determined by the analysis of cDNA microarrays.

RESULTS: 14 patients were included in the clinical trial and six samples were used in the molecular study. 222 sequences differentially expressed between responders and non responders were identified. Among the genes with higher differences in expression, we have identified genes involved with TGFβ signaling pathway, angiogenesis, extracelular matrix degradation and development. The objective response rate to neoadjuvant chemotherapy was 28,6%, the amputation rate was 7,1%, and the wound complication rate was 23%. Grades 3 and 4 complications have occurred in 50 % of the cases, but no deaths or modifications on surgical intent related to chemotherapy complications have occurred. CONCLUSIONS: tumors considered responders to neoadjuvant chemotherapy showed a gene expression profile significantly different from non responders, especially with respect to the TGFβ signaling pathway. The neoadjuvant regimen tested has showed to be effective and safe to be considering for a phase III clinical trial.

1

1 - INTRODUÇÃO

1.1 - EVOLUÇÃO DO TRATAMENTO DOS SARCOMAS DE PARTES

MOLES EM ADULTOS: REVISÃO DA LITERATURA.

Os sarcomas de partes moles são neoplasias raras. Nos Estados Unidos, a estimativa para 2007 é de 9.220 casos novos e cerca de 3.560 óbitos.1 No Brasil, as estimativas de incidência e mortalidade para sarcomas de partes moles de adultos não são relatadas nas fontes do Ministério da Saúde.

Esses tumores podem se originar em qualquer tecido de origem mesenquimal.

Localizam-se nas extremidades em aproximadamente 50% dos casos, no tronco e retroperitônio em cerca de 30% a 40% e, mais raramente, em cabeça e pescoço (10%).2

A cirurgia tem um papel central no tratamento dos sarcomas de partes moles de extremidades do adulto. A ressecção ampla com margem de 2,0 cm de tecido normal ao redor do tumor é a estratégia primária de tratamento. 3,4 A ressecção ampla tridimensional é o tratamento exclusivo para casos selecionados em que é possível a obtenção de margens amplas, livres e adequadas, em tumores de baixo grau histológico.5,6

A proximidade das lesões com estruturas vásculo-nervosas dos membros determinou altas taxas de amputações durante várias décadas para se obter margens adequadas. Apesar da radicalidade, grande parte dos pacientes morria em decorrência de recaída em órgãos à distância, particularmente pulmonar. A partir da década de 80, resultados publicados de instituições que realizaram cirurgias conservadoras 2

associadas à radioterapia adjuvante demonstraram boas taxas de controle local, entre 78% e 91%, e sem mudanças nas taxas de sobrevida global.7,8 Dois estudos prospectivos e randomizados validaram esses resultados.9,10 Atualmente, as amputações e desarticulações são realizadas em apenas 5% a 10% de todos os casos.4

A modalidade (radioterapia externa ou braquiterapia) e o momento (pré ou pós-operatória) da radioterapia ainda são motivos de discussão. A abordagem inicial com cirurgia oferece a vantagem de avaliação anatomopatológica mais adequada e está associada a menores índices de complicações da ferida operatória. No entanto, tem por desvantagem considerável a maior dificuldade para realização de ressecção completa, ainda que marginal, com risco de ruptura do tumor e contaminação do leito operatório. Algumas vantagens são apontadas a favor da radioterapia pré-operatória: 1) a melhor oxigenação de tecidos sem manipulação cirúrgica prévia, o que pode aumentar o efeito citotóxico da radioterapia; 2) o campo de irradiação é menor quando o planejamento é pré-operatório; 3) ao diminuir volume tumoral, a radioterapia pré-operatória parece tornar a cirurgia tecnicamente mais factível quando não é possível a obtenção de margens tridimensionais adequadas.3,11

As desvantagens da radioterapia neoadjuvante se relacionam principalmente às altas taxas de complicações relacionadas à ferida operatória.12,13 Um estudo canadense prospectivo e randomizado comparou radioterapia pré e pós-operatória em sarcomas de membros, onde o objetivo primário foi comparar as taxas de complicações sobre ferida operatória entre os dois grupos. Noventa e quatro pacientes foram randomizados para receber radioterapia neoadjuvante e 96, para receber radioterapia pós-operatória. Complicações em ferida operatória foram observadas em 35% dos pacientes tratados antes da cirurgia e em 17% dos pacientes 3

que receberam radioterapia pós-operatória (diferença de 18%; com intervalo de confiança de 95% (IC 95%) entre 5 – 30; p=0,01). Nesse estudo, embora a análise de sobrevida não tiver sido o objetivo principal e o tempo de seguimento mediano ter sido relativamente curto (3,3 anos), a sobrevida global foi discretamente melhor para o braço que recebeu radioterapia pré-operatória (p= 0,048).13

Apesar dos avanços obtidos com relação ao controle local da doença e à preservação de membros, a sobrevida global não experimentou melhoras significativas nas últimas décadas e as taxas de recaída pulmonar e óbito têm permanecido praticamente inalteradas. Esse cenário é muito bem representado em um estudo realizado pelo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.14 Naquela instituição, 1706 pacientes portadores de sarcomas de partes moles de extremidades foram tratados entre janeiro de 1982 e dezembro de 2001 e seguidos prospectivamente. A sobrevida específica por câncer foi analisada por períodos de tratamento (1982 a 1986; 1986 a 1991; 1992 a 1996; 1996 a 2001) e se manteve sem diferenças significativas no decorrer dos anos, mesmo no subgrupo de pacientes de alto risco (alto grau, tumor maior que 10 cm e profundo). As taxas de sobrevida também se mantiveram inalteradas em função dos fatores prognósticos já estabelecidos (tamanho e profundidade do tumor, grau histológico, margens microscópicas, idade e status à apresentação (primário ou recidivado), analisados por período de tratamento, indicando que o que determina a sobrevida ainda são fatores prognósticos relacionados principalmente à neoplasia e não a avanços terapêuticos.

Diminuição das taxas de metástases a distância, particularmente pulmonar, e conseqüente aumento de sobrevida deveriam ser obtidos através de tratamento sistêmico adjuvante. Até o momento, três drogas, a doxorrubicina, a dacarbazina e a 4

ifosfamida, demonstraram taxas de resposta maiores que 20% em doença metastática. 4 Em doença localizada, o uso de quimioterapia adjuvante em sarcomas de partes moles tem sido analisado tanto em estudos prospectivos e controlados como em meta-análise e revisões sistemáticas e permanece bastante controverso. 6, 15,16 Uma meta-análise que analisou 1.568 pacientes provenientes de 14 ensaios clínicos randomizados que utilizaram esquemas de quimioterapia adjuvante baseados em doxorubicina demonstrou benefício de 7% de sobrevida em 10 anos a favor dos braços tratados com quimioterapia, mas apenas no subgrupo de pacientes com sarcomas localizados em extremidades.17 Os resultados dessa meta-análise geraram interpretações diferentes, onde alguns autores passaram a recomendar fortemente o emprego de quimioterapia pós-operatória em pacientes portadores de tumores de alto risco (alto grau, profundos e maiores que 5 cm); enquanto outros, considerando falhas na seleção dos estudos, não recomendam quimioterapia adjuvante para sarcomas fora de protocolos de investigação.18,19

Um estudo prospectivo e randomizado italiano posterior à meta-análise citada se propôs a comparar o emprego de quimioterapia adjuvante baseado em cinco ciclos da combinação de doxorrubicina (60 mg/m2 nos dias 1 e 2, totalizando 120 mg/m2

por ciclo) e ifosfamida (1,8 g/m2, nos dias 1 a 5, totalizando 9 g/m2 por ciclo) com um grupo controle, selecionando apenas pacientes com tumores de alto grau histológico e de extremidade. Cento e quatro pacientes foram recrutados e, após seguimento de 59 meses, a sobrevida global mediana foi de 75 meses para o grupo tratado contra 46 meses para o grupo controle (p=0,03). O benefício absoluto com emprego de quimioterapia adjuvante com o esquema utilizado foi de 13% em dois anos e aumentou para 19% em quatro anos (p=0,04).20

5

Apesar de bem desenhado, o estudo italiano recebeu críticas importantes referentes a algumas diferenças de características relacionadas ao tumor entre os dois grupos e principalmente ao fato da taxa de recaída pulmonar em quatro anos ter sido praticamente igual entre os dois braços, apesar da diferença significativa de sobrevida global. 21

Um outro estudo analisou conjuntamente uma coorte de 674 pacientes portadores de sarcomas de partes moles de extremidades de alto risco e não metastáticos, tratados em dois grandes centros de referência norte-americanos, com objetivo de avaliar o efeito da quimioterapia adjuvante, a partir de informações provenientes de bancos de dados prospectivos e retrospectivos dessas duas instituições. 22 A metade dos pacientes foi tratada apenas com tratamento local, enquanto a outra metade recebeu algum esquema de quimioterapia adjuvante. Os autores observaram diferença significativa de sobrevida específica para câncer após um ano de tratamento a favor da quimioterapia (razão acidental de 0,37, com IC95%

entre 0,20 e 0,69), porém, após cinco anos de tratamento não se observou mais benefício com tratamento adjuvante.

Um outro estudo randomizado (EORTC 62931) recrutou 351 pacientes para receber quimioterapia pós-operatória com doxorrubicina e ifosfamida ou observação, mas ainda não publicou seus resultados. Diante da casuística expressiva, talvez os resultados desse estudo sejam determinantes para confirmar ou não o benefício da quimioterapia adjuvante em sarcomas de partes moles. 23

Mesmo que ainda controvertido, se de fato houver benefício com emprego de quimioterapia sistêmica adjuvante, esta deve ser iniciada precocemente. As elevadas taxas de complicações relacionadas ao sítio cirúrgico atribuídas ao efeito 6

radioterápico pré-operatório se apresentam freqüentemente como fator limitante para o início do tratamento sistêmico pós-operatório.

Vários protocolos têm empregado a quimioterapia concomitantemente à radioterapia de forma neoadjuvante. Muitos deles utilizam a doxorrubicina concomitante à radioterapia com finalidade de aumentar a sensibilidade. Revisões não sistemáticas apontam para taxas de controle locorregional atribuídas à radioterapia e quimioterapia concomitantes (radioquimioterapia) pré-operatórias superiores aos resultados históricos de radioterapia adjuvante isolada, mas também com elevadas taxas de complicações pós-operatórias, oscilando entre 26% e 30%. 12, 24, 25

Um ensaio clínico não randomizado conduzido por uma única instituição norte-americana adotou um esquema com combinação de adriamicina (20 mg/m2), ifosfamida (2,0 g/m2) e dacarbazina (250 mg/m2) (MAID) em três ciclos pré-

operatórios concomitantes a radioterapia, seguidos por cirurgia, em 48 pacientes consecutivos portadores de sarcomas de alto grau de extremidades maiores que 8 cm.

26 O esquema previa mais três ciclos de quimioterapia pós-operatória. Utilizando os critérios do RECIST 27 para avaliação de resposta, os autores encontraram resposta parcial em 10,6% dos pacientes e nenhuma resposta completa foi observada aos exames de imagem. 12,8% dos pacientes apresentaram progressão à avaliação radiológica. À avaliação anatomopatológica, necrose maior de 99% foi observada em 14 pacientes. Apenas dois pacientes apresentaram peças com necrose menor que 50% e dos seis pacientes que haviam apresentado progressão radiológica, todos apresentavam necrose maior que 50% nas peças cirúrgicas.26

7

Os resultados desse estudo estimularam a realização de um ensaio clínico multi-institucional (Radiation Therapy Oncology Group – RTOG 9514) fase II com objetivo de validar a efetividade do mesmo esquema. Os resultados desse estudo foram publicados recentemente. 28 Foram tratados 64 pacientes portadores de sarcomas de alto grau ou maiores que 8 cm, localizados em extremidade ou tronco.

Os investigadores observaram toxicidade fatal em 5% dos pacientes e toxicidade grau 4 em 84%, a maioria de natureza hematológica. Sessenta e um pacientes foram operados, dentre os quais 5 sofreram amputação (7,8%). As taxas estimadas em três anos para sobrevida livre de doença, sobrevida livre de metástases e sobrevida global foram, respectivamente, 56,6%, 64,5% e 75,1%. Apesar do otimismo dos investigadores, esses resultados foram severamente criticados, particularmente em relação às elevadas taxas de complicações. 29

Consideramos que o plano terapêutico ideal para os sarcomas de partes moles de extremidades deva respeitar dois enfoques principais: 1) altas taxas de controle locorregional com cirurgia preservadora de membros, com baixos índices de complicações da ferida operatória; 2) tratamento de micrometástases pulmonares subclínicas ao diagnóstico.

Alguns trabalhos baseados nos princípios acima citados trouxeram informações adicionais que, face aos problemas abordados, questionam a real necessidade da radioterapia neoadjuvante. O papel da radioterapia está voltado para o controle local, mas não tem influência sobre o controle da doença micrometastática. Já a quimioterapia tem efeito tanto local como sistêmico. Se os índices de resposta com utilização exclusiva de quimioterapia neoadjuvante se mostrarem significativos, poderíamos suprimir a radioterapia da fase inicial do tratamento e minimizar as 8

complicações, sem perder a possibilidade de uso da radioterapia como modalidade adjuvante. Esta abordagem teria a vantagem de permitir o uso de esquemas combinados de quimioterapia em doses mais altas, pouco toleradas quando concomitantes à radioterapia, com vistas a diminuir o risco de recaída pulmonar já nas fases iniciais do plano terapêutico.

Em 1985 o Washington Cancer Institute iniciou uma série de estudos com quimioterapia de indução em pacientes adultos portadores de sarcomas de partes moles, administradas por via endovenosa ou intra-arterial. Inicialmente, o objetivo era de evitar amputações em pacientes portadores de extensas lesões em locais de difícil abordagem cirúrgica. Posteriormente, os trabalhos procuraram avaliar as taxas de resposta clínica, o grau de necrose conseguido com a quimioterapia e o prognóstico dos pacientes portadores de sarcomas de partes moles de extremidades de alto risco.30 A análise detalhada da publicação de Henshaw et al nos mostra altos índices de preservação de membros, com elevadas as taxas de controle local, sobrevida global e sobrevida livre de doença em pacientes portadores de sarcomas de partes moles de alto grau de extremidades, não passíveis de ressecção com margem adequada na avaliação inicial, tratados com quimioterapia de indução (endovenosa e intra-arterial), seguida de cirurgia e quimioterapia adjuvante, porém sem utilização de radioterapia em qualquer das fases de tratamento. Apesar do pequeno número de pacientes da amostra analisada (n=33), os resultados são animadores quanto à eficácia do uso de quimioterapia neoadjuvante. No entanto, devemos lembrar que 12

pacientes dos 46 não foram analisados porque precisaram receber radioterapia pós-operatória, cuja indicação se fez com base no alto risco de recidiva local em função de margens cirúrgicas exíguas, cirurgia prévia fora de padrões oncológicos 9

(contaminação do leito operatório) ou resposta insatisfatória à quimioterapia de indução.

Mais recentemente, um estudo multicêntrico fase II randomizado testou um esquema de quimioterapia sistêmica neoadjuvante empregando três ciclos de uma combinação de adriamicina (50 mg/m2 no dia 1), seguida por 24 horas de infusão contínua de ifosfamida (5 g/m2), comparando com cirurgia isolada. O desenho do estudo previa a inclusão de pacientes portadores de sarcomas não metastáticos de membros, cabeça e pescoço, tronco ou pélvis, considerados de alto risco, definidos como tumores maiores que 8 cm (qualquer grau histológico); ou tumores grau II ou III (qualquer tamanho); ou tumores graus II ou III recidivados ou operados de forma inadequada. Foram considerados elegíveis 134 pacientes, sendo 67 em cada braço.

Pacientes com margens consideradas inadequadas receberam radioterapia pós-operatória. 87% dos pacientes randomizados para receber quimioterapia completaram os 3 ciclos previstos no protocolo. Toxicidade hematológica severa ocorreu em 8% dos casos, resultando em um óbito. Resposta clínico-radiológica objetiva foi observada em 29% dos casos, sendo completa em 8%. Não foi descrita avaliação da resposta anatomopatológica no estudo. Não houve diferença nas taxas de complicações pós-operatórias entre os dois braços e o tratamento neoadjuvante não comprometeu a realização dos outras modalidades de tratamento subseqüentes (cirurgia e radioterapia). Em função da dificuldade e demora no recrutamento de pacientes, os investigadores não estenderam o estudo para fase III. 31 Esses resultados validam algumas das conclusões provenientes dos dados retrospectivos de Henshaw et al, no sentido de demonstrar que é possível obter-se, com quimioterapia 10

exclusiva, taxas de resposta local semelhantes às obtidas com radioterapia pré-

operatória, sem comprometimento do planejamento cirúrgico.

1.2 - RADIOQUIMIOTERAPIA NEOADJUVANTE: EXPERIÊNCIA DO

HOSPITAL A.C. CAMARGO, SÃO PAULO, BRASIL.

A partir de 1995, os Departamentos de Cirurgia Pélvica, Radioterapia e Oncologia Clínica do Hospital A.C. Camargo organizaram diretrizes para padronizar o tratamento dos sarcomas de partes moles em extremidades de adultos naquela instituição. Essas diretrizes podem ser resumidas no seguinte fluxograma.

Figura 1 – Fluxograma para tratamento de sarcomas de partes moles de extremidades de adultos, sem radioterapia ou quimioterapia prévia, do Hospital do Câncer A.C.

Camargo.

DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO E ESTADIAMENTO

TC DE TÓRAX + TC OU RNM DO LOCAL

COM DIAGNÓSTICO PRÉVIO: REVISÃO DE LÂMINAS

SEM DIAGNÓSTICO PRÉVIO: BIÓPSIA INCISIONAL OU COM AGULHA GROSSA AVALIAÇÃO DA RESSECABILIDADE:

É PASSÍVEL DE RESSECÇÃO COM MARGEM TRIDIMENSIONAL DE 2,0 CM?

SIM

NÃO

CIRURGIA

RxT E QT NEOADJUVANTES

BAIXO GRAU

ALTO GRAU

CIRURGIA

CONSIDERAR BRAQUITERAPIA

QT ADJUVANTE SE:

BAIXO GRAU

ALTO GRAU

TUMOR PROFUNDO OU MAIOR QUE 5 CM

IDADE MENOR QUE 50 ANOS

QT ADJUVANTE SE

IDADE MENOR QUE 50 ANOS

SEGUIMENTO

SEGUIMENTO

SEGUIMENTO

SEGUIMENTO

Legenda: TC – tomografia computadorizada; RNM – ressonância nuclear magnética; RxT – radioterapia; QT – quimioterapia

11

Segundo a rotina estabelecida, o que determina a indicação de tratamento pré-

operatório é a avaliação da ressecabilidade determinada por um dos cirurgiões do Departamento de Cirurgia Pélvica, a partir de dados do exame físico e do exame de imagem (tomografia ou ressonância).

Para os pacientes portadores de doença metastática à apresentação, cujas metástases não são passíveis de ressecção, prioriza-se o tratamento sistêmico, deixando-se a indicação de tratamento local (cirurgia e/ou radioterapia) na dependência da sintomatologia e do tempo de progressão local e à distância.

Os pacientes portadores de doença metastática à apresentação, com metástases ressecáveis, são tratados com intenção curativa e seguem o protocolo de radioquimioterapia pré-operatória, seguida de ressecção do tumor primário e ressecção das metástases. Nesses casos, considera-se quimioterapia adjuvante após a ressecção das metástases.

Pacientes admitidos com antecedente de radioterapia e/ou quimioterapia em outra instituição não entram no fluxograma descrito e têm sua estratégia de tratamento individualizada, de acordo com as modalidades terapêuticas previamente utilizadas.

Observa-se que indicamos tratamento neoadjuvante mesmo para tumores de baixo grau histológico, se as dimensões e a localização da lesão não permitirem ressecção com margens tridimensionais adequadas.

A radioterapia pré-operatória é realizada através de teleterapia com dose total de 30 Gy, com fracionamento de 250 cGy ao dia, 5 vezes por semana (12 sessões).

Para quimioterapia concomitante, emprega-se adriamicina na dose de 20 mg/m2

nos dias 1, 8 e 15, totalizando 60 mg/m2.

12

A cirurgia é realizada dentro de 4 a 6 semanas após o término da radioterapia.

Entre janeiro de 1995 e dezembro de 2004, 240 pacientes foram admitidos no Hospital A.C. Camargo com diagnóstico de sarcoma de partes moles de membros, incluindo localização em cintura pélvica e escapular. A partir dessa amostra total, identificamos 49 pacientes com tumores localmente avançados e sem antecedente de radioterapia ou quimioterapia prévia, que foram tratados de acordo com o protocolo institucional de radioquimioterapia neoadjuvante. As tabelas 1, 2 e 3 expõem as características clínico-patológicas dessa amostra.

Tabela 1 - Características clínicas de uma amostra de 49 pacientes tratados no Hospital do Câncer A.C. Camargo através de radioquimioterapia pré-

operatória

Variável

n

(%)

Idade mediana (anos)

48 (16 – 72)

Gênero masculino

20

(40,8%)

feminino

29

(59,2%)

Topografia

membro inferior

36 (73,5%)

membro superior

7 (14,3%)

cintura pélvica

4 (8,2%)

cintura escapular

2 (4,1%)

Tamanho mediano (cm)

15 (5 – 40)

Manipulação prévia

biópsia incisional

22 (44,9%)

intacto

12

(24,5%)

ressecção recente*

8 (16,3%)

recidivado**

6

(12,2%)

* Consideramos ressecção recente o antecedente de cirurgia para ressecção em outra instituição até três meses antes da admissão. ** Consideramos tumor 13

recidivado quando havia história de um ou mais procedimentos de ressecção com mais de três meses de antecedência em relação à data da admissão.

Tabela 2 - Características anatomopatológicas pré-tratamento de uma amostra de 49

pacientes tratados no Hospital do Câncer A.C. Camargo através de radioquimioterapia pré-operatória

Variável

n

(%)

Tipo histológico

sarcoma sinovial

10 (20,4%)

lipossarcoma

9

(18,4%)

histogênese indeterminada

5 (10,2%)

leiomiossarcoma 5

(10,2%)

FHM

5

(10,2%)

sarcoma pleomórfico

4 (8,2%)

sarcoma fusocelular

3 (6,1%)

TMBNP

3

(6,1%)

sarcoma epitelióide

2 (4,1%)

angiossarcoma 1

(2,0%)

rabdomiossarcoma

1

(2,0%)

Grau histológico

I

11 (22,4%)

II

9

(18,4%)

III

28

(57,1%)

indeterminado 1

(2,0%)

FHM: fibrohistiocitoma maligno; TMBNP: tumor maligno da bainha do nervo periférico.

14

Tabela 3 - Distribuição dos pacientes segundo estadiamento AJCC.29

Estádio n

(%)

I 10

(20,4%)

II 5

(10,2%)

III 29

(59,2%)

IVb 5

(10,2%)

Durante o tratamento pré-operatório, houve 3 casos de toxicidade grau 3, todas de natureza hematológica, e não ocorreu nenhum óbito relacionado ao tratamento.

Em função do caráter retrospectivo da análise dessa casuística, a determinação de resposta objetiva ao tratamento pré-operatório tornou-se bastante prejudicada.

Encontramos, nos prontuários médicos, descrição dos diâmetros dos tumores antes e depois da radioterapia, medidos por tomografia ou ressonância, em apenas 10 casos.

Desses, houve resposta parcial em um caso, doença estável em sete e progressão local em dois, segundo os critérios RECIST.23 Apesar de não ser considerado um parâmetro objetivo, houve resposta significativa ao tratamento pré-operatório, de acordo com a descrição do exame físico do cirurgião, em 16 (32,7%) pacientes. Essa resposta clínica, determinada ao exame físico, é descrita como diminuição do tamanho do tumor e/ou melhora da mobilidade da lesão, fatores esses subjetivamente associados à melhor ressecabilidade e à maior chance de preservação do membro.

Dos 49 pacientes que completaram o esquema de radioterapia concomitante a quimioterapia, 43 foram operados. Entre os seis pacientes que não foram operados, três recusaram a cirurgia em função da possibilidade de amputação, dois por progressão sistêmica da doença e um por progressão local. A taxa de amputação 15

entre os 49 pacientes, considerando-se a intenção de tratamento, foi de 14,3% (sete casos).

Entre os 43 pacientes submetidos a cirurgia, 18 (41,8%) evoluíram com complicações severas relacionadas à ferida operatória. Definiu-se complicação severa em ferida operatória quando houve necessidade de debridamento de tecidos desvitalizados. A maioria dessas complicações se associou a longos períodos de tratamento até a resolução.

À avaliação anatomopatológica das peças operatórias, observou-se necrose maior que 95% em 5 (11,6%) espécimes, sendo duas respostas patológicas completas (4,7%).

Dezenove pacientes portadores de tumores de alto grau não-metastáticos à admissão, com menos de 50 anos de idade, seriam elegíveis para receber quimioterapia adjuvante, de acordo com o protocolo institucional. Desses, apenas cinco pacientes receberam quimioterapia pós-operatória. Os outros 14 não foram tratados com quimioterapia em função das complicações relacionadas à ferida operatória.

As taxas de sobrevida livre de recidiva local, sobrevida livre de recaída sistêmica e sobrevida global em cinco anos foram, respectivamente, 81,6%, 52,9% e 58,3%. O tempo de seguimento mediano foi de 32,1 meses, variando de 7,6 a 132,3

meses, e a taxa de perda de seguimento foi de 4,5 %.

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index-29_2.png

index-29_3.png

index-29_4.png

16

A

B

p=0,02

C

D

Figura 2 - Curvas de sobrevida para 49 pacientes portadores de sarcomas de partes moles de extremidades de adultos, tratados por radioquimioterapia seguida de cirurgia, no Hospital A.C. Camargo: A – sobrevida livre de recidiva local; B – sobrevida livre de metástases; C – sobrevida global; D –

sobrevida livre de metástases em função do grau histológico

Os resultados descritos são comparáveis aos publicados por outras instituições, traduzindo-se em boas taxas de controle local, elevadas taxas de complicações pós-operatórias relacionadas à ferida e altas taxas de recaída sistêmica e óbito por câncer, o que nos levou a propor um estudo clínico prospectivo ainda de fase II, com objetivo de testar a efetividade de um esquema de tratamento com quimioterapia pré-

operatória exclusiva, seguida de cirurgia, deixando-se a radioterapia para a fase pós-operatória.

17

1.3 - FATORES PROGNÓSTICOS E PREDITIVOS DE RESPOSTA EM

SARCOMAS DE PARTES MOLES DE ADULTOS

Os principais fatores significativamente associados com recaída e óbito em sarcomas de partes moles são o grau histológico; o tamanho do tumor; a profundidade do tumor em relação à fáscia muscular e presença ou não de metástases linfonodais e hematogênicas.4 Esses fatores foram identificados como variáveis independentes nas análises multivariadas de grandes estudos de coorte e são utilizados na última versão do sistema de estadiamento TNM. 32-36

Atualmente, o grau histológico é considerado o fator prognóstico mais importante em sarcomas de partes moles e também é utilizado como fator preditivo de resposta às terapêuticas citotóxicas, prevendo-se melhores taxas de resposta em tumores de alto grau.4 Porém, não é incomum observarmos, na prática clínica, boas taxas de necrose induzida por radio e quimioterapia em alguns sarcomas de partes moles de baixo grau, assim como resultados frustrantes em outros tumores de alto grau, concluindo-se que o valor preditivo do grau histológico para radio ou quimiossensibilidade ainda não pode ser considerado ótimo.

Nas últimas décadas, temos observado grande entusiasmo com os avanços na oncologia molecular. Os marcadores moleculares têm sido alvo de otimismo com relação a sua capacidade de predizer os desfechos de recaída e óbito (valor prognóstico) ou a resposta à terapêutica (valor preditivo) em diversas neoplasias.

O valor prognóstico de marcadores moleculares em sarcomas de partes moles ainda é muito pouco estudado.

18

A identificação de algumas translocações cromossômicas que determinam a formação de genes de fusão associados a determinados tipos histológicos de sarcomas, como em tumores da família Ewing (gene de fusão EWS-FL11)37,38, em rabdomiossarcomas alveolares (genes de fusão PAX3-FKHR e PAX7-FKHR)39,40 e em sarcomas sinoviais (SYT-SSX1)41, 42, vem estimulando a investigação do valor prognóstico dessas características moleculares. Porém, as tentativas de correlação com recidiva e óbito têm sido inconsistentes, provavelmente em razão do caráter retrospectivo dos estudos e das dificuldades para inferências estatísticas determinadas pela raridade da doença e pela grande heterogeneidade dos tipos histológicos e das modalidades de tratamento.43,44

Como fatores preditivos de resposta, os marcadores moleculares são ainda menos estudados em sarcomas de partes moles de adultos. Destaca-se um estudo que analisou o valor prognóstico e preditivo de alterações em p53 e p16/p14ARF em 60

pacientes portadores de tumores da família Ewing. O valor preditivo de resposta à quimioterapia foi avaliado em um subgrupo de 32 pacientes. A presença de deleções em p16/p14ARF e/ou mutações em p53, determinadas por hibridização in situ por fluorescência (FISH) e imunoistoquímica, respectivamente, correlacionaram-se significativamente com resposta pobre à quimioterapia neoadjuvante (graus 1 e 2 de resposta patológica, pela classificação de Huvos). 45

O desenvolvimento e atual disponibilidade das análises de “microarrays”

trazem novas perspectivas ao estudo da biologia das neoplasias. “Microarrays” são

“chips preparados a partir de uma impressão robótica de milhares de seqüências de DNA sobre um suporte sólido, usados para determinar quantitativamente a expressão concomitante de milhares de genes ou seqüências. 46,47 Enquanto as técnicas mais 19

convencionais de determinação de expressão de genes ou proteínas (imunoistoquímica, FISH, reação em cadeia da polimerase (PCR), seqüenciamento, etc) permitem a análise de um único marcador por experimento, a análise de

“microarray” permite a determinação quantitativa e simultânea da expressão de milhares de genes, caracterizando perfis de expressão gênica. Isto, teoricamente, permite o estudo de vias inteiras de sinalização e das interações entre elas e não mais de um único gene ou proteína individualmente.

Com relação a esse tipo de metodologia empregada em sarcomas de partes moles, os trabalhos até agora publicados também são predominantemente descritivos (tabela 4), onde alguns genes têm sido identificados como expressos diferentemente em tumores em relação ao tecido conjuntivo normal ou em um determinado subtipo histológico em relação a outro. 44-50

20

Tabela 4 - Estudos descritivos que utilizaram de análises de “microarrays” em sarcomas

Autor n

Achados

Nagayama S, et al 48

47

Identificação de duas subclasses de sarcoma

sinovial quanto à diferenciação epitelial

Allander SV, et al 49

37

Genes diferentemente expressos em sarcomas

sinoviais

Fritz B, et al 50

16

Lipossarcomas pleomórficos e desdiferenciados

têm perfis de expressão gênica distintos

Nielsen TO, et al 51

41 Sarcomas sinoviais, GIST e tumores

neurogênicos têm perfis de expressão gênica

distintos

Skibutz KM, et al 52

-

Identificação de genes diferentemente expressos

em leiomiossarcomas

Skibutz KM, et al 53

35

Identificação de diferenças de expressão gênica

entre lipossarcomas, lipomas e tecido adiposo

normal

Baird K, et al 54

181

Descreve perfis de expressão gênica distintos em

vários subtipos histológicos

Nakayama R, et al 55

105

Reclassifica fibrohistiocitomas malignos

O emprego de análise de “microarrays” para identificar fatores prognósticos e fatores preditivos de resposta à quimioterapia tem sido relatado em poucas publicações, predominantemente em tumores ósseos.

Um trabalho israelense, ao analisar 21 amostras de sarcomas de Ewing, identificou dois perfis distintos de expressão gênica em função do prognóstico favorável ou não. Entre os pacientes com pior prognóstico, os tumores apresentavam expressão aumentada de genes envolvidos no ciclo celular e nos mecanismos de invasão e metástases e expressão diferentemente diminuída de genes pró-

apoptóticos.56

21

Um estudo britânico, em uma análise de 27 amostras de leiomiossarcomas, também identificou uma assinatura de expressão gênica que diferenciou significativamente tumores com potencial metastático. O pior prognóstico também esteve associado à expressão aumentada de genes envolvidos com regulação do ciclo celular e com transmissão de sinal. 57

Um grupo sueco analisou a expressão gênica também por “microarray” de 26

amostras de sarcomas sinoviais. Apesar de não ter sido o objetivo principal do trabalho, os autores também identificaram uma assinatura genética associada ao desenvolvimento de metástases. Os próprios autores chamam atenção para a alta probabilidade de resultado falso-positivo, em função do tamanho da amostra e do desenho do estudo.58

Um estudo multicêntrico escandinavo reuniu uma expressiva casuística de 177

amostras de sarcomas de partes moles, de vários subtipos histológicos. Além de diferenciar geneticamente subtipos histológicos, a contribuição mais significativa desse estudo foi a identificação de uma assinatura genética para tumores com maior risco de metástases. Os principais genes incluídos nessa assinatura genética eram genes induzidos por hipóxia.59

Com relação à identificação de um perfil de expressão associado à resposta à quimioterapia, encontramos, até o momento, resultados publicados apenas para osteossarcomas. Três estudos se propuseram a esse objetivo e os três trabalhos identificaram assinaturas genéticas associadas à resposta patológica à quimioterapia neoadjuvante. Porém, não houve sobreposição de grupos de genes entre os três estudos e cada um dos trabalhos identificou grupos de genes associados a vias metabólicas ou proliferativas totalmente diferentes.60 - 62

22

Exceção feita aos tumores estromais gastrointestinais (GIST’s), o perfil de expressão gênica de sarcomas de partes moles foi testado como fator preditivo de sensibilidade a drogas apenas em ensaios experimentais com linhagens celulares.63,64

A ausência de publicações disponíveis até o momento que se proponham a correlacionar o perfil de expressão gênica em sarcomas de partes moles de adultos com quimiossensibilidade, associada à oportunidade de coletar material fresco em um ensaio clínico prospectivo nos estimulou a iniciar um estudo com objetivo de avaliar o perfil de expressão gênica de sarcomas de partes moles como fator preditivo de resposta à quimioterapia.