Avaliação de aspectos inatos e adaptativos do sistema imune na psoríase: análise fenotípica e... por Mariana Dias Batista - Versão HTML

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Mariana Dias Batista

Avaliação de aspectos inatos e adaptativos do sistema imune na psoríase: análise

fenotípica e funcional de células natural killer e células T

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do título

de Doutor em Ciências

Programa de Alergia e Imunopatologia

Orientador: Prof. Dr. Jorge Elias Kalil Filho

Coorientador: Prof. Dr. Esper Georges Kallás

São Paulo

2012

!

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

!reprodução autorizada pelo autor

Bati sta, Mariana Dias

Avaliação de aspectos inatos e adaptativos do sistema imune na psoríase: análise

fenotípica e funcional de células natural killer e células T / Mariana Dias Batista--

São Paulo, 2012.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Alergia e Imunopatologia.

Orientador: Jorge Elias Kalil Filho.

Coorientador: Esper Georges Kallas.

Descritores: 1.Psoríase 2.Imunidade inata 3.Células natural-killer 4.Antígenos

CD57 5.Imunidade adaptativa 6.Citocinas 7.NKG2A

USP/FM/DBD-348/12

!

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Maria do Carmo e Nildo,

pelo incentivo da vida toda, com amor e

gratidão.

!

AGRADECIMENTOS

Aos pacientes, por terem consentido em participar deste trabalho de forma altruísta, por

acreditarem que pesquisas na área da psoríase poderão contribuir na melhora da

qualidade de vida das pessoas afetadas.

Ao Prof. Dr. Esper Kallás, por todas as oportunidades oferecidas, por acreditar no meu

trabalho, por me fazer enxergar a possibilidade de ingresso no universo da pesquisa e,

mais que tudo, pelo acolhimento e amizade.

Ao Prof. Dr. Jorge Kalil, pelas boas palavras de orientação, pelo aprendizado, e pela

oportunidade de desenvolver meu projeto junto ao programa de Alergia e

Imunopatologia, com admiração.

Ao Prof. Dr. Douglas Nixon, pelo enorme aprendizado no período em que estive em seu

laboratório, pela possibilidade de desenvolver projeto relacionado à dermatologia mesmo

que esse não fosse o foco do laboratório, por dividir comigo seu entusiasmo com a

ciência e a pesquisa.

À Prof. Dra. Emily Ho, por ter me ensinado técnicas laboratoriais necessárias ao

desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Jeffrey Milush, pelas discussões, interpretações de resultados e

planejamento de experimentos.

À Prof. Dra. Emily Eriksson e à Vanessa York, pela experiência e trabalho conjunto.

À Dra. Camilla Tincati, pela assistência e colaboração nos experimentos funcionais.

À Prof. Dra. Karina Carvalho, pelo auxílio na interpretação dos resultados e pela leitura

crítica da metodologia.

Aos colegas da Dermatologia da UCSF, Drs. Patrick Unemori, Wilson Liao, Kieron

Leslie e Toby Maurer, pela colaboração e pelo recrutamento dos pacientes.

Aos membros da minha banca de qualificação, pelas sugestões valiosas no

aprimoramento do trabalho.

Aos colegas do LIM-60, pelas sugestões referentes à interpretação dos resultados e pelas

discussões produtivas.

Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Alergia e Imunopatologia, pelas

discussões produtivas nas reuniões.

À Ana Luiza Dias Batista, pelo auxílio na elaboração e edição das figuras.

Ao Thiago e à Alice.

!

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas e siglas

Lista de figuras

Lista de tabelas

Resumo

Summary

1 INTRODUÇÃO _____________________________________________________ 1

1.1 Epidemiologia, aspectos clínicos e histo-patológicos _________________________ 1

1.2 Fatores Genéticos _____________________________________________________2

1.3 Sistema Imune e psoríase _______________________________________________3

1.3.1 Imunidade Inata ___________________________________________________3

1.3.1.1

Queratinócitos, células dendríticas plasmocitóides, células NKT __________3

1.3.1.2

Células natural killer (NK) _______________________________________ 5

1.3.1.2.1 Desenvolvimento, diferenciação e aspectos funcionais de células NK ______5

1.3.1.2.2 Células NK na psoríase __________________________________________ 8

1.3.2 Imunidade Adaptativa ______________________________________________ 9

1.3.2.1

Células dendríticas mielóides e apresentação de antígeno _______________ 9

1.3.2.2

Células T residentes no tecido ____________________________________10

1.3.2.3

Células T CD4+: Th-1 e Th-17 ___________________________________ 11

1.3.2.4

Células T CD8+: Tc-1 e Tc-17____________________________________13

2 OBJETIVOS_______________________________________________________16

2.1 Objetivos gerais_____________________________________________________ 16

2.2 Objetivos específicos_________________________________________________ 16

3 METODOLOGIA___________________________________________________17

3.1 Casuística__________________________________________________________ 17

3.2 Processamento de amostras de pele______________________________________ 18

3.3 Processamento de amostras de sangue____________________________________ 20

3.4 Citometria de Fluxo__________________________________________________ 20

3.5 Sorting de células T CD4+ e CD8+______________________________________ 22

3.6 Cultura de células T__________________________________________________ 23

3.7 Ensaios de multiplex__________________________________________________23

3.8 Análise estatística ____________________________________________________24

4 RESULTADOS_____________________________________________________25

4.1 Manuscrito de artigo científico sobre células NK_________________________ 25

4.1.1 Folha de rosto ____________________________________________________25

4.1.2 Abstract_________________________________________________________26

4.1.3 Introduction______________________________________________________27

4.1.4 Methods_________________________________________________________30

4.1.5 Results__________________________________________________________32

4.1.6 Discussion_______________________________________________________40

4.1.7 References_______________________________________________________43

4.2 Manuscrito de artigo científico sobre células T___________________________47

4.2.1 Folha de Rosto___________________________________________________ 47

4.2.2 Abstract________________________________________________________ 48

!

4.2.3 Introduction_____________________________________________________ 49

4.2.4 Methods________________________________________________________ 50

4.2.5 Results_________________________________________________________ 54

4.2.6 Discussion______________________________________________________ 60

4.2.7 References______________________________________________________ 63

5 DISCUSSÃO_______________________________________________________67

5.1 Casuística __________________________________________________________67

5.2 Fenótipo de células NK_______________________________________________ 67

5.3 Fenótipo de células T CD8+____________________________________________70

5.4 Ensaios funcionais de células T_________________________________________ 71

6 CONCLUSÕES_____________________________________________________73

7 ANEXOS__________________________________________________________ 74

Anexo A Aprovação Comitê de Ética em Pesquisa UCSF_____________________74

Anexo B Aprovação Comitê de Ética em Pesquisa FMUSP___________________ 75

Anexo C Termo de Consentimento Livre e Esclarecido______________________ 76

Anexo D Comprovação de submissão ao periódico Experimental Dermatology___ 81

Anexo E Comprovação de submissão ao periódico PLoS One_________________82

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS__________________________________83

!

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CCL

C-chemokine ligand

CCR

C-chemokine receptor

CD

cluster of differentiation

CLA

cutaneous lymphocyte-associated antig!" !

CMSP

células mononucleares do sangue periférico

CMKLR

chemokine-like receptor

CMV

citomegalovírus

CXCL

CX-chemokine ligand

CXCR

CX-chemokine receptor

EDTA

ácido etilenodiamino tetra-acético

HIV

vírus da imunodeficiência humana

HLA

human leukocyte antigen

IFN

interferon

IL

interleucina

KIR

killer-cell immunoglobulin receptor

MHC

major histocompatibility complex

NF-!B

nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NK

natural killer

NKT

natural killer T

PBS

tampão fosfato

PMA

acetato de forbol miristato

SPE

exotoxina do Streptococcus pyogenes

SEB

enterotoxina estafilocócica B

Tc

células T citotóxicas

TCR

receptor de células T

Th

células T helper

TLR

toll like receptor

TNF

fator de necrose tumoral

!

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 – Mecanismos patogenéticos na psoríase____________________________15

Figura 3.1 – Determinação de tempo de cultura de células isoladas da pele__________19

Figura 3.2 – Estratégia de gating para citometria de fluxo_______________________ 22

Manuscrito 4.1

Figure 1 - Características fenotípicas de células NK CD56+CD16+ na psoríase______34

Figure 2 – Co-expressão de CD57, NKG2A e NKG2C em células NK CD56+CD16+_35

Supplemental figure 1 – Comparação de células NK CD56+CD16+ entre subtipos de

psoríase______________________________________________________________ 36

Figure 3 – Características fenotípicas de células NK CD56+CD16- na psoríase______38

Supplemental figure 2- Comparação de células NK CD56+CD16- entre subtipos de

psoríase______________________________________________________________ 39

Manuscrito 4.2

Supplemental Figure 1- Estratégia de gating, amostra de pele lesional_____________53

Figure 1- Distribuição de células T na pele lesional e não afetada de pacientes com

psoríase______________________________________________________________55

Figure 2 – Expressão de CD57 em células T na psoríase________________________56

Figure 3 – Produção de citocinas por células T CD4+ de pacientes com psoríase isoladas

por cell-sorting ________________________________________________________ 58

Figure 4 - Produção de citocinas por células T CD8+ de pacientes com psoríase isoladas

por cell-sorting ________________________________________________________ 58

Figure 5 – Correlação de níveis de IL-22 com outras citocinas___________________ 59

!

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 – Características amostrais e demográficas dos pacientes_______________17

Tabela 3.2 – Características amostrais e demográficas dos controles_______________18

Tabela 3.3 – Anticorpos utilizados para citometria de fluxo______________________21

Tabela 3.4- Anticorpos utilizados para sorting celular__________________________ 23

!

RESUMO

Batista MD. Avaliação de aspectos inatos e adaptativos do sistema imune na psoríase:

análise fenotípica e funcional de células natural killer e células T [Tese]. São Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2012.

INTRODUÇÃO: A psoríase é doença inflamatória hiperproliferativa da pele, na qual

mecanismos imunológicos são cruciais para o processo patogênico. O marcador CD57

denota inabilidade de replicação e imuno-senescência de células T CD8+, e sua expressão

foi demonstrada em diversas condições inflamatórias. CD57 também pode ser expresso

por células natural killer (NK), nas quais é considerado marcador de maturidade, por ser

em geral adquirido pelas formas mais diferenciadas CD56+CD16+. A expressão de

CD57 e outros receptores de células NK não foi amplamente investigada na psoríase.

OBJETIVOS: Este estudo buscou examinar o fenótipo de células NK em biópsias de pele

e células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com psoríase em

relação a controles sadios. Este estudo investigou também o fenótipo e características

funcionais de células T isoladas da pele lesional e não afetada de pacientes com psoríase.

MÉTODOS: Foram isoladas células NK dos subtipos CD56+CD16- e CD56+CD16+ de

pele lesional, não afetada e CMSP de pacientes com psoríase, comparadas com pele

normal e CMSP de controles sadios. A expressão de CD57, NKG2A e NKG2C foi

determinada nesses subtipos de células por citometria de fluxo. Células T CD4+ e CD8+

foram isoladas da pele lesional e não afetada de pacientes com psoríase, e a expressão de

CD57 foi avaliada. Características funcionais de células T foram estudadas através da

análise da secreção de diversas citocinas inflamatórias (IL-17A, IFN-", IL-2, IL-33, TNF-

#, IL-21, IL-22 and IL-27) produzidas por células T CD4+ e CD8+ isoladas por sorting

celular, a partir de amostras de pele lesional e não afetada de pacientes com psoríase.

RESULTADOS: Células NK isoladas das lesões de psoríase apresentaram um fenótipo

particular, caracterizado por baixa expressão de CD57 e alta expressão de NKG2A na

pele lesional e não afetada em relação aos controles. Em relação às células T, encontrou-

se frequência de células T CD4+CD57+ e CD8+CD57+ significativamente maior na pele

não afetada em relação à pele lesional de pacientes com psoríase. Células T CD4+

isoladas por sorting celular a partir de amostras de pele lesional produziram níveis

maiores de IL-17A, IL-22 e IFN-" em relação às amostras de pele não afetada. Células T

CD8+ isoladas da pele lesional secretaram maiores níveis de IL-17A, IFN-", TNF-# e IL-

2 em relação à pele não afetada. CONCLUSÕES: Esses dados sugerem que células NK

presentes nas lesões de psoríase apresentam fenótipo imaturo, que foi previamente

associado a maiores capacidades funcionais, e poderiam ser implicadas na patogênese da

psoríase. Em relação às células T, as características fenotípicas sugerem menor

sobrevivência de células com baixa capacidade replicativa na pele lesional, pelo ambiente

inflamatório local ou pelo alto turnover celular da psoríase.

Descritores: psoríase, imunidade inata, células natural-killer, antígenos CD57, imunidade

adaptativa, citocinas, NKG2A

!

SUMMARY

Batista MD. Innate and adaptive features of the immune system in psoriasis: phenotypic

and functional analyses of natural killer cells and T cells [Thesis]. São Paulo: Faculdade

de Medicina, Universidade de São Paulo; 2012.

INTRODUCTION: Psoriasis is a hyper-proliferative inflammatory disease of the skin in

which immunological mechanisms play a direct role in disease pathogenesis. CD57 is a

marker of replicative inability and immunosenescence on CD8+ T cells and its expression

is increased in a number of inflammatory conditions. CD57 is also expressed by NK cells

and is considered a marker of NK cell maturity, being acquired by more differentiated

CD56+CD16+ NK cells. The expression of CD57 and other NK cell markers in psoriasis

has not been thoroughly investigated. OBJECTIVES: This study sought to examine the

phenotype of NK cells in skin biopsies and peripheral blood mononuclear cells (PBMC)

from patients with psoriasis and healthy controls. We also investigated the phenotype and

functional characteristics of T cells from psoriasis patients, comparing lesional and

unaffected skin. METHODS: CD56+CD16- and CD56+CD16+ NK cells were isolated

from lesional skin, unaffected skin and PBMC of psoriasis patients, and normal skin and

PBMC from healthy controls. The expression of CD57, NKG2A, and NKG2C was

assessed by flow cytometry. CD57 expression was also determined on T cells from

lesional and unaffected skin by flow cytometry. We assessed functional characteristics of

T cells by evaluating the secretion of several inflammatory cytokines (IL-17A, IFN-", IL-

2, IL-33, TNF-#, IL-21, IL-22 and IL-27), from cell-sorted purified CD4+ and CD8+ T

cells isolated from lesional and unaffected skin of psoriasis patients, by multiplex assays.

RESULTS: NK cells in psoriasis skin lesions exhibited a distinct phenotype, with CD57

expression significantly reduced and NKG2A expression increased on NK cells in

lesional and unaffected skin compared to controls. In relation to T cells, we observed that

the frequency of CD57+CD4+ and CD57+CD8+ T cells was significantly increased in

unaffected skin of psoriasis patients compared to lesional skin. Sorted CD4+ T cells from

psoriasis lesional skin produced higher levels of IL-17A, IL-22 and IFN-" compared to

unaffected skin. CD8+ T cells isolated from lesional skin produced higher levels of IL-

17A, IFN-", TNF-# and IL-2 compared to unaffected skin. CONCLUSIONS: These data

suggest that NK cells in psoriasis lesions exhibit an immature phenotype, that has been

previously associated with higher functional abilities, and could implicate NK cells in

psoriasis pathogenesis. For T cells, the findings of this study suggest lower survival of

cells with low replicative ability in lesional skin, due to the local inflammatory

environment or to the high cellular turnover in psoriasis.

Key words: psoriasis, innate immunity, natural killer cells, CD57, adaptive immunity,

cytokines, NKG2A

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Epidemiologia, aspectos clínicos e histopatológicos

A psoríase é doença inflamatória cutânea caracterizada por aumento do turnover

celular, diminuição da diferenciação de queratinócitos e desequilíbrio imunológico

(1). Sua prevalência varia entre 2 e 3% da população (2) e caracteriza-se por pápulas e

placas eritematosas recobertas por escamas branco-acinzentadas (1, 3). As escamas

resultam de epiderme hiperproliferativa, que se inicia com aumento do índice mitótico

dos queratinócitos basais, seguido por maturação prematura de queratinócitos na

camada espinhosa, e retenção dos núcleos na camada córnea, levando ao achado

histopatológico característico de paraqueratose (1, 4). Em decorrência do caráter

hiperproliferativo da doença, o turnover epidérmico, que na pele normal é estimado

em 40 dias, está acelerado para 4-6 dias na psoríase (5, 6). A forma mais comum da

doença, denominada psoríase vulgar, ocorre em 85-90% dos pacientes; outras

variantes clínicas incluem a psoríase em gotas ou gutata e a psoríase pustulosa (3).

Sua causa é multifatorial, com contribuição de efeitos ambientais em indivíduos

geneticamente predispostos, havendo diversos fatores desencadeantes, que incluem

estresse (7, 8), medicações como lítio, antimaláricos, indometacina e beta-

bloqueadores (9), doenças infecciosas recentes (especialmente para a forma gutata)

(7), fumo (10), alta ingesta de álcool (11) e ferimentos cutâneos (fenômeno de

Koebner). A psoríase pode evoluir com comprometimento articular, que ocorre em 5 a

40% dos pacientes (12, 13). Embora a psoríase não acarrete risco de vida, tem curso

crônico e impacta diretamente na qualidade de vida dos indivíduos acometidos, que

têm maior risco de isolamento social e depressão (14-16). Pacientes com psoríase

apresentam síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e neoplasias em

prevalência aumentada, que apontam para o caráter inflamatório sistêmico da doença

(3, 17, 18).

O estudo de aspectos imuno-patológicos da psoríase contribui para a elucidação de

possíveis fatores causais e colabora para o desenvolvimento de arsenal terapêutico.

2

1.2 Fatores Genéticos

O estudo dos genes implicados na susceptibilidade à doença pode elucidar

mecanismos patogenéticos e apontar alternativas terapêuticas (19). O principal

determinante genético da psoríase está localizado na região do MHC do cromossomo

6, no locus PSORS1 (20, 21), porém 9 loci cromossômicos podem ser associados à psoríase, denominados PSORS1 a PSORS9 (22). Nesta região, o HLA-C*06:02 está

mais intensamente associado à psoríase (23). Há grande variabilidade genética entre

os subtipos de psoríase, com maior associação do gene PSORS1 à forma gutata da

doença (24). Entre populações de caucasianos, o alelo HLA-Cw6 confere maior efeito

genético, especialmente em casos de psoríase de início recente (25, 26).

Múltiplos outros loci já foram identificados como fatores de risco para o

desenvolvimento da psoríase, incluindo polimorfismos nos genes do receptor de IL-23

e seu ligante, IL-12B (27-29), além de outros genes, como CDKAL1, associado

também à doença de Crohn e diabetes mellitus, ADAM33, PTPN22 (30-32) e outros,

principalmente associados ao eixo IL-23/IL-17, a via NF-!B, e o complexo de

diferenciação epidérmico (29, 33). Recentemente, mutações no gene CARD14, que

codifica um regulador epidérmico de NF-!B, foram associadas à psoríase, e

correspondem ao locus PSORS2. Queratinócitos que contêm essas mutações são

capazes de incitar resposta inflamatória a partir da ativação de genes responsivos a

NF-!B (34, 35).

A complexidade da genética da psoríase levou ao desenvolvimento de escores de risco

genético globais ( global genetic risk scores), que levam em conta o risco associado a

diversos loci potencialmente implicados, com aumento na capacidade preditiva de

doença (36). Neste sentido, na psoríase há dominância do HLA-C como fator de risco,

uma vez que esse teve isoladamente risco equivalente a outros 9 loci combinados em

estudo de escore de risco genético global (37).

A associação entre HLA-C e psoríase é interessante a partir da perspectiva de implicar

as células natural killer (NK) na patogênese da doença. Os alelos do HLA-C

codificam ligantes para os receptores KIR ( Killer Cell Immunoglobulin Receptors)

expressos por células NK. A interação entre HLA-C e KIR foi investigada na

3

psoríase, e há associação entre a expressão do receptor ativador de células NK

KIR2DS1 com psoríase vulgar e artrite psoriática (38, 39).

1.3 Sistema Imune e Psoríase

Apesar da importância das alterações epiteliais na psoríase, a contribuição de

alterações do sistema imune para a patogênese da doença é evidente. Células T e

dendríticas presentes em grandes números nas lesões psoriáticas, aliadas ao sucesso

terapêutico obtido com drogas imunossupressoras falam fortemente a favor do

conceito de doença inflamatória imuno-mediada (1). A interação entre fatores

ambientais desencadeantes em indivíduos geneticamente predispostos inicia uma

cascata de eventos que englobam tanto mecanismos da imunidade inata como

adaptativa, e culminam com a ativação da doença.

1.3.1 Imunidade Inata

1.3.1.1 Células dendríticas plasmocitóides, queratinócitos, células NKT

Após a exposição da epiderme aos fatores desencadeantes (infecções, estresse, fumo,

drogas, trauma), os queratinócitos lesados liberam catelicidina LL-37 e outros

peptídeos antimicrobianos, como beta-defensinas e psoriasina (S100A7), envolvidos

na função de barreira e defesa da pele (40, 41). Peptídeos antimicrobianos também

podem ser produzidos por bactérias comensais da pele como Staphylococcus

epidermidis, e na psoríase alterações da flora microbiana poderiam aumentar a

expressão de catelicidinas e beta-defensinas que contribuem para o processo

inflamatório (41). Os peptídeos antimicrobianos se complexam a fragmentos de DNA

ou RNA próprios, liberados na pele após lise ou morte celular (42, 43). Estes

complexos de DNA/RNA próprios associados a LL-37 podem ativar células

dendríticas plasmocitóides a produzir IFN-", de maneira dependente de TLR-9.

Assim, o DNA do hospedeiro pode se transformar em estímulo pró-inflamatório que

quebra a tolerância imunológica, contribuindo para a cascata inflamatória (43). LL-37

também pode induzir aumento da expressão de TLR-9 por queratinócitos, e em

queratinócitos expostos ao ligante de TLR-9 CpG DNA, a produção de IFN tipo I é

aumentada por LL-37 (44).

4

As células dendríticas plasmocitóides estão presentes e ativadas em lesões precoces

de psoríase, e o IFN-" pode agir como indutor de lesões de psoríase (45). Além da

ativação por peptídeos antimicrobianos, as células dendríticas plasmocitóides podem

ser ativadas por outros mecanismos. A interação entre a quemerina e seu ligante, o

receptor ChemR23 (também conhecido como CMKLR1- chemokine-like receptor 1),

é responsável pela migração de células dendríticas plasmocitóides para os tecidos. A

expressão de quemerina está aumentada em fibroblastos dérmicos, mastócitos e

células endoteliais nas fases iniciais da psoríase, em paralelo à infiltração de células

dendríticas plasmocitóides e neutrófilos. Por outro lado, lesões crônicas de psoríase

têm baixa expressão de quemerina (46). A histamina também pode influenciar a

migração das células dendríticas plasmocitóides para a pele lesional na psoríase, em

resposta à estimulação do receptor de histamina H4R (47).

Os queratinócitos têm papel fundamental na patogênese da psoríase. Além de sua

diferenciação alterada acarretar hiperplasia epidérmica e paraqueratose, também

funcionam como efetores diretos da resposta imune (48). Os queratinócitos

respondem às citocinas presentes nas lesões de psoríase (IFN-#, TNF-", IL-17)

através da produção de IL-1$, IL-6 e TNF-", e expressão quimiocinas, como CCL20,

CXCL9, CXCL10 e CXCL11, que induzem a migração de células dendríticas

mielóides e células T efetoras para as lesões (48, 49). IL-17 e IL-22, presentes no

ambiente inflamatório da psoríase, aumentam a produção de peptídeos

antimicrobianos por queratinócitos, e assim intensificam a resposta inflamatória (50).

Outro tipo celular que pode ter participação na resposta imune inata na psoríase são as

células natural killer T (NKT). Estas células são linfócitos que além de expressarem o

receptor de células T (TCR), expressam também moléculas clássicas de células NK,

como CD56, CD16, CD161 e CD94 (51). São ativadas por antígenos glicolipídicos

apresentados pela molécula CD1d. O CD1d pode ser expresso por queratinócitos, e na

psoríase na pele lesional sua expressão está aumentada (52). A cultura concomitante

de células NKT com queratinócitos leva à produção de grandes quantidades de IFN-#,

podendo contribuir para o ambiente inflamatório na psoríase (52). Há evidências que

apontam para a presença de números aumentados de células NKT nas lesões de

psoríase, porém os mecanismos patogenéticos ainda não foram totalmente elucidados

(51).

5

1.3.1.2 Células natural killer (NK)

1.3.1.2.1 Desenvovimento, diferenciação e aspectos funcionais de células NK

As células natural killer (NK) são linfócitos tradicionalmente classificados como

pertencentes à resposta imune inata, por sua capacidade de responder rapidamente às

células alvo tumorais ou infectadas por vírus sem necessidade de sensibilização prévia

(53). São caracterizadas pelo fenótipo CD3- CD56+ (54). Assim como células T e B,

as células NK são provenientes de células progenitoras linfóides, e dependem de

citocinas como IL-15 para seu desenvolvimento e maturação (55). A partir de células

NK imaturas, apenas aquelas que se tornam tolerantes a antígenos próprios no

processo de maturação são capazes de desempenhar função efetora na periferia (56).

As células NK migram para locais de infecção ou inflamação em resposta à expressão

aumentada de quimiocinas, e produzem níveis consideráveis de IFN-# e TNF-" em

resposta a estímulos mediados por receptores ativadores ou citocinas pró-

inflamatórias (57). Além de sua capacidade de produção de citocinas, as células NK

têm em comum com as células T CD8+ a capacidade citotóxica mediada por perforina

e granzimas (53, 57).

As células NK expressam um repertório heterogêneo de receptores inibitórios e

ativadores, que são responsáveis pelo seu processo de maturação e pela regulação de

sua função efetora na periferia (58). Dentre os receptores expressados, encontram-se

as lectinas tipo C, que incluem o receptor inibitório NKG2A e o receptor ativador

NKG2C, além do receptor ativador NKG2D, cujos ligantes são as moléculas MICA e

MICB (59). Os receptores NKG2A e NKG2C têm uma ação imunoregulatória através

de sua ligação ao HLA-E (60). O receptor inibitório NKG2A se liga ao HLA-E com

maior afinidade que o receptor ativador NKG2C, o que determina um resultado

predominantemente inibitório nos casos de co-expressão (60, 61). Durante o processo

de maturação das células NK, há uma tendência à maior expressão de NKG2C em

relação ao NKG2A (62). Outros receptores expressos por células NK incluem

receptores de citotoxicidade natural, como NKp46, NKp44, NKp30, e os receptores

KIR ativadores ou inibitórios (59).

6

Dentre os mecanismos centrais de defesa do sistema imune contra células infectadas

por vírus, encontra-se o reconhecimento direto por células T citotóxicas através de

antígenos apresentados pelo MHC classe I (63). Alguns patógenos desenvolveram

mecanismos de evasão, nos quais interferem com o processamento ou apresentação de

antígenos, levando à diminuição da expressão da molécula de MHC classe I na

superfície, para assim prevenir o reconhecimento e lise por linfócitos T citotóxicos

(63). As células NK têm a capacidade de lise de células que não expressam o MHC

classe I, sendo importantes na contenção dos mecanismos de evasão viral. Assim, se a

célula NK entra em contato com uma célula normal, que expressa a molécula de

MHC classe I, seus receptores inibitórios ligam-se à molécula de MHC e previnem a

lise. Por outro lado, quando encontram células tumorais ou transformadas por vírus

que não expressam a molécula de MHC, não há ligação do receptor inibitório de NK,

e há ligação direta de receptores ativadores que determinam a lise da célula alvo (64).

As células NK são divididas em dois subtipos de acordo com sua expressão de CD56

e CD16. O fenótipo CD56bright CD16- representa o subtipo mais imaturo e

corresponde a 10% das células NK no sangue periférico, sendo fonte importante de

citocinas após o reconhecimento das células-alvo (65). Já as células CD56dim CD16+

correspondem a 90% das células NK no sangue periférico (66). O processo de

diferenciação das células NK pode ser caracterizado nas fases mais imaturas pela alta

expressão de CD56 em associação ao receptor inibitório NKG2A, sem a presença de

CD16, passando para o fenótipo mais diferenciado no qual há expressão de CD56 e

CD16 associado a CD57. À medida que as células NK se tornam mais diferenciadas,

perdem sua capacidade de replicação in vitro. Assim, células NK CD57+ têm baixa

capacidade de replicação e são menos responsivas a estímulo por IL-12 e IL-18 que as

células NK mais imaturas CD57- (67, 68).

CD57, também conhecido como HNK-1 ou Leu-7, é um glicoepítopo presente em

glicoproteínas de células do sistema nervoso, como por exemplo moléculas de adesão

(69). Em linfócitos, pode ser expresso por células T CD4+ ou CD8+ e por células NK,

e sua expressão indica senescência replicativa ou exaustão clonal, que se caracterizam

por alta susceptibilidade à morte celular, inabilidade de novos ciclos celulares, com

capacidade preservada de secreção de citocinas (70). Outro marcador de senescência

em linfócitos inclui a redução da expressão de CD28, porém a expressão de CD57 é

considerada mais sensível que os demais marcadores para identificar células com

7

instabilidade proliferativa (71, 72). A expressão de CD57 se correlaciona diretamente

com o número de divisões celulares e inversamente com o comprimento do telômero,

e assim denota células que sofreram maior número de divisões (70).

As células senescentes, que expressam CD57, podem se acumular em diversas

condições patológicas (69). O acúmulo dessas células, apesar de sua baixa capacidade

replicativa, é possível através da alteração de mecanismos de apoptose (72). Células

CD57+ são mais sensíveis a apoptose espontânea in vitro que células CD57-, por

expressarem Fas/ Fas ligante, porém em condições como a infecção por HIV há

redução da apoptose concomitante ao aumento de expressão de CD57 (73). A

expressão de receptores inibitórios de NK, como NKG2A, poderia justificar a redução

da susceptibilidade das células CD57+ à apoptose, por induzir ao aumento da

produção da molécula anti-apoptótica Bcl-2 (74, 75).

O conceito de que as células NK participam apenas da resposta imune inata está

atualmente em questionamento devido a relatos iniciais de memória em células NK

(76). Foi demonstrada expansão clonal de células NK após infecção viral por

citomegalovírus (CMV) em camundongos e humanos, e após exposição a haptenos

químicos na dermatite de contato alérgica (62, 77, 78). Estas células NK previamente

sensibilizadas ao antígeno possuem características de memória, como vida média

aumentada e capacidade de mediar respostas imunes secundárias (53). Na infecção

murina por CMV, há expansão clonal de células NK que expressam o marcador

Ly49H, que se liga de forma específica à molécula m157 presente em células

dendríticas infectadas por CMV. Após o período de expansão clonal, estas células NK

Ly49H+ passam por fase de contração e são capazes de nova resposta nas re-

exposições ao vírus (78). Na infecção humana por CMV, observa-se expansão clonal

de células NK que expressam NKG2C, o que poderia indicar mecanismo de memória,

porém o ligante viral ainda não foi identificado (62). As células NK NKG2C+ que

expandem após infecção por CMV adquirem CD57 progressivamente e em maior

magnitude que células NKG2C-, o que poderia denotar que CD57 seria um marcador

de células NK que foram levadas a expansão clonal após encontro com patógenos (79,

80). A resposta de memória em células NK está associada a estimulação com

combinações de IL-12, IL-15 e IL-18, e células NK pré-ativadas com essas citocinas

exibem produções significativamente maiores de IFN-# em relação àquelas que não

sofreram pré-ativação (81). O fenótipo associado à maior produção de IFN-# após a

8

pré-ativação in vitro incluiu expressão de CD94, NKG2A, NKp46 e CD69, associado

à baixa expressão de KIR e CD57 (81).

1.3.1.2.2 Células NK na psoríase

A ação das células NK na patogênese da psoríase é ainda pouco estudada. Células NK

são pouco encontradas na pele normal de indivíduos sadios (82). Na pele lesional de

pacientes com psoríase, células NK foram demonstradas na junção dermo-epidérmica,

e poderiam agir sem sensibilização prévia, através da liberação de IFN-# e, em

conjunto com células dendríticas plasmocitóides e mielóides, contribuir para as etapas

iniciais do processo de formação das placas (83, 84). Células dendríticas mielóides

presentes na psoríase podem contribuir para a ativação de células NK através da

secreção de citocinas, especialmente IL-12, potente ativador da produção de IFN-#

por células NK (85), e IL-23, que além de determinar a diferenciação de células T

CD4+ em Th-17, age sobre células NK induzindo a produção de IL-22, citocina

também implicada na patogênese da psoríase (86).

Células NK já foram isoladas na pele lesional na psoríase, e correspondem a 5-8% das

células encontradas no infiltrado inflamatório local (84). Essas células pertenciam

principalmente ao subtipo CD56bright, correpondendo a células NK mais imaturas

com maior capacidade de secreção de citocinas, e expressavam o marcador de

ativação CD69. Os sobrenadantes destas células estimuladas por IL-2 determinaram

nos queratinócitos a expressão de quimiocinas como CXCL10, CCL5 e CCL20, que

são responsáveis pela migração de células NK para a pele. Por sua vez, as células NK

presentes nas lesões de psoríase apresentaram alta expressão de CXCR3 e CCR5,

ligantes para CXCL10 e CCL5 respectivamente, e moderada expressão de CCR6,

ligante de CCL20, o que poderia justificar a migração destas células para a pele (84).

Os receptores CXCR3, CCR5 e CCR6 também foram implicados na migração de

células NK para a pele na dermatite de contato alérgica (87, 88).

O subtipo de células NK CD56dim CD16+ também pode migrar para a pele e outros

tecidos em momentos de inflamação. Esta migração, de maneira semelhante às células

dendríticas plasmocitóides, é guiada pela interação entre a quemerina e seu receptor,

Chem 23 ou CMKLR1, expresso por células NK CD56dim CD16+ (89). Na psoríase,

foi demonstrada a presença da quemerina na pele lesional, e foi também demonstrada

9

a migração de células NK CD56dim CD16+ isoladas de PBMCs em resposta à

quemerina (90).

Há controvérsias a respeito do comportamento das células NK presentes na circulação

nos pacientes com psoríase. Alguns estudos encontraram redução na frequência de

células NK CD56bright e CD56dim circulantes em pacientes com psoríase em relação

aos controles (83, 91), que poderia decorrer da migração preferencial destas células

para os tecidos inflamados, ou de uma menor sobrevivência destas células devido às

condições inflamatórias crônicas (91). Por outro lado, outros relatos encontraram

níveis normais de células NK circulantes em pacientes com psoríase e controles (88,

90, 92). Nas células NK circulantes de pacientes com psoríase, há aumento da

expressão do receptor Fas, que ao se ligar ao seu receptor Fas-ligante induz a

apoptose e aumento da produção de TNF-", citocina chave no processo inflamatório

na psoríase (92). Foi também descrita diminuição da expressão de NKG2A em

células NK e células T circulantes em casos de psoríase de início recente (até 1 ano de

história), enquanto em casos de psoríase crônica em placas foi evidenciado aumento

da expressão de NKG2A em células T (92, 93).

1.3.2 Imunidade Adaptativa

1.3.2.1 Células dendríticas mielóides e apresentação de antígeno

Após a ativação inicial das vias de imunidade inata, o IFN-" liberado pelas células

dendríticas plasmocitóides ativa outro subtipo de células dendríticas dérmicas,

conhecidas como células dendríticas mielóides. Nas lesões de psoríase há números

aumentados de células dendríticas mielóides, que ativam células T e têm capacidade

pró-inflamatória através da produção de TNF-" e óxido nítrico (94, 95). Células

dendríticas mielóides ativadas migram da pele para o linfonodo, para apresentar um

antígeno ainda não determinado para células T, levando à diferenciação das células

naïve a células efetoras, que são capazes de desempenhar citotoxicidade e produção

de citocinas (96). Na psoríase, a diferenciação se dá para células CD4+ T helper

subtipos 1 e 17 (Th-1 e Th-17, respectivamente), e para células CD8+ T citotóxicas

subtipos 1 e 17 (Tc-1 e Tc-17, respectivamente) (97).

10

A pesquisa do antígeno que desencadeia o processo imune na psoríase levou a

diversas hipóteses, ainda sem resultados conclusivos. Algumas evidências apontam

para a hipótese de mimetismo molecular, através do qual peptídeos derivados de

patógenos, com similaridades a antígenos próprios, ativam células T ou B auto-

reativas (98).

A psoríase, em especial a forma gutata, pode ser desencadeada após infecções

estreptocócicas. Especula-se se superantígenos possam estar envolvidos nesse

processo. SPE-C (exotoxina do Streptococcus pyogenes tipo C), que é produzida por

cepas de estreptococos isoladas de culturas de secreção faríngea de pacientes com a

forma gutata da psoríase, induz a expansão de células T V$2+, que ao serem ativadas

podem expressar o marcador CLA ( cutaneous lymphocyte-associated antigen),

responsável pela migração para a pele e indução de lesões (99, 100). A partir daí, até

70% dos pacientes com lesões de psoríase em gotas podem evoluir para a psoríase

vulgar (101). Isto se deve à permanência de células T ativadas na pele, por mimetismo

molecular, através de homologias entre sequências da proteína M estreptocócica e a

queratina tipo 1 (102). Superantígenos estafilocócicos como SEB (enterotoxina

estafilocócica B) também podem participar da psoríase: sua presença está associada a

apresentações clínicas mais graves da doença (103).

1.3.2.2 Células T residentes no tecido

Na primeira exposição a patógenos ou antígenos presentes na pele, as células

dendríticas migram para os linfonodos, onde apresentam o antígeno a células T naïve,

que se diferenciam em células T de memória efetoras, com função de migração para a

pele para combate ao antígeno, e células de memória central, que serão ativadas nas

exposições subsequentes ao mesmo antígeno (104). As células T de memória efetora

que migram para a pele são encontradas em maior concentração no local de exposição

ao antígeno, mas estão presentes em toda a superfície cutânea (105).

Essas células T de memória efetoras residem no tecido, não entram em circulação e

ficam presentes na pele, preparadas como primeira linha de defesa na exposição a

antígenos. Assim, a resposta imune cutânea na re-exposição ao antígeno ocorre

através de três mecanismos. Primeiramente, células T de memória efetoras residentes

na pele iniciam a resposta diretamente. Além disso, há também o recrutamento de

11

células T circulantes, que migram para a pele através do aumento de expressão de

receptores de adesão vasculares durante a inflamação. Por fim, ocorre a migração de

células dendríticas apresentadoras de antígeno para o linfonodo, onde há novo

estímulo para a proliferação de células T de memória central, gerando células T de

memória efetoras que migrarão para a pele e contribuirão para a resposta imune (104).

Estes conceitos foram demonstrados através de experimentos nos quais se

transplantou pele não-afetada de pacientes com psoríase a camundongos

imunodeficientes, e se observou a presença de placas psoriáticas típicas, enquanto o

transplante de pele normal de indivíduos controles não induziu a formação das lesões

(106). O desenvolvimento de placas psoriáticas foi dependente da ativação e

proliferação de células T residentes no tecido, presentes mesmo na pele não-afetada,

que foram estimuladas a entrar em atividade no local por IFN-" produzido por células

dendríticas plasmocitóides em reação ao trauma do transplante (107).

As células T CD4+ e CD8+ presentes nas lesões de psoríase apresentam fenótipo

compatível com memória, por apresentarem a expressão do receptor CD45RO (108).

Há expansão seletiva de células T com a mesma especificidade antigênica,

caracterizando populações oligoclonais, caracterizadas por aumento da expressão de

genes das subfamílias V$2 e V$6 do TCR, o que sugere que estas células respondem

a um mesmo antígeno ainda não identificado (109). Outros estudos que falam a favor

da oligoclonalidade das células T nas lesões de psoríase identificaram restrição no

tamanho de subfamílias V$ da região complementar determinante 3 (CDR3) do TCR,

associadas à expansão oligoclonal de subfamílias V$ distintas em cada paciente, o

que sugere que para cada paciente um antígeno específico é responsável pela ativação

das células T levando às lesões de psoríase (110).

1.3.2.3 Células T CD4+: Th-1 e Th-17

A psoríase, assim como outras afecções auto-imunes, foi inicialmente classificada

como doença mediada por resposta Th-1, pois há nas lesões grande produção de IFN-

#, IL-2 e TNF-", citocinas classicamente caracterizadas como participantes do

espectro Th-1 (111, 112). As células T CD4+ naive se diferenciam em células Th-1

quando estimuladas por IL-12, e passam a expressar as quimiocinas CXCR3, CCR5,

CXCR6, que direcionam seu padrão migratório (113). A presença de IFN-# no

12

ambiente inflamatório da psoríase leva à expressão aumentada de CXCL9, CXCL10 e

CXCL11 por queratinócitos, que interagem com o receptor CXCR3 presente em

células Th-1 determinando sua migração para as lesões (114).

Mais recentemente, múltiplas evidências enfatizam a importância de outro subgrupo

de células T CD4+, as células Th-17, na patogênese da psoríase. Após a migração de

células dendríticas mielóides da pele para o linfonodo, estas passam a produzir IL-23,

que também é produzida por queratinócitos, e participa da diferenciação e

proliferação de células Th-17 (115, 116). Além de IL-23, outras citocinas como TGF-

$1, IL-6 e IL-21 são necessárias para a diferenciação de células T CD4+ naïve para

Th-17 (117). A presença de níveis elevados de IL-23 e IL-17 em lesões de psoríase,

além da associação de genes relacionados ao receptor de IL-23 com psoríase, apontam

a relevância do eixo IL-23/ Th-17 na patogênese da doença (113).

As células Th-17 são estimuladas por IL-23 e podem ser caracterizadas pela expressão

de CCR6, CCR4, IL-23R e CD161 (118-120). Produzem IL-17A, IL-17F além de

outras citocinas como IL-22 e IL-26 (121). IL-17 está implicada na psoríase, já que os

níveis de RNA-mensageiro de IL-17 estão aumentados na pele lesional de pacientes

com psoríase em relação aos controles (97). A presença de IL-17 contribui para a

liberação de citocinas inflamatórias por queratinócitos, induz angiogênese e expressão

de peptídeos antimicrobianos, e leva à expressão de quimiocinas como CCL20,

CXCL1, CXCL3 e outras, que contribuem para a migração de neutrófilos para a pele

(97, 114, 121). Estudos clínicos recentes com anticorpos monoclonais que bloqueiam

especificamente a IL-17 (ixekizumab) ou o seu receptor (brodalumab) encontram-se

em fase 2 de experimentação clínica com resultados promissores, o que ressalta a

importância desta citocina na patogênese da doença (122, 123).

Outra citocina relevante para a psoríase é a IL-22, que também pode ser produzida por

células T CD4+ Th-17 ou por células T CD8+ (124, 125). IL-22 tem efeitos anti-

apoptóticos e indutores de proliferação através da via Stat-3 (126). Seus efeitos na

psoríase incluem a indução de proliferação de queratinócitos, através da diminuição

da expressão de genes de diferenciação como queratina 1 e filagrina (114). IL-22 pode

também induzir peptídeos anti-microbianos como beta-defensinas (127). Na psoríase

a expressão de RNA-mensageiro de IL-22 está aumentada na pele lesional e níveis

séricos de IL-22 são correlacionados à gravidade da doença (120, 128). O subgrupo

13

de células T CD4+ que produzem IL-22 mas não produzem IL-17 foram denominadas

Th-22, e podem também participar da patogênese da psoríase (129).

As células T CD4+ podem também produzir IL-21, cuja expressão está aumentada na

pele lesional de pacientes com psoríase (130). A IL-21 pode também ser produzida

por células NKT, e níveis séricos elevados de IL-21 estão associados com a gravidade

da psoríase (130, 131). O receptor de IL-21 é expresso por queratinócitos, células T e

B, e também por células NK. Assim, IL-21 poderia contribuir para a ativação desses

outros grupos celulares na psoríase (130).

Outras citocinas possivelmente implicadas na patogênese da psoríase são IL-27,

produzida por células apresentadoras de antígeno, e IL-33, produzida principalmente

por células endoteliais (132, 133). Pacientes com psoríase apresentam aumento dos

níveis séricos de IL-27 em relação a controles sadios, que se correlacionam com a

gravidade da doença, e IL-27 induz diferenciação Th-1 enquanto suprime

diferenciação Th-2 e Th-17 (132). A expressão de mRNA de IL-33 está aumentada na

pele lesional e não afetada de pacientes com psoríase, e poderia estimular mastócitos

localmente (133).

1.3.2.4 Células T CD8+: Tc-1 e Tc17

Células T CD8+ localizam-se preferencialmente na epiderme e derme papilar de

pacientes com psoríase (134). A migração das células T CD8+ da derme para a

epiderme depende da interação entre a integrina "1-$1, presente nas células T e o

colágeno tipo IV, presente na membrana basal, e é considerada evento chave na

patogênese da psoríase (1). Células T CD8+ presentes na epiderme podem contribuir

para a patogênese da psoríase através do reconhecimento de antígenos próprios ou

externos presentes localmente, com contribuição para o processo inflamatório (125).

Células T CD8+ que expressam IL-17 estão presentes em número aumentado nas

lesões de psoríase, e produzem TNF-", IFN-#, IL-22 e IL-21 (125, 135). Células T

CD8+ IL-17+, denominadas Tc-17, têm características fenotípicas e funcionais

semelhantes às células Th-17, enquanto células T CD8+ IL-17- são mais semelhantes

às células Th-1 (135). Foi também demonstrada em frequência aumentada nas lesões

de psoríase a presença de células T CD8+ que expressam IL-22 (125).

14

As células T CD8+ podem apresentar expressão de marcadores específicos que

denotam exaustão clonal e estimulação antigênica crônica. Após múltiplas divisões

celulares, as células tornam-se incapazes de manter as mitoses, e passam a expressar

CD57 (69). Células T CD8+ expressam CD57 em diversas condições de ativação

imunológica crônica, como infecções virais, doenças inflamatórias e malignidades,

além de aumentarem após exercício físico intenso e no processo natural de

envelhecimento (136-140). Apesar de não serem capazes de proliferação e terem

sobrevivência limitada, as células T CD8+CD57+ mantêm sua capacidade citotóxica,

já que apresentam aumento da expressão de genes de citotoxicidade, como perforina,

granulolisina e granzima B, além de serem capazes de alta produção de IFN-# e TNF-

" após estimulação, sendo possivelmente destinadas a migrar para tecidos não-

linfóides (69, 70, 141, 142). Estas características determinam a senescência replicativa

que ocorre em condições de ativação celular crônica, como a infecção pelo HIV (70).

Alteração dos mecanismos de apoptose poderia justificar a expansão dessas células

CD57+ em condições de estimulação antigênica crônica. A heat shock protein 27

(HSP-27) é proteína protetora contra o estresse celular, e sua produção está diminuída

em células CD8+CD57+ em relação às células CD8+CD57-. Esta diminuição de

HSP-27 em linfócitos mais maduros poderia justificar o aumento de susceptibilidade

dessas células à morte celular induzida por ativação, um dos mecanismos clássicos de

apoptose (72). A presença e função de células T CD8+ CD57+ na psoríase não é bem

conhecida.

A figura 1.1 sintetiza os diversos mecanismos que convergem para a patogênese da

psoríase.

15

Predisposição Genética

HLA-C

IL-23R

Queratinócitos

IL-12B

lesados liberam

CCR6

Migração de

CARD14

catelicidina

CCR4

neutrófilos

(LL37) + IL-6 +

IL-17

Diferenciação

TNF-α + IL-1β

Th-17/Tc-17

CLA

IL-22

IL-23

Proliferação e

Complexos LL37/DNA

diminuição de

Fatores Desencadeantes

ou RNA próprio

Células

diferenciação de

Estresse

dendríticas

queratinócitos

Microorganismos

mielóides

Drogas

apresentam

Álcool