Construção, análise do fenótipo e da transcrição gênica de uma amostra mutante de Aggregatibacter ac por Priscila Larcher Longo - Versão HTML

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P R I S C I L A L A R C H E R L O N G O

CONSTRUÇÃO, ANÁLISE DO FENÓTIPO

E DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA DE UMA AMOSTRA

MUTANTE DE Aggregatibacter actinomycetemcomitans

DEFICIENTE EM arcB

Tese apresentada ao Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo, para obtenção do Título

de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Microbiologia

Orientadora: Profa Dra Marcia P. A.Mayer

São Paulo

2008

RESUMO

LONGO, P.L. Construção, análise de fenótipo e da transcrição gênica de uma amostra

mutante de Aggregatibacter actinomycetemcomitans deficiente em arcB. 2008. 112f. Tese

(Doutorado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São

Paulo, São Paulo, 2008.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans é periodontopatogênico que possui diversos fatores de

virulência, porém, pouco se sabe sobre a sua regulação. O sistema de dois componentes ArcAB é

responsável por perceber as condições de oxigênio do ambiente e em A. actinomycetemcomitans está

associado à aquisição de ferro. O objetivo deste estudo foi construir uma amostra de A.

actinomycetemcomitans deficiente em arcB e comparar as suas características fenotípicas e de

transcrição gênica com as da amostra selvagem. O gene arcB de A. actinomycetemcomitans foi

interrompido pela inserção de um gene de resistência a espectinomicina empregando um sistema de

conjugação. As amostras foram analisadas quanto ao crescimento, adesão e invasão em células

epiteliais KB, adesão à hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) e formação de biofilme, após cultivo

sob atmosfera de microaerofilia e anaerobiose. A análise da expressão de genes foi determinada por

RT PCR em tempo real. As amostras mostraram crescimento similar em condições de microaerofilia e

anaerobiose em meio enriquecido. A amostra mutante, cultivada em microaerofilia apresentou menor

capacidade de adesão às células KB, porém, quando cultivada até início de fase exponencial em

anaerobiose mostrou comportamento inverso. As amostras apresentaram comportamento diferenciado

na capacidade de invasão às células KB, indicando que o sistema ArcAB participa não somente da

regulação de genes associados a adesão, mas também de outros relacionados a entrada e sobrevivência

intracelular do microrganismo. Houve diferença na hidrofobicidade celular das amostras. Foi possível

observar que a atmosfera de incubação e a fase da cultura influenciaram no comportamento

hidrofóbico, sugerindo que ArcB não seria receptor apenas para a condição de oxidação do ambiente,

mas outros sinais estariam sendo diferencialmente percebidos pelas amostras mutante e selvagem. A

mutante exibiu capacidade reduzida de adesão à SHA quando comparada à amostra selvagem e as

amostras também apresentaram formação diferenciada de biofilme. A análise da expressão gênica

mostrou que o sistema ArcAB participa da regulação gênica dos genes omp29, cdtB, apaH e vppA. Os

fenótipos diferenciais entre as amostras selvagem e mutante arcB deficiente indicam que ArcB está

envolvido na expressão de características associadas a adesão e invasão à células epiteliais, adesão à

SHA, hidrofobicidade celular, formação de biofilme e está associado direta ou indiretamente à

regulação de genes em A. actinomycetemcomitans. Os dados sugerem que ArcB participa da regulação

de fatores associados a virulência de A. actinomycetemcomitans.

Palavras-chave: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; arcB; Adesão; Biofilme;

PCR em Tempo Real.

ABSTRACT

LONGO, P.L. Construction, phenotypic and gene transcription analysis of an

Aggregatibacter actinomycetemcomitans mutant strain deficient in arcB. 2008. 112p. Ph.

D. Thesis - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans is a periodontopathogen that possess several virulence

factors, but little is known about their regulation. The ArcAB two components system is responsible to

sense oxygen environmental conditions and in A. actinomycetemcomitans is associated with iron

uptake. This study aimed to construct an arcB deficient strain of A. actinomycetemcomitans and to

compare its phenotypical traits and gene transcription with the wild strain. The arcB gene of A.

actinomycetemcomitans was disrupted by the insertion of a spectinomycin resistance gene by using a

conjugation system. The strains were evaluated concerning growth curve, adhesion and invasion in

KB epithelial cells, adhesion to saliva coated hydroxiapatite (SHA) and biofilm formation after growth

under microaerophilic and anaerobic atmospheres. Gene expression analyses were performed by real

time RT-PCR. The strains showed a similar pattern of growth in enriched medium under

microaerophilic or anaerobic atmospheres. When grown under microaerophilic atmosphere, the mutant

strain exhibited decreased adhesion ability to KB cells, however a different behavior was seem in early

log phase under anaerobic incubation. The strains also showed a differential behavior in the invasion

ability to KB cells, indicating that ArcAB is involved not only in the regulation of genes related to

adhesion but also in others related to intracellular entry and survival. A difference in the cells

hydrophobic properties was shown. The incubation atmosphere and culture growth phase had an

influence in the hydrophobic properties, suggesting that ArcB is not only a receptor which senses

environmental oxygen, but other signals are also differentially senses by the mutant and wild strains.

The mutant strain exhibited a reduced ability to adhere to saliva coated hydroxiapatite when compared

to the wild type, and the strains had also exhibited differences in biofilm formation. Gene expression

analyses showed that the ArcAB system is involved on the regulation of omp29, cdtB, apaH and

vppA. The differential phenotypes between the arcB deficient and the wild strain indicated that ArcB

is involved in the expression of phenotypes associated to adhesion and invasion to epithelial cells,

adhesion to SHA, cellular hydrophobicity and biofilm formation. ArcB is directly or indirectly

associated with the regulation of genes in A. actinomycetemcomitans. These data suggest that ArcB in

involved in the regulation of factors associated with the virulence of A. actinomycetemcomitans.

Key-words: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; arcB; Adhesion; Biofilm; Real Time

PCR.

1 INTRODUÇÃO

A periodontite agressiva é uma infecção que acomete indivíduos sistemicamente

saudáveis, caracterizada por uma grande perda de inserção clínica associada a uma rápida

destruição óssea alveolar, acometendo normalmente pacientes jovens (ARMITAGE, 1999;

TONETTI; MOMBELI, 1999).

Entre os microrganismos relacionados à etiologia das doenças periodontais destaca-se

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (anteriormente classificado como Actinobacillus

actinomycetemcomitans) (HAUBEK et al., 2001; NORSKOV-LAURITSEN; KILIAN, 2006).

A. actinomycetemcomitans é um pequeno cocobacilo, gram negativo, capnofílico, da

família Pasteurellaceae. Além de estar relacionado às doenças periodontais, o microrganismo

também pode ser associado a outras infecções em humanos como endocardites, septicemias,

meningites, abscessos cerebrais e infecções do trato urinário (ZAMBON et al., 1988; SILVA

et al., 1990; KAPLAN; FINE, 1998).

As amostras de A. actinomycetemcomitans são classificadas em 06 sorotipos (a, b, c, d,

e, f) definidos por seus polissacarídeos de superfície (KAPLAN et al., 2002). O

microrganismo possui transmissão intrafamiliar (ZAMBON et al., 1983) e sua prevalência

varia entre diversas populações, evidenciando que as raças ou etnias possuem fator de risco

potencial diferente para sua colonização (HAUBEK et al., 1996; HAUBEK et al., 1997;

UMEDA et al., 1998; TAN et al., 2001).

O microrganismo possui grande número de fatores de virulência que tornam a espécie

capaz de colonizar e persistir na cavidade oral, invadindo tecidos periodontais, destruindo

tecido conjuntivo e interferindo na reparação tecidual do hospedeiro (FIVES-TAYLOR et al.,

1999; PAJU et al., 2000; KURAMITSU, 2003).

A. actinomycetemcomitans agride os tecidos periodontais através da produção de

colagenases, epiteliotoxinas, fatores inibidores de fibroblastos, fatores indutores da reabsorção

óssea e de um potente lipopolissacarídeo (REPO et al., 1990; WILSON; HENDERSON,

1995; KOLODRUBETZ et al., 1996; KURITA-OCHIAI; OCHIAI, 1996; CHINWALLA et

al., 1998; BRISSETTE; FIVES-TAYLOR, 1999; MORIMOTO et al., 1999; MURO et al.,

1999).

Para evadir das defesas do hospedeiro, o microrganismo utiliza vários mecanismos

como inibição da quimiotaxia, resistência a opsonização, resistência às defensinas, produção

de catalase, resistência à lisozima e à elastase, produção de proteínas ligantes à porção Fc de

IgG, à monócitos, à células T e B, além de proteases que degradam imunoglobulinas

(ZAMBON, 1985; WILSON; HENDERSON, 1995; FIVES-TAYLOR et al., 1996; MEYER;

FIVES-TAYLOR, 1997; OHGUCHI et al., 1998; ZADEH et al., 1999).

Além disso, são conhecidos outros mecanismos de imunossupressão promovidos pela

bactéria, como o fator supressor de linfócitos, o fator apoptótico para macrófagos, o fator de

inibição da síntese de IL-2, IL-4, IL-5 e TFN-γ por células T e o fator inibidor da produção de

peróxido de hidrogênio por polimorfonucleares (CHEN et al., 1991; SHENKER et al., 1995;

FIVES-TAYLOR et al., 1999; ZADEH et al., 1999).

O microrganismo produz uma leucotoxina, codificada a partir de um operon de quatro

genes (ltxC, ltxA, ltxB e ltxD), que pertence à família das citolisinas bacterianas RTX

(repeats-in-toxin), leva à lise leucócitos polimorfonucleares e macrófagos humanos (IWASE

et al., 1992), e é considerado o principal fator de virulência de A. actinomycetemcomitans

(WELCH, 1991).

Células intactas de A. actinomycetemcomitans são leucotóxicas e a citotoxidade da

célula se relaciona ao nível de polipeptídeo leucotóxico expresso (BROGAN et al., 1994). A

produção da leucotoxina varia entre diferentes cepas, sob diferentes condições de cultura e,

um mecanismo cAMP-dependente, possivelmente um sistema de repressão catabólica, parece

estar envolvido na sua regulação (INOUE et al., 2001). Amostras associadas a uma alta

produção da leucotoxina apresentam uma deleção de cerca de 530 pb na região promotora do

operon ltx e estão associadas a pacientes com formas agressivas de periodontite (BUENO et

al., 1998; CONTRERAS et al., 2000; HARASZTHY et al., 2000; HAUBEK et al., 2001).

A. actinomycetemcomitans também produz uma toxina distensora citoletal (CDT)

(MAYER et al., 1999) que é considerada um fator de imunorregulação (SHENKER et al.,

2001) e provoca bloqueio do ciclo celular (principalmente na fase G2) de maneira semelhante

a injúrias no sistema de checagem de danos ao DNA. Em algumas linhagens celulares, a CDT

provoca mudanças no citoesqueleto das células alvo, induzindo ao acúmulo de fibras de F-

actina (CORTES-BRATTI et al., 1999). Existem evidências da ligação entre a presença de

CDT e a maior capacidade de invasão bacteriana no sangue, baço e fígado, a quadros de

encefalopatia hipotensiva, a secreção de IL-8 por células epiteliais intestinais e a quadros de

diarréia (ANDERSON et al., 1987; PURDY et al., 2000; CLARKE, 2001).

Vários tipos celulares respondem a presença da CDT e a inibição da renovação

epitelial e fibroblástica poderia prolongar a colonização bacteriana dos tecidos periodontais e

até alterar o padrão de colonização devido a alteração profunda ocorrida nas células. A

inibição da ativação local de linfócitos contribuiria para a falta de resistência à invasão

bacteriana, perpetuando os quadros de infecção periodontal (OHGUCHI et al., 1998; SUGAI

et al., 1998; CORTES-BRATTI et al., 1999; MAYER et al., 1999; SHENKER et al., 1999).

Além disso, a atividade inibitória sobre a produção de óxido nítrico por macrófagos permitiria

a persistência da infecção bacteriana (ANDO, 2007 - comunicação pessoal1; FERNANDES et

al., 2007).

Próximo à região do gene cdt em A. actinomycetemcomitans encontra-se o gene vppA

associado à produção de proteína virulenta em outras espécies de microrganismos (MAYER

et al., 1999).

A capacidade de adesão aos tecidos do hospedeiro é considerada um pré-requisito

importante para a colonização e manifestação da virulência bacteriana. Para A.

actinomycetemcomitans a adesão às células epiteliais e às superfícies dentais, além da

agregação a outras bactérias orais e sua capacidade de invadir tecidos gengivais, são

provavelmente passos iniciais e essenciais na patogênese das periodontites (MEYER; FIVES-

TAYLOR, 1994).

Os mecanismos de aderência e invasão de A. actinomycetemcomitans em células

epiteliais, que envolvem interações específicas e não específicas com a participação de vários

fatores, bem como os reguladores destes processos ainda não estão totalmente elucidados (LI

et al., 2004; MEYER; FIVES-TAYLOR, 1995).

Em amostras recém isoladas, A. actinomycetemcomitans apresenta fímbrias que são

perdidas após sucessivos repiques (ROSAN et al., 1988). As subunidades fimbriais do

microrganismo são codificadas pelo gene flp (KACHLANY et al., 2001). As variantes lisas da

espécie possuem propriedades adesivas, indicando a presença de adesinas funcionais e não

fimbriais no microrganismo (INOUE et al., 1990).

Entre as adesinas não fimbriais de A. actinomycetemcomitans, destaca-se a proteína

Aae que possui secreção tipo V. Uma amostra mutante knock out desta proteína apresentou

redução de até 50% na adesão às células epiteliais KB quando comparada à cepa selvagem

(ROSE et al., 2003). A adesina Aae media a adesão às células epiteliais de primatas antigos e

humanos, porém o mesmo não é observado em células de primatas novos e na maioria dos

mamíferos não-primatas (FINE et al. 2005). A expressão das adesinas Aae e ApiA (também

denominada OMP100) intactas induz a ligação de alta especificidade entre A.

actinomycetemcomitans e células bucais epiteliais (BEC) humanas e de macacos do velho

mundo (YUE et al., 2007).

1 ANDO, ES- São Paulo, 2007 (comunicação pessoal)

A adesão do microrganismo está relacionada com a capacidade de invadir células

eucarióticas. A invasão é um processo ativo com alta taxa de síntese protéica já que não há

um pool pré-formado de proteínas envolvidas no processo (SREENIVASAN et al., 1991).

Algumas amostras de A. actinomycetemcomitans, como a SUNY465, apresentam alta

capacidade invasiva enquanto a maior parte das cepas apresenta capacidade de invasão baixa

ou não detectável (MEYER et al., 1991).

A invasão de células epiteliais por A. actinomycetemcomitans é um processo de

múltiplos eventos que envolvem a entrada no citoplasma, o escape do vacúolo, a rápida

multiplicação e espalhamento intra e intercelular da bactéria (MEYER et al., 1996).

A invasão de células epiteliais pelo microrganismo é mediada por adesinas não

fimbriais como ApiB e OMP100 (ASAKAWA et al., 2003; LI et al., 2004) e células não

fimbriadas são mais invasivas que os fenótipos fimbriados (MEYER et al., 1996).

A OMP100 é um dos principais antígenos reconhecidos no soro de pacientes com

periodontite agressiva. Uma amostra omp100 deficiente apresentou redução de 60% na

capacidade de adesão e invasão quando comparada ao fenótipo selvagem (ASAKAWA et al.,

2003).

Esta proteína induz a produção de citocinas (IL-6, IL-8 e TNFα) em células epiteliais

de gengiva humana, associadas aos processos inflamatórios e de reabsorção óssea em doenças

periodontais. Além disso, OMP100 está associada à resistência ao soro devido à ligação do

fator H na superfície celular promovendo a inativação do C3b. Foi mostrado que a atividade

bactericida do soro foi 90% maior sobre uma amostra mutante deficiente omp100 do que

sobre a amostra selvagem (ASAKAWA et al., 2003).

Outras proteínas do microrganismo, como ApaH, também já foram relacionadas à

invasão em células epiteliais. O gene apaH codifica uma diadenosina tetrafosfatase, molécula

catalítica de alarmonas, responsável por emitir diversos sinais de stress metabólico à célula

(BAXI; VISHWANATHA, 1995).

O gene apaH de A. actinomycetemcomitans é homólogo aos genes ialA, ygdP e invA

associados com a invasão de Bartonella bacilliformis, E. coli K1, Salmonella enterica e

Rickettsia prowazekii (MITCHELL; MINNICK, 1995; BESSMAN et al., 2001; GAYWEE et

al., 2003; ISMAIL et al., 2003). A proteína citoplasmática InvA de R. prowazekii é expressa

em resposta ao stress causado durante a internalização da bactéria em células do hospedeiro, e

facilitaria a sobrevivência do microrganismo durante sua entrada, atuando como tampão no

citoplasma da célula invadida (GAYWEE et al., 2003).

Uma amostra de A. actinomycetemcomitans deficiente em apaH mostrou capacidade

invasiva reduzida em células KB (SAARELA et al., 1999). O gene apaH do microrganismo

codifica uma seqüência RGD (Arg-Gli-Asp) que se liga à integrinas receptoras de células

epiteliais (RUOSLAHTI; PIERSCHBACHER, 1987; SAARELA et al., 1999). Uma amostra

de E. coli recombinante contendo o gene apaH foi capaz de invadir células KB in vitro (PAJU

et al., 1998) e a adesão de peptídeos RGD resultou em diminuição da adesão à células

eucarióticas, sugerindo também um papel de adesina a esta proteína (SAARELA et al., 1999).

Os genes orf859 e vapA de A. actinomycetemcomitans são expressos positivamente

após contato com células epiteliais HeLa, sugerindo a sua participação na infecção. A resposta

de anticorpos a estas proteínas no soro de pacientes com formas de periodontites demonstrou

que estes são expressos in vivo. Além disso, foi estabelecida relação entre Orf859 e

capacidade de sobrevivência intracelular do microrganismo, e relação entre o gene vapA,

homólogo a um regulador transcricional, com a interação da bactéria com células epiteliais

(CAO et al., 2004).

Um dos principais mecanismos de adesão de bactérias aos tecidos do hospedeiro

envolve reações hidrofóbicas (GIBBONS; ETHERDEN, 1983; KOZLOVSKY et al., 1987).

Em muitos sistemas biológicos, a hidrofobicidade é determinada pela composição protéica,

sendo dependente da quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, ou não polares, que o

constituem (JANDA; ABBOT, 1993).

A membrana externa é a primeira linha de contato entre as bactérias gram negativas e

seu ambiente externo. As proteínas de membrana externa (OMPs) são sintetizadas no

citoplasma, translocadas através da membrana interna e provavelmente difundidas através do

periplasma antes da sua inserção na membrana externa. Essa passagem pelo periplasma,

resulta em diversas mudanças conformacionais permitindo a inserção na membrana externa

devido a sua natureza hidrofóbica (MOGENSEN; OTZEN, 2005).

Já foram caracterizadas diversas OMPs de A. actinomycetemcomitans e Komatsuzawa

et al. (2002) identificaram 06 como principais devido a sua relação com soro de pacientes

com periodontite. Mudanças na constituição da membrana externa, provocadas por diferenças

na expressão das OMPs poderiam determinar alterações na hidrofobicidade da superfície

bacteriana.

Em ensaios de adesão a hidroxiapatita foi demonstrado que as amostras de A.

actinomycetemcomitans apresentam diferentes receptores de adesão, e que esta capacidade de

se manter em superfícies rígidas pode ser vantajosa na manifestação de seu potencial

destrutivo (KAGERMEIER; LONDON, 1985).

A capacidade de colonizar superfícies dentais, fazendo parte de comunidades

estruturadas em biofilme, é um dos principais atributos de uma bactéria associada às

periodontites. As amostras rugosas de A. actinomycetemcomitans apresentam maior

capacidade de formação de biofilme e tolerância às mudanças de salinidade e pH do meio

(HAASE et al., 2006), pois as fímbrias, apesar de não serem essenciais para o crescimento

aderido à superfície, aumentam as interações células-superfícies e células-células que

estabilizam o biofilme (INOUE et al., 2003).

Em estruturas formadas exclusivamente por esta espécie, as amostras rugosas

produzem biofilmes formados por torres de microcolônias ancoradas por uma pequena área de

contato, enquanto as amostras lisas produzem uma arquitetura aberta com peso reduzido

(HAASE et al., 2006). De acordo com Rhodes et al. (2007) o biofilme formado por amostras

lisas é mais simples que o formado por amostras rugosas.

Assim como já foi descrito para Pseudomonas aeruginosa, na formação do biofilme

por A. actinomycetemcomitans, estão envolvidos resíduos de carboidratos expostos na

superfície, diferentes daqueles associados às fímbrias, além do DNA localizado na superfície

que pode funcionar como importante matriz para construção da arquitetura da estrutura

(INOUE et al., 2003).

O crescimento do biofilme de A. actinomycetemcomitans é um processo discreto e o

destacamento celular desta estrutura envolve a formação de células não agregadas dentro do

biofilme. A síntese do polissacarídeo O é necessária para o destacamento celular do biofilme,

mas não para a adesão superficial ou formação desta estrutura (KAPLAN et al., 2003).

A. actinomycetemcomitans produz a enzima dispersina B (DspB) que causa

destacamento de células superficiais de seu próprio biofilme, sugerindo que a estrutura deste

biofilme contém uma matriz polissacarídica estruturalmente relacionada ao polímero

contendo hexosamina produzido por diversas espécies de Staphylococcus e E. coli (KAPLAN

et al., 2004).

O microrganismo também participa da formação do biofilme dental por sua

capacidade de agregação com outras espécies orais como Streptococcus gordonii e

Fusobacterium nucleatum (FILOCHE et al., 2004).

Quando há aumento do quorum sensing bacteriano, as células produzem e liberam

para o ambiente externo em níveis basais baixos, uma série de moléculas chamadas de

autoindutores. Com o aumento populacional, essas moléculas se acumulam até atingirem um

nível que ativa diferentes genes que permitem às bactérias sobreviver num ambiente em

mudança (FUQUA; GREENBERG, 1998). Em gram negativas já foram descritas duas classes

de moléculas autoindutoras, AI-1 ou lactonas homoserinas aciladas, e AI-2 que tem sua

síntese dependente do gene luxS (FRIAS et al., 2001).

Foi demonstrado que a expressão da leucotoxina em A. actinomycetemcomitans é

regulada por quorum sensing através do produto do gene luxS. Uma maior densidade

populacional induz a expressão do operon lkt, além disso, a sinalização luxS-dependente

modula a obtenção de ferro do ambiente pelo microrganismo e induz respostas em outros

organismos periodontais em biofilmes orais (FONG et al., 2001).

Em muitos organismos, entre os genes que atuam como reguladores globais da

expressão, encontra-se o gene dam (DNA-adenina-metiltransferase), associado a

modificações do DNA. Campellone et al. (2007) mostraram que uma amostra de E. coli

enterohemorrágica dam- deficiente, apresentou elevados níveis de adesão e formação do

pedestal em células epiteliais intestinais, além de altos níveis da proteína intimina. Os

resultados mostram que a metilação de Dam pode indiretamente controlar a expressão

protéica por mecanismos pós-transcricionais.

Eberhard et al. (2001) clonaram e sequenciaram pela primeira vez o gene

metiltransferase em A. actinomycetemcomitans e Lippmann et al. (2002) mostraram que uma

mutação no gene dam está associada à perda da capacidade invasiva do microrganismo em

células epiteliais.

Kokeguchi et al. (2000) isolaram e caracterizaram o gene actX de A.

actinomycetemcomitans pertencente à família de genes regulatórios. Este é um gene

homólogo ao fnr-like de E. coli e regula a expressão de genes associados ao crescimento e

virulência de A. actinomycetemcomitans sob condições anaeróbicas. Na região a montante do

gene regulatório actX, foram identificados os genes afnA e afnB (HIROSUE et al., 2001). Foi

mostrado que condições anaeróbicas regularam o acúmulo de mRNA de afnA e afnB

sugerindo que o operon afnA/afnB/actX é regulado pela presença de oxigênio e que as

proteínas semelhantes a ferritina têm importante papel na adaptação de A.

actinomycetemcomitans às mudanças oxidativas ambientais.

O sistema ArcAB integra um conjunto de sistemas de transdução de sinais de dois

componentes. Tais sistemas são mais prevalentes em procariontes, mas também podem ser

encontrados em plantas e fungos. Além disso, são altamente conservados na natureza e

mediam adaptações a uma variedade de mudanças ambientais. Em E. coli o sistema ArcAB

controla mais de 30 operons em resposta às condições redox de crescimento e do ambiente

(GEORGELLIS et al., 2001).

O sistema de sinalização de dois componentes Arc (anoxic redox control) é composto

por uma quinase sensora (ArcB) encontrada na membrana, e pelo regulador citoplasmático de

resposta OmpR-like (ArcA) que modula a transcrição de numerosos operons (GEORGELLIS

et al., 1998). OmpR é uma extensa subfamília dos reguladores de resposta que possuem

apenas em E. coli 14 homólogos (MIZUNO, 1997).

Proteínas com alta homologia à proteína ArcB de E. coli foram observadas em muitos

organismos como Salmonella typhi, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Pasteurella multocida e

Haemophilus influenzae (MANUKHOV et al., 2000; GEORGELLIS et al., 2001).

A recepção do sinal pela quinase sensora ArcB estimula a autofosforilação dependente

de ATP de um resíduo conservado de histidina no domínio transmissor no citosol. Em

seguida, o grupo fosfato é transferido para um resíduo aspartato no domínio receptor do

regulador da resposta. Este mecanismo é referido como “sistema multistep de

fosfotransferência His para Asp” (GEORGELLIS et al., 1998).

A proteína ArcA quando fosforilada (ArcA-P) serve como regulador da transcrição.

Quando cessa o sinal, o regulador de resposta e a quinase sensora sofrem desfosforilação que

resulta em parada do sistema (GEORGELLIS et al., 1999).

Os reguladores OmpR-like, entre eles ArcA, são reguladores de resposta que

aumentam a transcrição feita pela RNA-polimerase. O domínio N-terminal recebe a

informação da proteína sensora via fosforilação e, a atividade ligante do DNA na terminação

carboxila é alterada. As proteínas OmpR são muito conservadas, porém, recebem sinais de

proteínas sensoras específicas e reconhecem seqüências específicas de DNA (ITOU;

TANAKA, 2001).

O fluxo de informação entre os domínios parece ser bidirecional, isto é, perturbações

no domínio regulatório podem influenciar a atividade do domínio efetor e vice-versa

(KENNEY et al., 1995).

Peña-Sandoval et al. (2005) mostraram que os domínios receptores e de

fosfotransferência da sensora quinase ArcB são necessários e suficientes para uma eficiente

desfosforilação da ArcA-fosforilada in vivo.

As proteínas da família OmpR regulam diversos sistemas em bactérias e sua

importância pode ser observada na regulação de proteínas do choque ácido (AUDIA et al.,

2001), na transcrição de genes que codificam proteínas de membrana externa (AIBA et al.,

1989), nos mecanismos de regulação de fatores relacionados à evasão das defesas do

hospedeiro (PROHINAR et al., 2002), na formação do biofilme (PRINGENT-COMBARET

et al., 2001) e na regulação de genes que codificam fímbrias (SCHWAN et al., 2002).

ArcB é uma proteína da subclasse dos sensores que tem um domínio transmissor na

região N-terminal e um domínio receptor na região C-terminal. Em geral, uma His-quinase

típica tem seqüências que ultrapassam a dupla membrana e se estendem da membrana

citoplasmática ao espaço periplasmático, porém ArcB diferentemente das outras quinases

sensoras, possui uma seqüência periplasmática pequena (16 aminoácidos). A proteína contém

três domínios sinalizadores de fosforilação na região C-terminal: transmissor (His-quinase),

receptor e um fosforilador contendo histidina (HPt). O domínio HPt é um sistema comum de

transmissão de sinais em vários sistemas de sinalização por fosforilação (MATSUSHIKA;

MIZUNO, 1998; KWON et al., 2000).

A porção N-terminal de ArcB é referida como o “domínio de recepção de sinal” e é

dividida em três subdomínios putativos: um domínio transmembrana, um domínio “leucina-

zipper” e um domínio PAS. O domínio transmembrana serve para ancorar a proteína na

superfície interna da membrana citoplasmática. O domínio PAS foi identificado em uma

grande família de proteínas de procariotos envolvidas com a percepção de luz, oxigênio,

condições redox e outros sinais do ambiente (MATSUSHIKA; MIZUNO, 2000).

Em E. coli mutantes com deleção em todo o domínio PAS (ArcB-∆PAS) um fenótipo

nulo é observado, isto é, a deleção altera a proteína de maneira que ela não responde mais ao

estímulo anóxico in vivo (MATSUSHIKA; MIZUNO, 2000). No entanto, a proteína ArcB de

H. influenzae (e também a seqüência deduzida da proteína em A. actinomycetemcomitans)

não apresenta o domínio PAS presente em ArcB de E. coli. Porém, apesar dessa ausência, a

proteína ArcB de H. influenzae é funcional e media a sinalização da transdução em resposta

às condições redox do ambiente (GEORGELLIS et al., 2001), indicando que o sistema

também seria funcional em A. actinomycetemcomitans.

Este sistema ArcAB em E. coli permite que as células respondam a várias condições

respiratórias de crescimento através da regulação da expressão de um grupo de operons

envolvidos no metabolismo aeróbio (MATSUSHIKA; MIZUNO, 2000). Em resposta a baixos

níveis de oxigênio, ArcB é auto fosforilada e fosforila ArcA que age como regulador de

transcrição de genes necessários para manter o crescimento anaeróbio (LEE et al., 2001).

Muitos genes regulados pelo sistema ArcAB foram detectados por possuírem na

região promotora seqüências denominadas ArcA box que se ligam a ArcA fosforilada. Porém,

nem todos os genes que possuem ArcA box estão relacionados ao metabolismo aeróbio de E.

coli (McGUIRE et al., 2000).

Em E. coli os domínios histidina-fosfo-transfer (HPt), como observados em ArcAB,

interagem com mais de um domínio regulador de resposta. Assim, ArcA pode exercer sua

função mesmo em um estado não-fosforilado ou na ausência de ArcB quando é fosforilada

por outra histidina quinase sensora (MIKA; HENGGE, 2005).

A atividade do sistema ArcAB em E. coli parece integrar informações sobre

suprimento de oxigênio e de energia e em condições laboratoriais padronizadas de

crescimento moderadamente aeróbio, a transição do excesso de carbono e energia para a

carência provavelmente é decisivo para a atividade de ArcB (MIKA; HENGGE, 2005).

O fator geral de stress σS (RpoS) é controlado em nível transcricional, translacional e

proteolítico. O fator aumenta rapidamente e compete com a subunidade σ vegetativa de σ70 e

induz a respostas gerais ao stress (HENGGE-ARONIS, 2002) que afetam a expressão de

aproximadamente 10% dos genes de E. coli (WEBER et al., 2005).

Em E. coli, ArcB age como um doador de fosfato direto para ArcA, mas também para

o regulador de resposta “órfão” RssB que quando fosforilado se liga a σS, e age como um

fator de reconhecimento proteolítico ou de ligação para σS. O acúmulo de fator σS em células

que estão entrando em carência provavelmente é controlado pela interferência de quinonas

oxidadas com autofosforilação de ArcB e conseqüente fosforilação de RssB e ArcA, o que

resulta na redução da proteólise de σS e na repressão transcricional de rpoS. Durante a

transição gradual para a fase estacionária, uma mutação em arcB produz efeito reduzido na

proteólise de σS e o fator acumulado durante a entrada na fase estacionária, estimula a

expressão de ArcA (MIKA, HENGGE, 2005; YAMAMOTO et al., 2005).

Perrenoud; Sauer (2005) afirmam que embora se saiba que a regulação transcricional

possua papel chave no estabelecimento das conexões metabólicas, a extensão do que

realmente é controlado in vivo dos fluxos metabólicos é desconhecido. Os autores analisaram

a relação entre ArcA, ArcB, Cra, Crp, Cya, Fnr, e Mlc para o catabolismo aeróbico da glicose

em culturas de E. coli. As mutantes knock outs ArcB, Cra, Fnr, e Mlc demonstram que a

regulação transcricional dependente de ArcA controla direta ou indiretamente o fluxo cíclico

de TCA (ácido tricarboxílico) em culturas aeróbicas e anaeróbicas.

O efeito dos reguladores globais ArcA e Fnr na expressão de genes relacionados à

regulação de oxigênio e a via metabólica da glicose em E. coli sob condições de

microaerofilia foi demonstrado por RT-PCR (SHALEL-LEVANON et al., 2005). A proteína

Fnr contém um cluster FE-S, que age como um sensor redox somente durante o crescimento

anaeróbico maximizando a capacidade de geração energética sob esta condição atmosférica.

Os resultados indicam que uma menor conversão do piruvato a acetil-CoA é a principal razão

dos altos fluxos de lactato desidrogenase (LDH) observados em culturas de cepas duplo

mutantes arcA/ fnr.

Vários fatores de virulência são regulados pelo potencial redox, como a capacidade de

invasão em Salmonella ou a síntese de proteína M em Streptococcus (GUINEY, 1997). O

gene trx, que codifica a tireodoxina, uma proteína universal do stress, foi seqüenciado em A.

actinomycetemcomitans e como em outros organismos, foi associado à adequação da célula ao

potencial redox do ambiente (HENDERSON et al., 2001).

Fong et al. (2003) construíram uma amostra arcB deficiente de A.

actinomycetemcomitans que se mostrou incapaz de crescer sob condições aeróbicas com

limitação de ferro, e apresentou expressão reduzida dos genes afuA e ftnAB que codificam

uma proteína periplasmática de transporte de ferro e ferritina, indicando que arcB pode atuar

como regulador da adaptação e crescimento do microrganismo em condições com limitação

de ferro.

Apesar de muitos estudos fenotípicos e genotípicos sobre os fatores de virulência de A.

actinomycetemcomitans, pouco se sabe sobre os reguladores desses fatores e de reguladores

de respostas a stress ambientais do microrganismo. A capacidade de gerar mutantes em tais

reguladores é uma ferramenta importante na análise da expressão de diversos fatores,

inclusive os relacionados à virulência, pois permite a comparação comportamental entre

amostras mutantes e selvagens frente a diversas condições ambientais.

A diversidade das condições ambientais a que A. actinomycetemcomitans está sujeito

(variações de pH, níveis de oxigênio, diferentes fases de crescimento e oferta de nutrientes)

poderia afetar a expressão de seus fatores de virulência. As condições ecológicas para que o

microrganismo colonize a cavidade oral, tanto na forma de biofilme supra e sub gengival,

sugerem a necessidade da regulação de genes que só seriam expressos em condições de

anaerobiose ou de escassez de nutrientes.

Em A. actinomycetemcomitans não se conhece os genes regulados pelo sistema

ArcAB, assim, este trabalho propõem a construção de uma amostra de A.

actinomycetemcomitans deficiente em arcB e a análise da expressão gênica e características

fenotípicas ligadas à virulência do microrganismo.

6 CONCLUSÕES

Baseados na metodologia empregada no presente estudo, os resultados sugerem que

em A. actinomycetemcomitans, ArcB está associado à regulação de fatores de virulência da

bactéria.

Especificamente, quando cultivadas em meio enriquecido sob atmosfera de

microaerofilia e de anaerobiose, as amostras de A. actinomycetemcomitans selvagem e arcB

deficiente apresentaram:

- desenvolvimento semelhante, indicando ausência de associação entre ArcB e a taxa de

crescimento;

- diferenças na capacidade de adesão e de invasão em células KB;

- diferenças na hidrofobicidade celular;

- diferenças na capacidade de formar biofilme;

- diferenças na capacidade de aderir à hidroxiapatita recoberta por saliva;

- diferenças na expressão relativa dos genes omp29, apaH, cdtB e vppA, sugerindo que ArcB

está envolvido, direta ou indiretamente, na regulação da transcrição destes genes.

REFERÊNCIAS *

AIBA, H.; NAKASAI, F.; MIZUSHIMA, S.; MIZUNO T. Evidence for the physiological

importance of the phosphotransfer between the two regulatory components, EnvZ and OmpR,

in osmoregulation of Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 264, p.14090-14094, 1989.

ALEXEEVA S.; HELLINGWERF K.J.; MATTOS M.J.T. Requirement of ArcA for redox

regulation in Escherichia coli under microaerobic but not anaerobic or aerobic conditions. J.

Bacteriol., v.185, p. 204-209, 2003.

ANDERSON, J.D.; MACNAB, A.J.; GRANSDEN, W.R.; DAMM, S.M.; JOHNSON, W.M.;

LIOR. H. Gastroenteritis and encephalopathy associated with a strain of Escherichia coli

055:K59:H4 that produced a cytolethal distending toxin. Pediatr. Infect. Dis. J., v. 6, p.

1135-1136, 1987.

ARMITAGE, G.C. Development of a classification system for periodontal diseases and

conditions. Ann. Periodontol., v. 4, p. 1- 6, 1999.

ASAKAWA, R.; KOMATSUZAWA, H.; KAWAI, T.; YAMADA, S.; GONÇALVES, R.B.;

IZUMI, S.; FUJIWARA, T.; NAKANO, Y.; SUZUKI, N.; UCHIDA, Y.; OUHARA, K.;

SHIBA, H.; TAUBMAN, M.A.; KURIHARA, H.; SUGAI, M. Outer membrane protein 100,

a versatile factor of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Mol. Microbiol., v. 50, p. 1125-

1139, 2003.

ASIKAINEM, S.; LAI, C.H.; ALALUUSUA, S.; SLOTS, J. Distribution of Actinobacillus

actinomycetemcomitans serotypes in periodontal health and diseases. Oral Microbiol.

Immun., v. 6, p. 115-118, 1991.

AUDIA, J.P.; WEBB, C.C.; FOSTER, J.W. Breaking through the acid barrier: an orchestrated

response to proton stress by enteric bacteria. Int. J. Med. Microbiol., v. 291, p. 97-106,