Cinética celular na endometriose profunda infiltrativa de reto-sigmoide: estudo anátomo-clínico por Marco Antonio Bassi - Versão HTML

ATENÇÃO: Esta é apenas uma visualização em HTML e alguns elementos como links e números de página podem estar incorretos.
Faça o download do livro em PDF, ePub para obter uma versão completa.

MARCO ANTONIO BASSI

Cinética celular na endometriose profunda

infiltrativa de reto-sigmoide:

estudo anátomo-clínico

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para a obten-

ção do título de Doutor em Ciências

Programa de:

Obstetrícia e Ginecologia

Orientador:

Prof. Dr. Sérgio Podgaec

São Paulo

2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Ba s

si, Marco Antonio

Cinética celular na endometriose profunda infiltrativa de reto : estudo anátomo-

clínico / Marco Antonio Bassi. .-- São Paulo, 2011.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Obstetrícia e Ginecologia.

Orientador: Sérgio Podgaec.

Descritores: 1.Endometriose 2.Intestino grosso 3.DNA topoisomerases tipo II

4.Apoptose 5.Genes p53 6.Proteína c-erbB-2

USP/FM/DBD-217/11

iii

Aos meus pais,

Wilson ( in memorian) e Jandira,

meu respeito e gratidão pela vida, pela formação e pelo amor.

À minha irmã,

Lurdes,

pela amizade e apoio.

Aos meus sogros,

Romualdo e Andrelina,

pelo incentivo e carinho.

À minha esposa, Silvana,

mulher, mãe e companheira sempre presente,

que, com muito amor e carinho,

conduz maravilhosamente nossa família.

Meu eterno amor e admiração.

Aos meus filhos, Carolina e Lucas,

razões da minha vida.

iv

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Doutor Maurício Simões Abrão, amigo, exemplo, pela o-

portunidade, confiança e incentivo para a realização deste trabalho. A minha

eterna gratidão.

Ao Doutor Sérgio Podgaec, pela impecável e competente orientação

que recebi para o desenvolvimento desta tese e, principalmente, pela ami-

zade e companherismo desde o início.

Ao Professor Doutor Edmund Chada Baracat, por ter aceitado, apoiado

e auxiliado o desenvolvimento deste estudo.

Ao Professor Doutor Waldir Inácio ( in memorian), por ter sido o primeiro

a acreditar que eu poderia chegar até aqui e pelos ensinamentos. Saudade.

Ao Professor Doutor Tsutomu Aoki, pelo apoio desde os meus primei-

ros dias na vida acadêmica.

Ao Doutor Victor Arias, pelo estímulo desde o início, pela realização

dos estudos de citologia e anatomia patológica, pelo auxílio e entusiasmo na

execução deste trabalho. Meu muito obrigado!

À Professora Doutora Silvia Regina Rogatto, pelo auxilio na execução

desta pesquisa.

Aos Doutores Dario José Del Carlo Romani, Ronaldo Elias Carnut Re-

go e Hélio Smolentzov, amigos e companheiros de todos os dias, pelo auxí-

lio, incentivo, companheirismo e paciência.

v

Ao Doutor Nicolau D’Amico Filho, pela parceria, pelo auxílio importante

no desenvolvimento da técnica cirúrgica empregada neste estudo, pela ami-

zade e pela confiança, além do imprescindível auxílio na coleta de material

do grupo-controle deste estudo.

Ao Doutor João Antonio Dias Júnior, pela paciência, amizade e dispo-

sição em ensinar, ajudar e incentivar a realização deste estudo.

À Sra. Silvana Santos e a Ana Branch, pela ajuda no levantamento bi-

bliográfico, revisão linguística e editoração do texto.

À Sra. Ana Helena Carvalho Pinto, pelo auxílio durante os atos cirúrgi-

cos.

À Sra. Vanessa Brito Eduardo, pelo auxílio no atendimento, coleta de

dados, preenchimento dos protocolos e confecção das tabelas, além do ca-

rinho e atenção, sempre, com todas as pacientes.

Às pacientes, colaboradoras fundamentais para a realização deste es-

tudo, os meus sinceros agradecimentos.

E, sobretudo, a DEUS, por ter me permitido chegar a este objetivo, que

não pensava conseguir alcançar um dia, dando-me sempre esperança, saú-

de e força.

vi

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA

Ácido desoxirribonucleico

IA

Índice de apoptose (representado pelo índice de positividade

para detecção de apoptose)

IP

Índice de proliferação celular (representado pelo índice de posi-

tividade para expressão de topoisomerase II-alfa)

IRC

Índice de renovação celular (representado pelo produto da divi-

são do IP pelo IA)

LOH

Perda de heterozigose

RNA

Ácido ribonucleico

TdT

Deoxinucleotidil terminal-transferase

TOP2A Topoisomerase II-alfa

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Dados clínicos de 60 pacientes com endometriose do reto-

sigmoide (grupo experimental) e de 20 pacientes sem endometri-

ose (grupo-controle) .......................................................................

45

Tabela 2

Distribuição das frequências dos sintomas de 60 pacientes com

endometriose do reto-sigmoide (grupo experimental) e de 20 pa-

cientes sem endometriose (grupo-controle) ...................................

46

Tabela 3

Valores relativos ao número e tamanho de lesões observadas em

60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide .......................

46

Tabela 4

Distribuição das frequências relativas às camadas intestinais a-

cometidas em 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide .

47

Tabela 5

Distribuição das frequências relativas à evidência de apoptose e

de topoisomerase II-alfa em 60 pacientes com endometriose do

reto-sigmoide (grupo experimental) e em 20 pacientes sem en-

dometriose (grupo-controle) ...........................................................

51

Tabela 6

Médias e desvios-padrão dos Índices de Renovação Celular

(IRC) em estroma e glândula de tecido de 60 pacientes com en-

dometriose do reto-sigmoide (grupo experimental) e em tecido de

endométrio de 20 pacientes sem endometriose (grupo-controle) ..

53

Tabela 7

Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre variáveis clínicas e os IP

(índice de proliferação) e IA (índice de apoptose) em glândula e

estroma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-

sigmoide .........................................................................................

55

Tabela 8

Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre características das le-

sões e os IP (índice de proliferação) e IA (índice de apoptose) em

glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endometriose

do reto-sigmoide .............................................................................

55

Tabela 9

Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre o estadiamento da do-

ença e os IP (índice de proliferação) e IA (índice de apoptose)

em glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endome-

triose do reto-sigmoide ...................................................................

56

viii

Tabela 10

Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre variáveis clínicas e o

IRC (índice de renovação celular) em glândula e estroma de le-

sões de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide ...........

56

Tabela 11

Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre características das le-

sões e o IRC (índice de renovação celular) em glândula e estro-

ma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-

sigmoide .........................................................................................

57

Tabela 12 Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na

análise do grau de relacionamento entre o estadiamento da do-

ença e o IRC (índice de renovação celular) em glândula e estro-

ma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-

sigmoide .........................................................................................

57

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Representação esquemática da dinâmica de estudo ...................... 27

Figura 2

Peça cirúrgica com lesões endometrióticas em parede intestinal ...

30

Figura 3

Estadiamento da endometriose proposto pela American Society

for Reproductive Medicine (1996) ...................................................

32

Figura 4

Amostra corada com Hematoxilina-eosina (aumento de 100x), e-

videnciando ilha de endometriose cercada de tecido da camada

muscular própria do intestino, sem evidências de fibrose. Obser-

vam-se focos isolados de lesão ......................................................

33

Figura 5

A mesma amostra, evidenciando células epiteliais (de formato ci-

líndrico) e células estromais (as células menores) (aumento de

350x) ................................................................................................ 34

Figura 6

(A) Foco de endometriose estromal em meio à fibrose (HE, 100x);

(B) Foco de endometriose com padrões estromal e glandular bem

diferenciado (HE, 400x); (C) Foco de endometriose de padrões

estromal e glandular indiferenciado (HE, 400x); (D) Foco de en-

dometriose de padrões estromal e glandular misto de diferencia-

ção (HE, 100x) ................................................................................. 35

Figura 7

Controle positivo para apoptose em adenocarcinoma endometrial

(aumento de 1.000x) .......................................................................

37

Figura 8

Controle positivo para apoptose em carcinoma in situ de colo ute-

rino (aumento de 1.000x) ................................................................

37

Figura 9

Controle positivo para apoptose em endometriose (aumento de

1.000x) ............................................................................................. 37

Figura 10

Corte marcado com anticorpo antitopoisomerase II-alfa. Os nú-

cleos das células epiteliais marcados na cor marrom revelam po-

sitividade para topoisomerase II-alfa (aumento de 200x) ................ 39

Figura 11

Controle positivo para a expressão da proteína p53 em câncer de

mama (aumento de 200x) ...............................................................

39

Figura 12

Amostra negativa para a expressão da proteína p53 (aumento de

350x) ................................................................................................ 40

Figura 13

Amostra negativa para a expressão da proteína c-erbB2 (aumento

de 350x) ........................................................................................... 40

x

Figura 14

Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices

de Apoptose (IA) encontrados em estroma e glândula (p = 0,65)

de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide. [Os

índices de 0 a 5 se referem aos índices mínimo e máximo encontra-

dos nesta amostra; neste grupo, não foi encontrado o índice 4] ......... 48

Figura 15

Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices

de Proliferação (IP) encontrados em estroma e glândula (p = 0,54)

de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide

[Os índices de 0 a 6 se referem aos índices mínimo e máximo en-

contrados nesta amostra; neste grupo não foi encontrado o índice

5] ...................................................................................................... 48

Figura 16

Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices

de Apoptse (IA) encontrados em estroma e glândula (p = 0,64) de

endométrio de 20 pacientes sem endometriose. [Os índices de 0 a

8 se referem aos índices mínimo e máximo encontrados nesta a-

mostra; neste grupo não foram encontrados os índices 5, 6 e 7] ....

49

Figura 17

Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices

de Proliferação (IP) encontrados em estroma e glândula (p = 0,65)

em endométrio de 20 pacientes sem endometriose. [Os índices de

0 a 8 se referem aos índices mínimo e máximo encontrados nesta

amostra; neste grupo não foram encontrados os índices 6 e 7] ..... 50

Figura 18

Representação gráfica das frequências dos Índices de Apoptose

(IA) e de Proliferação (IP) encontrados em estroma e glândula de

tecido de endometriose de 60 pacientes com endometriose do re-

to-sigmoide e de endométrio de 20 pacientes sem endometriose.

[Os índices de 0 a 8 se referem aos índices mínimo e máximo en-

contrados nesta amostra] ................................................................

52

Figura 19

Médias dos Índices de Renovação Celular (IRC) em estroma e

glândula de tecido de 60 pacientes com endometriose do reto-

sigmoide (grupo experimental) e em tecido de endométrio de 20

pacientes sem endometriose (grupo-controle) ................................

54

xi

RESUMO

Bassi MA. Cinética celular na endometriose profunda infiltrativa de reto-

sigmoide: estudo anátomo-clínico [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2011.

INTRODUÇÃO: A endometriose, uma doença benigna, tem características invasi-

vas com potencial proliferativo. O desenvolvimento das lesões pode ocorrer em de-

corrência de crescimento celular glandular e/ou estromal ou de alterações na cinéti-

ca celular. Cinética celular refere-se ao equilíbrio entre a morte celular, ou apopto-

se, e a proliferação celular, que pode ser avaliada pela expressão de fatores de

crescimento como, por exemplo, a topoisomerase 2-alfa (TOP2A). Também influen-

ciam a cinética celular oncoproteínas como p53 e c-erB2, conhecidas por interferir

na apoptose, podendo resultar em oncogênese. OBJETIVOS: O objetivo principal

deste estudo foi comparar a cinética celular da endometriose infiltrativa de reto-

sigmoide com a do endométrio eutópico de pacientes sem endometriose. Para tan-

to, foi avaliada a expressão de apoptose e de TOP2A bem como das oncoproteínas

p53 e c-erB2. MÉTODOS: Foram obtidas amostras de lesões de endometriose en-

volvendo o reto-sigmoide de 60 mulheres com a doença e amostras de endométrio

eutópico de 20 mulheres sem endometriose. A expressão de TOP2A e das proteí-

nas p53 e c-erB2 foram quantificadas por técnica imuno-histoquímica. Método

TUNEL foi utilizado para analisar os padrões de apoptose, que resultaram em índi-

ce de apoptose (IA). Índice de proliferação celular (IP) foi determinado a partir do

nível de expressão de TOP2A. Índice de renovação celular (IRC) foi calculado pela

razão entre IP e IA. As análises imuno-histoquímicas foram realizadas tanto no te-

cido endometrial como um todo, quanto nos componentes estromal e glandular se-

paradamente. Coeficiente de Correlação de Spearman foi aplicado para identificar

eventuais correlações entre variáveis clínicas, morfológicas (tamanho, quantidade e

nível de invasão das lesões) e experimentais. RESULTADOS: Na análise da amos-

tra do tecido como um todo, não foram evidenciadas diferenças entre os grupos ex-

perimental e controle em relação ao IA (p = 0,389). Por outro lado, o IP foi significa-

tivamente maior nas amostras-controle (p < 0,001). Na avaliação em que se sepa-

xii

raram as células estromais dos componentes glandulares, tanto o IP quanto o IRC

foram significativamente maiores no grupo-controle em comparação com o grupo

experimental (IP estromal: p = 0,006; IP glandular: p = 0,001; IRC estromal: p

=0,032; IRC glandular: p = 0,007). Nas pacientes com endometriose, foi encontrada

correlação entre IP e IRC glandular e o número de lesões (p = 0,003). Também foi

observada correlação entre o IRC glandular e o tamanho das lesões (p = 0,006).

Não houve diferença entre os grupos no que se refere à expressão de p53 e c-

erB2. CONCLUSÕES: A cinética celular se mostrou alterada em pacientes com en-

dometriose do reto-sigmoide, conforme demonstrado pela redução nos níveis e na

frequência de TOP2A, e pelos IP e IRC mais baixos; entretanto, apoptose e as ex-

pressões de p53 e c-erB2 se mostraram inalteradas.

Palavras-chave: 1.Endometriose 2.Intestino grosso 3.DNA topoisomerases tipo II

4.Apoptose 5.Genes p53 6.Proteína c-erbB-2

xiii

ABSTRACT

Bassi MA. Cell kinetics in deep infiltrating endometriosis of rectosigmoid: an

anatomoclinical study [thesis]. São Paulo: Medicine School, University of São

Paulo; 2011.

BACKGROUND: Endometriosis, a benign disease, has invasive features with its

proliferative potential. Development of lesions may occur due to stromal and/or

glandular cell growth and to alterations in cellular kinetics. Cellular kinetics involves

a balance between the regulation of cell death, or apoptosis, and cell growth, that

can be evaluated by the expression of growth factors, such as topoisomerase 2-

alpha (TOP2A). Oncoproteins, such as p53 and c-erB2, known to affect apoptosis

resulting in oncogenesis, also influence cellular kinetics. OBJECTIVES: The main

objective of this study was to compare the cellular kinetics in deep endometriosis in-

volving the recto-sigmoid to eutopic endometrium from patients without endometri-

osis. Apoptosis and TOP2A expression were primarily evaluated, as well as p53 and

c-erB2 expression. METHODS: Study samples were obtained from endometriosis

lesions involving the recto-sigmoid in 60 women, and control samples were obtained

from eutopic endometrium from 20 women without endometriosis. The expression of

TOP-2A, p53 and c-erB2 proteins were quantified using immuno-histochemistry.

TUNEL method was used in the analysis of apoptosis patterns, and the apoptosis

index (AI) was derived. The proliferation index (PI) was derived from the level of ex-

pression of TOP-2A. Cellular renew index (CRI) was calculated from the ratio of the

PI and AI. Immunohistochemical analyses were performed in two ways: on the tis-

sue collectively, and on the stromal and glandular components separately. Spear-

man’s correlation coefficient was used to identify the correlation between clinical,

morphological (size, number and level of invasion of lesions) and the study va-

riables. RESULTS: When looked at collectively, there was no difference in the AI

between study and control groups (p = 0.389). PI, however, was noted to be signifi-

cantly higher in the control samples (p < 0.001). When evaluating the stromal cells

separately from the glandular components, the PI and CRI were both significantly

xiv

higher in the control group compared to the study group (Study stromal PI vs control

stromal PI; p = 0.006; Study glandular PI vs study glandular PI; p = 0.001; Study

stromal CRI vs control stromal CRI; p = 0.032; study glandular CRI vs control glan-

dular CRI; p = 0.007). In patients with endometriosis, a correlation was found be-

tween glandular PI, CRI and number of lesions (p = 0.003). The same result was

observed in the analysis of stromal CRI and lesion size (p = 0.006). There was no

difference in expression of p53 and c-erB2 between groups. CONCLUSIONS:

Cellular kinetics is altered in endometriosis of the recto-sigmoid, as shown by

the decrease in the levels and frequency of TOP2A expression, and lower PI

and CRI; however, apoptosis and p53 and c-erB2 expression were unaf-

fected.

Keywords: 1.Endometriosis 2.Bowel 3.DNA topoisomerase type II 4.Apoptosis

5.Genes p53 6.Protein c-erbB-2

xv

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas ….......................................................................................

vi

Lista de tabelas ...................................................................................................

vii

Lista de figuras ....................................................................................................

ix

Resumo ...............................................................................................................

xi

Abstract ...............................................................................................................

xiii

1. Introdução ......................................................................................................

1

1.1 Endometriose ...........................................................................................

1

1.2 Cinética celular e endometriose ...............................................................

5

1.2.1 Apoptose ........................................................................................

5

1.2.2 Topoisomerase II-alfa .....................................................................

9

1.3 Mecanismos de controle da cinética celular .............................................

12

1.3.1 Oncoproteína p53 ...........................................................................

14

1.3.2 Oncoproteína c-erb2 ......................................................................

16

1.4 Endometriose e câncer ............................................................................

17

2. Proposição .....................................................................................................

22

3. Métodos .........................................................................................................

23

3.1 Local do estudo ........................................................................................

23

3.2 Pacientes ..................................................................................................

23

3.2.1 Critérios de inclusão .......................................................................

24

3.3 Métodos ....................................................................................................

25

3.3.1 Dinâmica do estudo ........................................................................

25

3.3.2 Quadro clínico ................................................................................

28

3.3.3 Videolaparoscopia com ressecção de segmento de reto-sigmoide

28

3.3.4 Videolaparoscopia para realização de laqueadura ........................

31

3.3.5 Estadiamento da endometriose ......................................................

31

3.3.6 Características das lesões de endometriose do reto-sigmoide ....

33

3.3.7 Confirmação diagnóstica e classificação histológica .....................

33

3.3.8 Detecção de apoptose ...................................................................

35

3.3.9 Reação imuno-histoquímica para pesquisa de p53, c-erB2 e to-

poisomerase II-alfa ..................................................................................

38

3.4 Mensuração dos resultados .....................................................................

41

3.5 Análise estatística ....................................................................................

43

4. Resultados .....................................................................................................

45

5. Discussão ......................................................................................................

59

6. Conclusões ....................................................................................................

68

7. Anexos ...........................................................................................................

69

8. Referências ....................................................................................................

83

1

1. INTRODUÇÃO