Apresentação cruzada e atividade imuno-estimuladora de células dendríticas pulsadas com antígenos... por Renato Brito Baleeiro - Versão HTML

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RENATO BRITO BALEEIRO

APRESENTAÇÃO CRUZADA E ATIVIDADE IMUNO-ESTIMULADORA

DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PULSADAS COM ANTÍGENOS

PARTICULADOS ACOPLADOS A UM AGONISTA DE “TOLL-LIKE

RECEPTOR”

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade de São Paulo, para obtenção do

Título de Doutor em Ciências.

São Paulo

2012

RENATO BRITO BALEEIRO

APRESENTAÇÃO CRUZADA E ATIVIDADE IMUNO-ESTIMULADORA

DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PULSADAS COM ANTÍGENOS

PARTICULADOS ACOPLADOS A UM AGONISTA DE “TOLL-LIKE

RECEPTOR”

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade de São Paulo, para obtenção do

Título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Imunologia

Orientador: Prof. Dr. José Alexandre M. Barbuto

Versão original

São Paulo

2012

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Baleeiro, Renato Brito.

Apresentação cruzada e atividade imuno-estimuladora de células

dendríticas pulsadas com antígenos particulados acoplados a um

agonista de "Toll-like receptor" / Renato Brito Baleeiro. -- São Paulo,

2012.

Orientador: Prof. Dr. José Alexandre Marzagão Barbuto.

Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências

Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração:

Imunologia. Linha de pesquisa: Imunologia de Tumores.

Versão do título para o inglês: Cross-presentation and induction of

immune response by dendritic cells pulsed with particulate antigens

coupled to a "Toll-like receptor" agonist.

1. Células Dendríticas 2. Imunoterapia 3. Vacinas 4. Adjuvantes

imunológicos 5. Linfócitos T I. Barbuto, Prof. Dr. José Alexandre

Marzagão II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências

Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Imunologia III. Título.

ICB/SBIB0180/2012

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a):

Renato Brito Baleeiro.

Título da Tese:

Apresentação cruzada e atividade imuno-estimuladora de

células dendríticas pulsadas com antígenos particulados

acoplados a um agonista de "Toll-like receptor".

Orientador(a):

Prof. Dr. José Alexandre Marzagão Barbuto.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a):

Assinatura: ...............................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Presidente:

Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

index-5_1.jpg

À minha familia.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, o Prof. Dr. José Alexandre Marzagão Barbuto. Por ter me

suportado desde a iniciação científica.

Ao meu orientador na Alemanha, o Prof. Dr. Peter Walden, não só por ter me

aceitado em seu laboratório, mas também por ter compartilhado comigo seu

conhecimento e experiência.

Aos professores Dr. Edécio Cunha, Dra. Vera Calich e Dra. Verônica Coelho

pelas valiosas sugestões para meu trabalho, no exame de qualificação.

Aos companheiros do laboratório, Ana Carolina, Célia, Cris, Patty Toniolo,

Patty Bergami, Roberto (o Robertson ou Roberium), Rodrigo (o popular Rodrigus

Nalius), pelo auxílio, apoio, troca de ideias e momentos de descontração.

Às companheiras e amigas Grá e Isabella pelo companheirismo e ajuda

sempre que eu precisei. Vocês são especiais!

À Bruna e Karen, principalmente pelo auxílio com os trâmites burocráticos

com a tese. Vocês merecem vários chocolates alemães; se bem que os chocolates

suíços e Belgas são melhores!

Aos colegas do laboratório na Alemanha por terem me auxiliado nos

experimentos. Em especial a Anja, Arlina, Ulli, Florian, Melanie, Rebecca e Saulius.

Aos amigos Arthur e Michael por terem proporcionado grandes momentos de

descontração, pelos almoços na Mensa e pausas para o café. Vocês me fizeram rir

à beça.

A secretária do Professor Peter, a Patricia Zambon, que com muita paciência

me auxiliou em todos os trâmites burocráticos durante minha estada em Berlim.

Ao Prof. Dr. Yoram Reiter por ter cedido os anticorpos para a identificação

dos complexos MHC-I/peptídeo nas DCs.

Ao Dr. Lars Dähne, Barbara Baude e Dr. Jörg Rösner pelo auxílio com o

microscópio confocal.

Ao Prof. Karl-Heinz Wiesmüller por ter cedido os peptídeos e lipopeptídeo

utilizados nesse trabalho.

Ao pessoal da secretaria do departamento de Imunologia: Eni, Jotelma e

Amarildo ( in memoriam) pela atenção e ajuda sempre que necessário.

Aos professores do departamento de Imunologia, pelo conhecimento

transmitido ao longo do tempo que eu passei no departamento.

Aos funcionários André, Maomé, Miltão e Otacílio, pela ajuda e momentos de

descontração.

À minha família. Sempre me apoiou em tudo, mesmo que minha realização

significasse ausência física temporária.

Aos doadores de sangue, sem os quais esse estudo não seria possível.

As bibliotecárias do ICB-USP, pela gentileza e competência no auxílio com os

trâmites da biblioteca.

À FAPESP pelo apoio financeiro ao meu projeto de Doutorado e ao Projeto

Temático do laboratório.

Ao DAAD, a Capes e a Fundação Pro Haut do Hospital Charité de Berlim

pelo apoio financeiro durante minha estada na Alemanha para o doutorado

sanduíche.

Agradeço a todos que, de alguma forma contribuíram para a realização deste

trabalho.

À Deus, por me conceder a oportunidade e o privilégio de fazer o que mais

gosto.

“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar,

divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha

mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade

continua misterioso diante de meus olhos”.

Isaac Newton

RESUMO

BALEEIRO, R. B. Apresentação cruzada e atividade imuno-estimuladora de

células dendríticas pulsadas com antígenos particulados acoplados a um

agonista de “Toll-like receptor” . 2012. 163 f. Tese (Doutorado em Imunologia) -

São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2012.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos

(APCs), sendo responsáveis pela ativação de linfócitos T (LT) CD4+ e CD8+. A

apresentação de antígenos (Ags) exógenos para LT CD8+, denominada

apresentação cruzada é fundamental para a indução de resposta imune contra

tumores e células infectadas por vírus. Apesar de esse fenômeno ter sido bastante

estudado nos últimos anos, há ainda muitas lacunas a serem preenchidas para sua

total compreensão. Foi recentemente proposto que as DCs selecionam os Ags que

serão apresentados e que essa seleção é baseada na presença de ligantes para

receptores para reconhecimento de padrões (PRRs), na partícula fagocitada -

notadamente, receptores semelhantes ao Toll (TLRs). Mostrou-se que este

fenômeno é importante para a apresentação de Ags no contexto de classe II para

ativação de LT CD4+. Contudo, não foi abordada a importância da co-localização do

Ag e do ligante de TLR em uma única “partícula” para a apresentação em classe I –

o que levaria à indução de resposta de LT CD8+. Assim, o objetivo deste estudo foi

investigar se o acoplamento de Ags particulados a um agonista de TLR poderia

torná-los mais eficientes como desencadeadores de uma resposta imune mediada

por LT CD8+ induzida por DCs humanas tratadas com as moléculas acopladas.

Nossos resultados mostraram que a presença de um ligante de TLR no material

fagocitado não contribuiu nem para a “maturação do fagossomo”, nem para a via

endossômica de apresentação cruzada. Observamos também que a apresentação

cruzada não envolve acidificação endossômica e depende de moléculas de MHC

recém-sintetizadas do retículo endoplasmático. Por fim, nossos dados confirmam

também a importância do estado de maturação das DCs para a indução de resposta

proliferativa em LT CD8+, embora este não tenha sido associado, em nossas

observações, com o nível de apresentação do complexo MHC-I/peptídeo, ou com as

moléculas normalmente utilizadas para indicar a maturação das DCs.

Palavras-chave: Células dendríticas. TLRs. Antígenos particulados. Apresentação

Cruzada. Adjuvantes. Linfócitos T. Lipopeptídeos.

ABSTRACT

BALEEIRO, R. B. Cross-presentation and induction of immune response by

dendritic cells pulsed with particulate antigens coupled to a “Toll-like receptor”

agonist. 2012. 163 p. Ph. D. thesis (Immunology) - Instituto de Ciências Biomédicas,

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.

Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells (APCs), triggering

activation of both CD4+ and CD8+ T lymphocytes. The presentation of endocytosed

antigens (Ags) to CD8+ T cells is termed cross-presentation and it is a crucial

process for the induction of immune response against tumors and virus-infected

cells. Although this phenomenon has been intensively studied over the past years,

there are still some gaps to be filled. It has recently been proposed that DCs select

the Ags that will be presented at their surfaces and this selection seems to be based

on the presence of a Toll-like receptor (TLR)-ligand on the cargo. Such a

phenomenon has been shown to play a major role in the presentation of Ags in the

context of MHC class II, which leads to the activation of CD4+ T cells. However, the

relevance of the coupling of the Ag to a TLR-ligand on the Ag presentation in the

context of class I has not been addressed. Thus, the goal of this study was to

investigate whether the coupling of particulate Ags to a TLR-agonist could improve

the cross-presentation and enhance the capacity of the loaded-DCs to trigger CD8+

T cell response. Our data show that the cross-presentation does not involve

endosomal acidification and it relies on newly synthesized MHC-I molecules from the

endoplasmic reticulum. Moreover, the presence of a TLR-ligand on the cargo neither

contributed to the phagosome maturation nor to the endosomic route of cross-

presentation. We also show that the maturation status of DCs is crucial for the

induction of CD8+ T cells proliferation. Intriguingly, although the coupling of the Ag to

the adjuvant has neither changed the expression of the markers related to maturation

nor the presentation of the complex MHC-I/peptide at the DC surface, it did affect its

capacity of stimulating CD8+ T cells.

Keywords: Dendritic cells. TLRs. Particulate Antigens. Cross-presentation.

Adjuvants. T Lymphocytes. Lipopeptides.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Ag: Antígeno

APC: Aloficocianina

APCs: Células apresentadoras de antígenos (profissionais)

BCR: Receptor do linfócito B

BFA: Brefeldina A

BSA: Albumina bovina sérica

CCR: Receptor para quimiocina

CD: Cluster de diferenciação

CMV: Citomegalovírus

CO2: Dióxido de carbono

CpG: Citosina fosfatidil guanina

Cy5: Cianina 5

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DC: Célula dendrítica

DD: Domínio de morte

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dsRNA: Ácido ribonucléico (RNA) de dupla fita

EAP: Proteína E

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA: Ensaio imunoenzimático

Fab: Fragmento de ligação ao antígeno

FITC: Isotiocianato de fluoresceína

GILG: Peptídeo M158-66 do vírus influenza A, sequência GILGFVFTL

GM-CSF: Fator estimulador de colonias de granulócitos e macrófagos

HLA-A: Antígeno Leucocitário Humano A

HLA-DR: Antígeno Leucocitário Humano DR

iDC: Célula Dendrítica Imatura

IFN: Interferon

Ig: Imunoglobulina

IL: Interleucina

IRAK: Quinase associada ao receptor de IL-1

LPS: Lipopolisacarídeo

LT: Linfócito T

M1: Proteína da matriz (do vírus influenza) 1

mDC: Célula dendrítica madura

MFI: Média de intensidade de fluorescência

MHC: Complexo de histocompatibilidade principal

Myd88: Diferenciação mielóide 88

NF-B: Fator nuclear kappa B

NK: Células assassinas naturais

NLVP: Peptídeo pp65595-603 do citomegalovírus (CMV), sequência NLVPMVATV

OVA: Ovoalbumina

P2C: Di-acil-lipopeptídeo, ou Pam2, sequência Pam2Cys-GDPKHPKSF

PAMPs: Padrões moleculares associados à patógenos

PBMCs: Células mononucleares de sangue periférico

PBS: Solução salina tamponada com fostafos

PLGA: Poli (ácido lático-co-ácido glicólico)

Poli I:C: Ácido poli-inosínico poli-citidílico

pp65: Fosfoproteína de 65 kD, de CMV

PRRs: Receptores para reconhecimento de padrões

pSTAT: Transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) fosforilado

SBF: Soro bovino fetal

SOCS: Supressores de sinalização de citocinas

ssRNA: Ácido ribonucléico (RNA) de fita única

STAT: Transdutor de sinal e ativador de transcrição

T2: Linhagem de linfócitos deficiente em TAP

TAP: Proteína associada com o processamento de antígenos

TCR: Receptor do linfócito T

TGF: Fator de crescimento transformador

Th: Linfócito T helper

TIR: Receptor para IL-1 e Toll

TIRAP: Proteína associada a TIR

TLRs: Receptores semelhantes ao Toll

TNF: Fator de necrose tumoral

TRAM: Molécula adaptadora relacionada à TRIF

T reg: Linfócitos T reguladores

TRIF: Adaptador indutor de IFN- contendo domínio TIR

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................17

2 OBJETIVOS ...........................................................................................................25

3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ......................................................................26

4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................28

4.1 Casuística ...........................................................................................................28

4.2 Obtenção dos peptídeos e lipopeptídeo..........................................................28

4.3 Partículas de sílica e conjugação de peptídeos/lipopeptídeo ......................28

4.4 Diferenciação de DCs a partir de monócitos do sangue periférico in vitro

...................................................................................................................................29

4.5 Tratamento das DCs no dia cinco da cultura .................................................30

4.6 Avaliação do fenótipo de membrana de DCs por citometria de fluxo .........31

4.7 Estratégia para análise fenotípica das DCs ....................................................32

4.8 Detecção de IL-12p70 por ensaio imunoenzimático (ELISA) ........................34

4.9 Avaliação da viabilidade celular ......................................................................34

4.10 Análise das DCs por microscopia confocal de fluorescência.....................35

4.10.1 Internalização das partículas e localização intracelular do peptídeo/P2C

....................................................................................................................................35

4.10.2 Localização intracelular das partículas ...........................................................36

4.11 Detecção dos complexos MHC-I/peptídeo na membrana das DCs por

citometria de fluxo ...................................................................................................37

4.12 Tratamento das DCs com inibidores .............................................................37

4.13 Separação de linfócitos T CD8+ para ensaio proliferativo ..........................38

4.14 Avaliação da atividade estimuladora das DCs .............................................39

4.15 Análise estatística ...........................................................................................39

5 RESULTADOS........................................................................................................40

5.1 Caracterização das DCs geradas in vitro ........................................................40

5.2 Expressão de TLR2 pelas DCs .........................................................................42

5.3 Viabilidade celular .............................................................................................43

5.4 Fenótipo de membrana das DCs carregadas com partículas contendo

peptídeos e/ou P2C .................................................................................................46

5.5 Produção de IL-12p70 pelas DCs carregadas com partículas ......................52

5.6 Internalização das partículas e localização intracelular dos peptídeos/P2C a

elas associados .......................................................................................................54

5.7 Detecção do complexo MHC-I/peptídeo na superfície das DCs ...................59

5.8 Avaliação do papel da fagocitose na apresentação cruzada do peptídeo

associado às partículas ..........................................................................................62

5.9 Avaliação da importância da acidificação em compartimentos

endossômicos na apresentação cruzada do peptídeo associado às partículas

....................................................................................................................................64

5.10 Envolvimento do transporte retículo endoplasmático-aparelho de Golgi na

apresentação cruzada do peptídeo associado às partículas

....................................................................................................................................70

5.11 Avaliação da resposta de linfócitos T CD8+ específicos ............................72

5.11.1 Resposta ao epítopo de influenza A ..............................................................72

5.11.2 Resposta ao epítopo de CMV ........................................................................75

6 DISCUSSÃO ..........................................................................................................78

7 CONCLUSÕES ......................................................................................................87

REFERÊNCIAS .........................................................................................................89

APÊNDICES ..............................................................................................................98

APÊNDICE A - Manuscrito submetido à publicação.............................................98

APÊNDICE B - Manuscrito submetido à publicação...........................................133

Introdução e Justificativa

17

_________________________________________________________________________

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A idéia de que o sistema imune tenha sido moldado ao longo da evolução com a

“finalidade” de discriminar entre o próprio e o não-próprio parece bastante coerente e

está bem estabelecida. Com isso, a compreensão do modo pelo qual o organismo

detecta a presença de agentes infecciosos e os elimina sem destruir os tecidos próprios

tem se tornado um assunto intrigante e fascinante na Imunologia. Esta capacidade,

inerente do sistema imune, de reconhecer e responder ao “estranho” e, ao mesmo

tempo, tolerar o próprio, não é tão simples como pode parecer à primeira vista, dada a

grande diversidade molecular dos patógenos e sua alta taxa de mutação e replicação.

Em resposta a esse desafio, os organismos multicelulares, por sua vez, têm

desenvolvido, ao longo do processo evolutivo, diversos sistemas de reconhecimento.

Nos animais vertebrados, por exemplo, esse sistema pode ser dividido em dois grandes

segmentos – o da imunidade inata e o da imunidade adaptativa (JANEWAY, 2001;

PANCER; COOPER, 2006).

O sistema de reconhecimento da imunidade adaptativa depende da geração de

um repertório altamente diversificado de receptores, distribuídos clonalmente em

células especializadas – os linfócitos (B e T), capazes de interagir especificamente com,

potencialmente, qualquer molécula (antígenos, por definição). Os receptores de

linfócitos B (BCR) e os receptores de linfócitos T (TCR), após serem gerados

aleatoriamente, sofrem um processo de seleção que elimina os clones celulares que

expressam aqueles com afinidade “excessiva” pelos antígenos (Ags) próprios –

diretamente no caso dos linfócitos B e em associação com moléculas codificadas pelo

Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility

Complex) próprio no caso dos linfócitos T (PANCER; COOPER, 2006). Um outro

importante atributo da imunidade adaptativa é a geração de memória imunológica, que

proporciona um ajuste adaptativo considerável aos animais vertebrados.

No entanto, a despeito desses importantes atributos, esta resposta imune

adaptativa tem duas importantes “limitações”. Primeiro, receptores para Ags gerados de

modo aleatório são incapazes de determinar a origem e o contexto biológico do Ag para

o qual eles são específicos, havendo sempre a possibilidade de “escape” de clones

Introdução e Justificativa

18

_________________________________________________________________________

auto-reativos dos processos de seleção, cuja ativação na periferia precisaria de um

controle adicional. Segundo, a distribuição clonal de receptores para Ags requer que

clones específicos sofram expansão e se diferenciem em células efetoras para que elas

possam contribuir de maneira significativa para a defesa do hospedeiro. Como

conseqüência, a resposta imune adaptativa inicial ou “primária” é relativamente

demorada, levando de 4 a 7 dias aproximadamente para ser estabelecida de forma

efetiva (PANCER; COOPER, 2006), o que é, de fato, tempo demais para combater

microorganismos invasores que se replicam rapidamente. É notório, entretanto, que a

imunidade adaptativa não funciona de maneira independente. De fato, ela ocorre, quase

sempre, em seguida a uma resposta da imunidade inata, que, muito frequentemente, é

capaz de conter o processo infeccioso e influenciar significativamente a resposta

adaptativa que lhe sucede (MEDZHITOV, 2001). Assim, de maneira geral, a imunidade

inata detecta a presença e a natureza da infecção, proporciona a primeira linha de

defesa para o hospedeiro, influencia de maneira significativa o início da resposta

adaptativa e a classe de células efetoras predominantes na mesma (MEDZHITOV,

2001).

Dentre as várias estratégias de discriminação do “próprio”/“não-próprio” adotadas

pelo sistema imune inato dos vertebrados, uma de grande importância é, sem dúvida a

que permite ao hospedeiro reconhecer produtos microbianos que lhes são únicos

(MEDZHITOV; JANEWAY, 2002). Esta estratégia permite ao sistema imune inato

diferenciar, de maneira eficaz, o não-próprio e potencialmente infeccioso do próprio,

não-infeccioso. Esses produtos microbianos apresentam o que foi chamado de

“padrões moleculares associados à patógenos” (PAMPs) e estão, frequentemente,

envolvidos em funções vitais para o microorganismo sendo, desse modo, conservados

entre microorganismos de uma dada classe (JANEWAY, 1989, 1992). Como exemplos

de PAMPs podemos citar a flagelina, motivos de CpG não metilados e RNA de dupla

fita (dsRNA), que são moléculas encontradas em bactérias e/ou vírus, mas não em

células do hospedeiro. Portanto, esses produtos podem ser vistos como “assinaturas

moleculares” de microorganismos invasores, e seu reconhecimento pela imunidade

inata pode ser indicativo da presença de infecção (JANEWAY, 1992). Essas

propriedades dos PAMPs indicam que seu reconhecimento deve ter surgido num

Introdução e Justificativa

19

_________________________________________________________________________

estágio muito inicial na evolução do sistema de defesa do hospedeiro, o que é reforçado

ainda pelo fato de PAMPs serem reconhecidos também pelos “sistemas imunes” de

invertebrados e plantas (MEDZHITOV, 2001).

Para o reconhecimento dos diversos PAMPs, o sistema imune conta com os

“receptores para reconhecimento de padrões” (PRRs). Esses PRRs podem ser

expressos tanto na superfície celular quanto em compartimentos intracelulares ou

ainda, secretados para a corrente sanguínea e fluidos teciduais. Entre as principais

funções dos PRRs estão a opsonização (GEWURZ et al., 1982; SCHWALBE et al.,

1992; WRIGHT; ULEVITCH; RAMOS, 1989), ativação do complemento (HOLMSKOV,

2000), fagocitose (ELOMA et al., 1995; PEARSON, 1996) e ativação de vias de

sinalização para a geração de citocinas importantes na resposta inflamatória, como a

IL-12 e o TNF-α (KOSKI; KARIKO; XU, 2004).

Dentre os PRRs conhecidos, os que vêm ganhando especial atenção dos

imunologistas nos últimos anos são os receptores semelhantes ao Tol (TLRs). Estes

pertencem a um grupo de receptores altamente conservados e primeiramente descritos

em Drosophila (GAY e KEITH, 1991; POLTORAK et al., 1998). É interessante observar

que em drosófilas os receptores do tipo Tol parecem estar envolvidos primariamente na

embriogênese (ANDERSON, 2000; HASHIMOTO; HUDSON; ANDERSON, 1988), mas

o seu bloqueio torna os animais suscetíveis a infecções, principalmente por fungos

(LEMAITRE et al., 1996; MENG; KHANUJA; IP, 1999; RUTSCHMANN et al., 2000).

Estruturalmente, os TLRs são caracterizados pela presença de um domínio de

repetição rico em leucina na sua região de ligação ao PAMP e um domínio TIR

(receptor para IL-1 e Tol ) na sua região de sinalização. Até o momento, foram

identificados, em humanos, 11 diferentes TLRs (TLR1-TLR11) (AKIRA; TAKEDA, 2004).

Baseado na sequência de aminoácidos TLR1, TLR2, TLR6 e TLR10 são intimamente

relacionados e constituem a subfamília TLR2 (TLR1 e TLR6 formam heterodímeros com

TLR2 na membrana celular). De igual modo, TLR7, TLR8 e TLR9 constituem a

subfamília TLR9 (TAKEDA; KAISHO; AKIRA, 2003). Os demais TLRs ainda não foram

classificados em famílias.

Apesar do vasto conhecimento que dispomos nos dias de hoje acerca dos

diferentes TLRs, o primeiro deles, o TLR4 só foi descoberto na década de 1990 (GAY;

Introdução e Justificativa

20

_________________________________________________________________________

KEITH, 1991; POLTORAK et al., 1998), tendo sido descrito como transdutor de sinal do

lipopolissacarídeo (LPS), o principal componente da parede celular de bactérias Gram-

negativas. Desde então, vários outros TLRs foram descritos por serem capazes de

reconhecer e mediar sinais intracelulares para uma vasta categoria de componentes

microbianos (ou não), como consta no quadro 1 a seguir:

Quadro 1 - Ligantes para TLRs em humanos.

TLR

Ligantes

Referência

TLR1/2

Tri-acil-peptídeos

OZINSKY; UNDERHILL; FONTENOT, 2000

HERTZ ; WU; PORTER, 2003; McCURDY ; OLYNYCH; MAHER,

TLR2

Lipoproteínas, peptidoglicano, zimozan

2003

TLR2/6

Di-acil-lipopeptídeos

OZINSKY; UNDERHILL; FONTENOT, 2000

ALEXOPOLOU et al., 2001; WANG; TOWN; ALEXOPOULOU,

TLR3

RNA de dupla fita (dsRNA)

2004; GUILLOT ; LE GOFFIC; BLOCH, 2005

TLR4

Lipopolissacarídeo bacteriano (LPS)

ROGER ; DAVID; GLAUSER, 2001; FAN ; MALIK, 2005

TLR5

Flagelina

GEWIRTZ; NAVAS; LYONS, 2001

TLR7

RNA de fita simples (ssRNA)

HEIL; HERMMI; HOCKREIN, 2004

TLR8

RNA de fita simples (ssRNA)

HEIL; HERMMI; HOCKREIN, 2004

BAUER ; KIRSCHINING; HACKER, 2001; LATZ ;

SCHOENEMEYER; VISINTIN, 2004; SIVORI ; FALCO; DELLA

TLR9

Motivos de CpG não metilados

CHIESA, 2004

TLR10

Desconhecido

COOK; PISETSKY; SCHWARTZ, 2004

TLR11

Desconhecido

ZHANG; ZHANG; HAYDEN, 2004

Após interação do TLR com seu ligante, há uma série de eventos intracelulares

subsequentes que culminarão na transcrição de genes para citocinas pró-inflamatórias

e moléculas do MHC de classe I (MHC-I) e de classe II (MHC-II) (AKIRA; TAKEDA,

2004; KOPP; MEDZHITOV, 2003; TAKEDA; KAISHO; AKIRA, 2003). A maioria dos

TLRs, incluindo TLR1, 2, 4, 5, 6, 7 e 9 compartilham uma via de sinalização comum

através da molécula adaptadora MyD88 (Diferenciação Mielóide 88, do inglês Myeloid

Differentiation), que tem um domínio TIR em sua região C-terminal e um domínio de

morte (DD, do inglês Death domain) em sua região N-terminal (AKIRA; TAKEDA, 2004;

KOPP; MEDZHITOV, 2003; TAKEDA; KAISHO; AKIRA, 2003). Ao serem estimulados,

estes TLRs recrutam MyD88 pela interação de seus respectivos domínios TIR. O DD de

MyD88 liga-se então ao DD de IRAK (Quinase associada ao receptor de IL-1) e o sinal

Introdução e Justificativa

21

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é propagado via TRAF6 (Fator 6 associado ao receptor de TNF), levando à ativação de

MAPK (Proteína quinase ativada por mitógenos), e do fator de transcrição NF-κB, que

resultará na transcrição dos genes para citocinas pró-inflamatórias e moléculas do

MHC-I e II (AKIRA; TAKEDA, 2004; KOPP; MEDZHITOV, 2003; TAKEDA; KAISHO;

AKIRA, 2003). Uma segunda proteína adaptadora contendo TIR, a TIRAP (Proteína

associada a TIR) está envolvida na via MyD88-dependente de TLR1/2, TLR2/6 e TLR4,

mas não de outros TLRs (HORNG et al., 2002; YAMAMOTO et al., 2002).

A observação de que o poli I:C, um ligante de TLR3, é capaz de induzir a

ativação de NF-κB e a produção de citocinas inflamatórias em camundongos “nocaute”

para MyD88, levou à descoberta, para TLR3, de uma outra via de sinalização,

independente de MyD88 (AKIRA; TAKEDA, 2004; ALEXOPOULOU et al., 2001).

Parecem participar desta via “alternativa”, duas moléculas adaptadoras diferentes,

ambas contendo domínios TIR, o TRIF (Adaptador indutor de IFN-β contendo domínio

TIR) e a TRAM (Molécula adaptadora relacionada à TRIF) (YAMAMOTO et al., 2002,

2003).

A atividade destes receptores e moléculas sinalizadoras pode ser identificada em

diferentes tipos celulares no organismo (IWASAKI; MEDZHITOV, 2004). Dentre estes, é

muito relevante considerar as células dendríticas (DCs), células que fazem uma

conexão funcional entre a resposta inata e a resposta adaptativa e que têm papel

central na modulação do tipo de resposta adaptativa que se desenvolve. Assim, através

de seus TLRs, as DCs imaturas, localizadas nos tecidos periféricos, identificam PAMPs

de microorganismos potencialmente perigosos, e com o auxílio, ou não, de receptores

endocíticos, capturam esses microorganismos, migram para os órgãos linfóides

secundários, passando por um processo de maturação. Nesse estágio, elas expressam

altos níveis de moléculas co-estimuladoras (CD80 e CD86), aumentam a expressão de

moléculas do MHC-I e II e passam a expressar as moléculas CD83 (EGNER; HART,

1995; ZHOU et al., 1992) e CCR7, ao mesmo tempo em que deixam de expressar

CCR1, CCR5 e CCR6 (BANCHEREAU et al., 2000). A mudança da expressão de

CCR1, CCR5 e CCR6 para CCR7 favorece a migração destas células ativadas para as

áreas timo-dependentes dos linfonodos. Da mesma forma, a mudança da cinética de

expressão de moléculas do MHC favorece a apresentação dos antígenos capturados no

Introdução e Justificativa

22

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momento de sua ativação para os linfócitos T (LT) “naive” (também atraídos para as

mesmas áreas do linfonodo). Este processo de maturação das DCs é acompanhado por

eventos intracelulares que incluem a diminuição dos níveis de SOCS (Supressores de

sinalização de citocinas, do inglês Suppressors of Cytokine Signaling) 2 e pSTAT6,

assim como aumento nos níveis de SOCS1, SOCS3 e pSTAT1 (JACKSON et al.,

2004). É interessante notar que esta maturação, ao mesmo tempo em que é estimulada

– pelo aumento de pSTAT1 - é também controlada pelo aumento, simultâneo, de

SOCS1 (SHEN et al., 2004).

Além de seu papel claro na apresentação de Ags aos linfócitos T, as DCs,

dependendo, entre outros possíveis fatores, do perfil de citocinas liberadas, podem,

ainda, influenciar o padrão de resposta dos LT. Assim, a produção de IL-12 por DCs

favorece o desenvolvimento de linfócitos T helper de padrão 1 (Th1), ao passo que a

ausência de produção pelas DCs de IL-12, na presença de IL-4 e/ou IL-13 favoreceria

uma resposta predominantemente mediada por linfócitos do tipo Th2. Em contrapartida,

a produção de IL-10 pelas DCs pode favorecer o surgimento de linfócitos T reguladores

(T reg), caracterizados pela expressão do fator de transcrição Foxp3 e pela produção

de citocinas imunossupressoras como TGF-β e IL-10 (FONTENOT; GAVIN;

RUDENSKY, 2003; HORI; NOMURA; SAKAGUCHI, 2003; ZOU, 2006). Mostrando a

heterogeneidade do sistema, há ainda um outro padrão de resposta recentemente

descrito, o de linfócitos do tipo Th17, caracterizado pela produção de IL-17 (STEINMAN,

2007), cuja ativação parece depender da presença de IL-23 (BETTELLI OUKKA;

KUCHROO, 2007; KORN et al., 2007).

Neste contexto, é importante notar o papel dos TLRs. Há relatos de que a

ativação de TLRs (TLR1 a TLR9), nas DCs, parece levar à indução de uma resposta

Th1, ao passo que a maturação de DCs na ausência destes ligantes de TLR estaria

relacionada à indução de um padrão Th2 ou T reg (MEDZHITOV, 2001). Um outro

aspecto que merece atenção é o fato de que, dependendo do tipo e localização do TLR

estimulado (intracelular ou de superfície), as DCs podem induzir uma resposta distinta

(NAPOLITANI et al., 2005; TRINCHIERI; SHER, 2007). É interessante notar que o

trabalho de Napolitani et al. (2005) mostrou que TLRs localizados na superfície de DCs

parecem agir de maneira sinérgica com TLRs de localização intracelular/endossômica

Introdução e Justificativa

23

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para induzir uma resposta imune mediada por linfócitos Th1 (pela a secreção de grande

quantidade de IL-12 pelas DCs). Mostrando o “refinamento” do reconhecimento também

na imunidade inata, há as observações de que o acoplamento físico do Ag ao agonista

de TLR parece influenciar significativamente a ativação de linfócitos T naive por DCs.

Nesse sentido, um interessante estudo feito por Blander e Medzhitov (2006) mostrou

que uma maneira bastante eficaz de as DCs estimularem LT naive para o

desenvolvimento de uma resposta adaptativa efetora subsequente, seria a maturação

dessas células com agonistas de TLR acoplados fisicamente ao Ag contra o qual se

pretende induzir imunidade. Nesse trabalho os autores puderam mostrar que, quando

diferentes Ags (ovalbumina, lisozima ou proteína Eα - EAP), acoplados fisicamente a

um agonista de TLR são capturados por DCs, eles são apresentados pelas DCs de

maneira substancialmente “melhor” do que se capturados isoladamente ou não-

acoplados fisicamente ao agonista de TLR. Na verdade, os pesquisadores puderam

observar que o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), ligante do TLR4, induziu maturação

do fagossomo contendo o Ag usado, passo crucial para o processamento e

apresentação do mesmo. Desse modo, o Ag que estava acoplado ao ligante de TLR

pôde ser melhor processado e teve uma apresentação significativamente melhor de

seus epítopos, complexados ao MHC-II na membrana das DCs.

Estes fenômenos mostram, de modo elegante, como o sistema imune pode

discriminar entre o “próprio”/“não-próprio”, identificando situações e moléculas

potencialmente perigosas, contra as quais a resposta específica da imunidade

adaptativa deve ser ativada.

É importante observar que o foco do estudo de Blander e Medzhitov foi a

apresentação de antígenos no contexto do MHC de classe II e ativação de linfócitos T

CD4+. No mesmo, no entanto, não foi abordada a importância da co-localização do

antígeno e do adjuvante em uma única “partícula” para a eficiente apresentação no

contexto do MHC de classe I – o que levaria à indução de resposta de linfócitos CD8+.

Uma vez que os linfócitos T CD8+ ativados são os responsáveis por matar células

tumorais e também células infectadas por vírus, a investigação do melhor modo de

induzir sua ativação pode contribuir significativamente para o desenvolvimento de

abordagens immunoterapêuticas contra esse tipo de moléstia.

Introdução e Justificativa

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Diante do exposto, torna-se instigante a possibilidade de, acoplando Ags a

agonistas de TLRs, torná-los mais eficientes como desencadeadores de uma resposta

imune induzida pela vacinação com DCs tratadas com as moléculas acopladas, que

poderia ser usado em protocolos de vacinação contra o câncer, por exemplo. O estudo

da diferenciação de células dendríticas humanas neste contexto contribuirá para a

compreensão das relações entre a resposta inata e a adaptativa e será fundamental

para a otimização de protocolos de vacinação anti-tumoral baseados nas DCs, o que

vem sendo buscado por nosso grupo nos últimos anos.

Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se o acoplamento de antígenos a um

agonista de TLR poderia torná-los mais eficientes como desencadeadores de uma

resposta imune mediada por linfócitos T CD8+ induzida por DCs humanas tratadas com

as moléculas acopladas. A indução de resposta à antígenos exógenos mediada por

linfócitos T CD8 envolve um fenômeno conhecido como apresentação cruzada. O

processamento de antígenos para a apresentação cruzada ainda não foi

completamente elucidado e é objeto de intensa investigação por diversos grupos

(BURGDORF et al., 2008; DI PUCCHIO et al., 2008; KASTURI; PULENDRAN, 2008). O

papel da acidificação endossômica e a participação do retículo endoplasmático no

processamento antigênico para a apresentação cruzada ainda não estão bem

estabelecidos e são alvo de debate e controvérsia (ACCAPEZZATO et al., 2005;

BABON et al., 2005; BURGDORF et al., 2008; DI PUCCHIO et al., 2008; KASTURI;

PULENDRAN, 2008; MANTEGAZZA et al., 2008). Diante disso, investigamos também

em nosso modelo experimental a importância desses dois parâmetros na apresentação

cruzada.

Objetivos

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2 OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho foi investigar a importância do acoplamento de

antígenos ao estímulo de maturação (ligantes de TLR) para o processamento

antigênico por DCs humanas para apresentação cruzada e consequente ativação de

linfócitos T CD8+ antígeno-específicos.

Os peptídeos M158-66 (GILGFVFTL) do vírus da influenza A e o pp65595-603

(NLVPMVATV) do citomegalovírus (CMV) foram usados como modelos de antígenos.

Como estímulo de maturação, utilizou-se o lipopeptídeo di-acetilado Pam2Cys-

GDPKHPKSF, um agonista de TLR2 e 6. Tanto os peptídeos quanto o lipopeptídeo

foram associados à partículas de sílica antes de serem acrescentados às culturas de

DCs. Peptídeos e lipopeptídeo foram adicionados às DCs, adsorvidos às mesmas

(acoplado) ou a diferentes partículas (não-acoplado). Nas DCs que receberam os

diferentes estímulos foram analisados os seguintes parâmetros:

- viabilidade;

- expressão das moléculas de superfície relacionadas à maturação (HLA-DR,

CD80, CD83 e CD86);

- secreção de IL-12;

- internalização das partículas e localização intracelular dos peptídeos a elas

associados;

- expressão do complexo MHC-I/peptídeo na superfície;

- papel da fagocitose, acidificação endossômica e transporte retículo

endoplasmático-aparelho de Golgi na apresentação do peptídeo adsorvido às

partículas;

- capacidade de induzir proliferação em linfócitos T CD8+ autólogos, específicos

para os peptídeos com os quais essas DCs foram pulsadas.

Delineamento Experimental

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3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Inicialmente, DCs imaturas foram obtidas por diferenciação de células

mononucleares aderentes do sangue periférico (PBMCs). À cultura de células

aderentes foram adicionadas as citocinas GM-CSF e IL-4, o que resultou na geração de

DCs imaturas no dia cinco da cultura. Às DCs imaturas foram adicionados os peptídeos

GILG ou NLVP, acoplados ou não por partículas ao lipopeptídeo di-acetilado Pam2Cys-

GDPKHPKSF (P2C, agonista de TLR2 e 6). Como controle de maturação, foi utilizado o

coquetel de citocinas inflamatórias, composto de IL-1-β, IL-6 e TNF-α. No dia seis da

cultura, foi investigada nas DCs, a internalização das partículas contendo os peptídeos,

assim como a localização intracelular desses peptídeos. Para essas análises foi usada

a microscopia confocal. Em paralelo, foi investigada a expressão do complexo MHC-

I/peptídeo na superfície dessas DCs por citometria de fluxo. No dia sete da cultura, foi

analisada a viabilidade celular. Para isso foi utilizado um kit comercial para a detecção

de células vivas e mortas, o kit Live/Dead (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Assim, as

DCs foram marcadas com o composto não fluorescente calceína-AM, que é

metabolizado em células vivas em um composto altamente fluorescente, a calceína.

Junto com a calceína-AM foi adicionado o homodímero de etídio-1, um composto