Avaliação da interação entre Methylobacterium spp. e citros por Andréa Cristina Bogas - Versão HTML

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Universidade de São Paulo

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Avaliação da interação entre Methylobacterium spp. e citros

Andréa Cristina Bogas

Tese apresentada para obtenção do título de Doutor

em Ciências. Área de concentração: Genética e

Melhoramento de Plantas

Piracicaba

2010

Andréa Cristina Bogas

Bióloga

Avaliação da interação entre Methylobacterium spp. e citros

Orientador:

Prof. Dr. WELINGTON LUIZ DE ARAÚJO

Tese apresentada para obtenção do título de Doutor

em Ciências. Área de concentração: Genética e

Melhoramento de Plantas

Piracicaba

2010

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RESUMO

Avaliação da interação entre Methylobacterium spp. e citros

A interação bactéria-planta é um processo complexo que envolve diversos fatores

bióticos e abióticos, podendo resultar em interações neutras, benéficas ou patogênicas.

O gênero Methylobacterium tem sido descrito como endófito em diferentes plantas

hospedeiras, podendo beneficiá-las por meio da promoção de crescimento vegetal e do

controle de fitopatógenos. Em citros, este endófito coloniza o mesmo nicho que

patógenos, e, assim, muitas espécies desse gênero são interessantes candidatas ao

controle simbiótico contra Xylella fastidiosa. É conhecido que o processo de interação

Methylobacterium-bactéria é coordenado por genes cuja expressão é regulada pelo

sistema Quorum Sensing (QS), o qual utiliza N-acil-homoserina lactonas (AHLs) como

moléculas sinalizadoras, importantes, entre outras coisas, para a formação de biofilme,

encontrado em muitas plantas como estratégia de colonização bacteriana. No entanto,

os mecanismos envolvidos na interação Methylobacterium-planta são ainda pouco

compreendidos. Dessa forma, o presente trabalho buscou estudar, de diferentes

maneiras, a interação entre Methylobacterium spp. e citros, avaliando os efeitos dessas

bactérias sobre o crescimento de plântulas e a variação da expressão gênica. Neste

contexto, foi verificado que a especificidade da interação bactéria-planta e a escolha do

método de inoculação das bactérias são importantes para a geração de resultados

benéficos sobre a germinação de sementes e o desenvolvimento da planta hospedeira.

Possivelmente, a produção de AIA e a fixação biológica de nitrogênio foram os

mecanismos envolvidos na promoção de crescimento de citros por Methylobacterium

spp. neste estudo. Com relação à origem, essas bactérias parecem ser transmitidas

horizontalmente em plantas cítricas. Visando empregar Methylobacterium spp. no

controle de fitopatógenos em citros, M. extorquens AR1.6/2 foi geneticamente

modificada para expressar uma endoglicanase A (EglA). Por meio de microscopia

eletrônica de varredura, foi verificado que a bactéria modificada colonizou a superfície e

o interior de Catharanthus roseus, planta modelo para experimentos com bactérias

endofíticas e X. fastidiosa. Além disso, quando inoculada junto com X. fastidiosa, essas

bactérias compartilharam o xilema das plântulas, sugerindo que durante a colonização e

estabelecimento no hospedeiro estas bactérias poderiam interagir. Estudando a ação

de uma AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M.

mesophilicum SR1.6/6-planta, foi observado que a presença dessa molécula foi

importante na ativação da expressão dos genes mxaF, relacionado ao estabelecimento

e metabolismo metilotrófico da bactéria; pat, relacionado a vantagens adaptativas e

competitivas durante a colonização da planta; e acdS, envolvido com o metabolismo

bacteriano e modulação de níveis hormonais na planta. A expressão dos genes crtI e

sss, envolvidos com respostas a estresse e transporte de compostos, respectivamente,

e do gene phoU, relacionado com patogenicidade, não foram alterados na presença da

AHL nas condições avaliadas Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que

Methylobacterium spp. interagem com plântulas de Citrus spp., demonstrando

especificidade entre a espécie de planta e da bactéria endofítica. Foi observado

também que esta interação ocorre não somente com a planta, mas possivelmente com

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outras bactérias que habitam o xilema de citros. Além disso, esta interação

Methylobacterium-citros-bactérias do xilema pode ser regulada por AHLs.

Palavras-chave: Methylobacterium spp.; Citrus spp; Promoção de crescimento; AHL

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ABSTRACT

Evaluation of the interaction between Methylobacterium spp. and citrus

The bacterium-plant interaction is a complex process that involves several biotic

and abiotic factors that may result in neutral, beneficial or harmful interactions. The

Methylobacterium genus has been described as endophytic bacterium in different host

plants. It could benefit the plants by growth promotion and control of phytopathogens. In

citrus, this endophyte colonizes the same pathogen-niche, and therefore many species

of this genus are interesting candidates to symbiotic control against X. fastidiosa. It is

known that the process of Methylobacterium-bacteria interaction is coordinated by genes

whose expression is regulated by the Quorum Sensing (QS), which uses N-acyl

homoserine lactones (AHLs) as signaling molecules. Its importance is associated with

the biofilm formation, found in many plants as a strategy for bacterial colonization.

However, the mechanisms in Methylobacterium-plant interactions are still poorly

understood. Thus, this work studied in different ways, the interaction between

Methylobacterium spp. and citrus, evaluating the effects of these bacteria on the

seedling growth and the variation of gene expression. In this context, it was found that

the specificity of bacteria-plant interactions and the bacterial inoculation methods are

important to generate beneficial results on seed germination and host plant

development. Possibly, IAA production and nitrogen biological fixation were the major

involved mechanisms in citrus growth promotion by Methylobacterium spp. These

bacteria seem to be transmitted horizontally in citrus plant. Aiming to employ

Methylobacterium spp. to control phytopathogens in citrus plant, M. extorquens AR1.6/2

was genetically modified to express an endoglucanase A (EglA) enzyme. Using

scanning electron microscopy was observed that the modified bacteria colonized the

surface and interior of the Catharanthus roseus, a model plant for experiments with

endophytic bacteria and X. fastidiosa. Furthermore, when inoculated with X. fastidiosa,

these bacteria shared the seedlings xylem, suggesting that during the colonization and

establishment in the host, these bacteria could interact. Studying the action of a AHL on

the expression of genes involved in the interaction between M. mesophilicum SR1.6/6-

plant it was observed that the presence of this molecule was important in the activation

of genes expression mxaF (related to the establishment and methylotrophic

metabolism); pat (related to adaptive and competitive advantages during the plant

colonization); acdS (involved in bacterial metabolism and modulation of hormone levels

in the plant). Expression of crtI and sss, involved in bacterial stress and transport of

compounds, respectively, and phoU, related with pathogenicity were not altered in the

presence of AHL in the evaluated conditions. The results of this study demonstrated that

Methylobacterium spp. interact with seedlings of Citrus spp., showing specificity

between plant species and endophytic bacteria. Also, it was observed that this

interaction occurs not only with the plant molecular modification levels, but possibly with

other bacteria that inhabit the xylem of citrus. Also, this interaction Methylobacterium-

citrus-xylem bacteria may be regulated by AHLs.

Keywords: Methylobacterium spp.; Citrus spp.; Growth-promotion; AHL

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1 INTRODUÇÃO

Entender a natureza do estabelecimento das interações bactéria-planta é um

constante desafio. Potencialmente, todas as plantas vivem em associação com

bactérias, as quais podem colonizar os espaços intercelulares (colonização endofítica);

a superfície vegetal (colonização epifítica); ou atacar os tecidos causando doenças

(colonização patogênica), sendo que algumas populações podem flutuar entre esses

estilos de vida. Embora com propósitos diferentes, bactérias simbiontes e patogênicas

utilizam mecanismos em comum para se estabelecerem na planta, mas nenhuma

dessas relações é totalmente compreendida, embora saibamos que essas comunidades

podem ser afetadas por diversos fatores bióticos e abióticos.

Estudos recentes têm mostrado que a comunicação bactéria-bactéria e/ou

bactéria-planta pode ser regulada por meio de um sistema denominado Quorum

Sensing (QS). Esse sistema é baseado na produção de sinais moleculares difusíveis

que permitem às bactérias controlar mudanças adaptativas e fisiológicas na população.

N-acil-homoserina lactonas (AHLs) são as moléculas sinalizadoras predominantes entre

bactérias Gram-negativas, e são comuns àquelas que estabelecem associação com

plantas. AHLs são importantes, entre outras coisas, para a formação de biofilmes, uma

estratégia chave para a sobrevivência e dominância das bactérias na planta,

favorecendo o estabelecimento de relações patogênicas ou simbióticas. Moléculas que

mimetizam AHLs têm sido encontradas em plantas, e isso tem sido visto como uma

estratégia de adaptação para comunicação com bactérias específicas ou ainda para

proteção contra patógenos.

Nas últimas décadas os estudos sobre bactérias endofíticas têm aumentado,

focando principalmente na utilização desses microrganismos como agentes de controle

biológico de doenças, promotores de crescimento vegetal, fitoremediadores de áreas

poluídas, e/ou vetores para a expressão de genes heterólogos em plantas.

Methylobacterium é um importante gênero de bactérias endofíticas que interagem

de forma simbiótica com diferentes espécies de plantas. Em citros, tem sido

consistentemente isolado como endófito, além de ser descrito como o principal gênero

na interação entre a comunidade endofítica de citros e X. fastidiosa. A possibilidade de

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modificar geneticamente Methylobacterium spp. e reintroduzí-las em seu nicho original,

onde existe o problema ou acesso ao patógeno alvo, poderia se consistuir de um ponto

chave para o controle simbiótico por tais bactérias.

Além da possibilidade de Methylobacterium spp. atuarem como agentes de

controle de fitopatógenos, através do qual também poderiam exercer efeitos indiretos

sobre o crescimento vegetal, esses endófitos poderiam ainda favorecer a citricultura

promovendo o crescimento vegetal de forma direta, possivelmente por meio da produção

de fitohormônios e fixação de nitrogênio, melhorando, assim, a produtividade e/ou a

qualidade dos pomares cítricos. Isso seria de grande importância à citricultura brasileira,

uma vez que o Brasil destaca-se como o maior produtor de citros e também o maior

exportador de suco de laranja do mundo.

Dentro desse contexto, o presente trabalho teve como objetivos: i) avaliar a

capacidade de Methylobacterium spp. promoverem crescimento de citros; ii) modificar

geneticamente Methylobacterium para expressão heteróloga visando o estudo da

interação com X. fastidiosa e o controle simbiótico de fitopatógenos em citros; iii) avaliar

o efeito da AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação Methylobacterium-

planta.

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2 PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE CITROS POR Methylobacterium spp.

Resumo

A habilidade de Methylobacterium spp. endofíticas isoladas de Citrus spp.,

Capsicum annuum L. e Saccharum officinarum L., para induzir a germinação de

sementes e o crescimento de porta-enxertos de citros (limão-cravo - Citrus limonia

Osbeck e tangerina sunki – Citrus sunki), foi avaliada em viveiro comercial. Para isso,

foram desenvolvidos três experimentos e testadas duas metodologias: bacterização de

sementes e inoculação das bactérias no substrato. A primeira metodologia foi aplicada

para testes em limão-cravo e tangerina sunki, e a segunda em testes com tangerina

sunki. Quando o método de bacterização das sementes foi utilizado, as respostas sobre

a germinação variaram de acordo com o porta-enxerto utilizado. Exceto pelos efeitos

negativos gerados por uma linhagem de citros (AR1.6/2), as demais não afetaram a

germinação das sementes de limão-cravo. Em tangerina sunki, foi observado um

possível efeito positivo sobre a germinação. Porém, mais estudos devem ser realizados

para a confirmação desse resultado. Com o decorrer do tempo de desenvolvimento das

mudas, foi observada uma maior diferenciação entre as linhagens, sendo que aquelas

isoladas de citros foram as que melhor promoveram crescimento nos dois porta-

enxertos, tanto em altura quanto em biomassa. Quando as bactérias foram inoculadas

diretamente no substrato, os efeitos sobre a altura das mudas de tangerina sunki foram

mais rápidos do que quando foram inoculadas pela metodologia de bacterização de

sementes. Ao final da produção, as linhagens de citros AR1.6/2, AR1.6/11 e SR1.6/6, e

a linhagem de pimentão TP4/2 promoveram o crescimento dos porta-enxertos em

condição comercial. Os efeitos benéficos sobre o crescimento de tangerina sunki por

Methylobacterium spp. foram também observados pelo aumento da biomassa das

plantas. Nenhum efeito sobre o diâmetro do caule foi observado. Análises de

características funcionais de Methylobacterium spp. revelaram a produção de AIA e a

capacidade de fixação biológica de nitrogênio, sendo esses os possíveis mecanismos

envolvidos com a promoção de crescimento das plantas por essas bactérias. Por meio

de reisolamento em meio de cultura e análise de ARDRA foi confirmado que

Methylobacterium spp. colonizaram endofiticamente os porta-enxertos de citros.

Conforme verificado com os resultados obtidos com o isolamento de bactérias

endofíticas de sementes de limão-cravo e tangerina sunki, Methylobacterium spp.

parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas. Os resultados sugerem

que Methylobacterium spp. colonizam endofiticamente a planta hospedeira e têm

potencial como promotoras de crescimento de citros em condições comerciais.

Palavras-chave: Methylobacterium spp.; Citrus spp.; Interação bactéria-planta;

Promoção de crescimento

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2 CITRUS GROWTH PROMOTION BY Methylobacterium spp.

Abstract

The ability of endophytic isolates of Methylobacterium spp. obtained from Citrus

spp., Capsicum annuum L. and Saccharum officinarum L., to induce plant growth and

seed germination of rootstocks seedlings (Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki), was

evaluated under commercial nursery conditions. For this purpose, three experiments

were developed and two methodologies were tested: bacterization of seeds and

inoculation of the bacteria in the substrate. The first method was applied to trials with

Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki, and the second one was only applied to trials

with Citrus sunki. Using seed bacterization methodology, the answers to germination

showed variation, depending on the rootstock. Except for the negative effects generated

by one strain of citrus (AR1.6/2), other strains didn't affect the seed germination of Citrus

limonia Osbeck plants. In Citrus sunki, it was observed a possible positive effect on

germination. Nonetheless, more studies must be carried out in order to confirm these

results. According to the seedlings development, a larger differentiation was observed

among the strains. Those isolated from citrus improved growth in either rootstocks, both

in height and in biomass. The effects on seedlings' height of Citrus sunki plants were

faster when the bacteria were inoculated directly in the substrate than when inoculated

by seed treatment. The citrus strains AR1.6/2, AR1.6/11 and SR1.6/6, and Capsicum

annuum L. strain TP4/2 promoted growth of rootstocks in commercial nursery

conditions. The positive effects on tangerine sunki growth, caused by Methylobacterium

spp., were also observed by increasing in plant biomass. No effect was observed in the

stem diameter. Analysis of functional characteristics from Methylobacterium spp.

revealed IAA production and nitrogen biological fixation, which can be the possible

mechanisms involved with plant growth promotion. Through reisolation in culture

medium and ARDRA analysis, it was confirmed that Methylobacterium spp. settled

endophytically citrus rootstocks. As verified in obtained results regarding the isolation of

edophytic bacteria from Citrus limonia Osbeck and Citrus sunki seeds,

Methylobacterium spp. seem to be transmitted horizontally in citrus plants. The results

suggest that Methylobacterium spp. colonize endophytically the plant host and have

potential as citrus growth promoters under commercial nursery conditions.

Keywords: Methylobacterium spp.; Citrus spp.; Bacteria-plant interaction; Growth

promotion

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2.1 Introdução

As bactérias associadas às plantas têm um papel chave na adaptação do

hospedeiro, seja em ambientes naturais ou em locais alterados pelo homem numa

estratégia de promover uma melhor associação entre esses microrganismos e algumas

culturas (HALLMANN et al., 1997; STURZ; NOWAK; 2000a).

Frequentemente, os efeitos benéficos das bactérias endofíticas são maiores do

que das bactérias que colonizam a rizosfera das plantas (PILLAY; NOWAK, 1997).

Assim, os endófitos podem ser de particular interesse para aplicação agrícola, uma vez

que apresentam a vantagem de estarem em um ambiente menos exposto a mudanças

ambientais e com um menor número de competidores (STURZ; CHRISTIE; NOWAK,

2000b; WHIPPS, 2001).

Algumas bactérias endofíticas são obrigatórias, ou seja, são estritamente

dependentes da planta hospedeira para crescer e se desenvolver, sendo transmitidas

para outras plantas verticalmente ou via vetores. Mas existem também aquelas

facultativas, que tem um estágio de vida em que podem viver fora do hospedeiro,

geralmente no solo (HARDOIM; VAN OVERBEEK; VAN ELSAS, 2008). Estas últimas

constituem a maioria dos endófitos. Vivem no ambiente externo e de acordo com as

condições oferecidas, penetram e se estabelecem no interior do hospedeiro

(ROSENBLUETH; MARTINEZ-ROMERO, 2006). Ao se estabelecerem na planta,

frequentemente as bactérias endofíticas podem afetar as atividades fisiológicas do

hospedeiro, modulando seu crescimento, desenvolvimento, causando mudanças na

qualidade e produtividade da cultura (CONRATH et al., 2006; HOLLAND; LONG;

POLACCO, 2002; KLOEPPER; LIFSHITZ; ZABLOTOWICZ, 1989; STURZ; NOWAK,

2000a).

Os mecanismos pelos quais as bactérias beneficiam o hospedeiro incluem, entre

outros, o aumento da disponibilidade de nutrientes, indução de mecanismos de defesa

da planta, produção de antibióticos, competição com patógenos, produção de

fitohormônios e enzimas (GLICK, 1995; KLOEPPER; LIFSHITZ; ZABLOTOWICZ, 1989;

LODEWYCKX et al., 2002; VAN LOON; BAKKER, 2004).

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A existência do gênero Methylobacterium como endófito de várias culturas o

torna potencialmente interessante para aplicação agrícola. Vários estudos vêm

demonstrando os benefícios diretos dessas bactérias sobre o crescimento vegetal,

possivelmente pela produção de fitohormônios (KOENING; MORRIS; POLACCO, 2002;

LEE et al., 2006; MADHAIYAN et al., 2006; OMER et al., 2004b) e pela fixação de

nitrogênio (MADHAIYAN et al., 2004; MADHAIYAN et al., 2009a; SY et al., 2001). Além

disso, podem atuar como agentes de controle biológico de fitopatógenos, quando o

efeito benéfico sobre o crescimento vegetal seria indireto (MADHAIYAN et al., 2004;

MADHAIYAN et al., 2006).

A citricultura brasileira possui grande importância social e econômica, gerando

milhares de empregos diretos e indiretos, além de produtos para consumo interno e

para exportação. Ocupa uma área de 843.266 mil hectares, concentrada no Estado de

São Paulo, que participa com 78,42% da produção nacional de frutos (IBGE, 2010).

Levantamentos recentes da produção agrícola apontaram uma produção de 19.080.755

toneladas de laranjas em território nacional em fevereiro de 2010, com rendimento

médio da safra estimado em 22.627 (IBGE, 2010).

A atividade citrícola tem passado por vários ciclos de negócio que reflete em

fases de alta e baixa dos preços (NEVES; RUMJANEK, 2006). Porém, a importância

econômica da atividade para o país tem permitido a utilização de novas tecnologias, o

que tende a diminuir gastos com mão-de-obra. Por outro lado, o uso de fertilizantes e

defensivos exige um trabalho mais qualificado, gerando um aumento na produtividade

(AMARO; VICENTE; BAPTISTELLA, 2001), o qual, juntamente com o aumento da

qualidade dos pomares cítricos é obtido por meio da produção de mudas com o uso da

enxertia em viveiros comerciais (CASTRO; KERSTEN,1996). Cerca de 85% das plantas

cítricas estão enxertadas sobre limão-cravo (Citrus limonia Osbeck) (POMPEU

JÚNIOR, 2005). Mas atualmente existe uma diversificação de porta-enxertos, e sua

escolha deve recair sobre aquele que apresente maior resistência ou tolerância às

doenças do local do plantio (CARLOS, STUCCHI; DONADIO, 1997; POMPEU JÚNIOR,

2001).

Outra possibilidade de melhorar a produtividade ou a qualidade de pomares

cítricos seria o uso de bactérias endofíticas como promotoras de crescimento vegetal.

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Essa prática poderia ser empregada na fase de produção do porta-enxerto, visando

acelerar o crescimento e reduzir o período que a muda passa em viveiro. Devido à

importante associação com citros (ARAÚJO et al., 2002; LACAVA et al., 2004) e seu

potencial benéfico sobre diversas culturas, Methylobacterium spp. poderiam ser

empregadas para esse fim com chances de obtenção de resultados promissores.

Assim, o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar a possibilidade de

Methylobacterium spp. atuarem como promotoras de crescimento de plantas cítricas em

viveiro de produção comercial, mais especificamente: i) avaliar o efeito de

Methylobacterium spp. sobre a germinação de sementes de limão-cravo e tangerina

sunki; ii) avaliar o efeito de Methylobacterium spp. sobre o crescimento de mudas de

limão-cravo e tangerina sunki.

Referências

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