Detecção de oocistos de Cryptosporidium, spp, em águas de abastecimento superficiais e tratadas da r por Ana Paula Bortolotti Muller - Versão HTML

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ANA PAULA BORTOLOTTI MULLER

DETECÇÃO DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ÁGUAS DE

ABASTECIMENTO SUPERFICIAIS E TRATADAS DA REGIÃO

METROPOLITANA DE SÃO PAULO.

Dissertação apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em

Ciências (Microbiologia).

São Paulo

1999

ANA PAULA BORTOLOTTI MULLER

DETECÇÃO DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ÁGUAS DE

ABASTECIMENTO SUPERFICIAIS E TRATADAS DA REGIÃO

METROPOLITANA DE SÃO PAULO.

Dissertação apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em

Ciências.

Área de concentração:

Microbiologia

Orientador:

Profa. Dra. Vivian Helena Pellizari

São Paulo

1999

Às minhas filhas, Giuliana e

Débora por perdoarem minha ausência na

realização deste, pelo amor incondicional e

por tornarem meus dias muito mais felizes.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Ao meu marido,

Emerson, pela participação e

incentivo constantes na minha

realização profissional e

pessoal.

Aos meus pais, Waldemir e Janete,

por todo amor dedicado a nossa família, pela

perseverança e determinação em tornar

possíveis meus ideais e pela presença

marcante em minha vida.

Aos meus irmãos

e familiares, pelo amor e

confiança que nos mantém

unidos.

AGRADECIMENTOS

• À Profa. Dra. Vivian H. Pellizari, pelo carinho, paciência, confiança e principalmente pela orientação no desenvolvimento deste estudo.

• À Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo (SABESP) por viabilizar a realização deste estudo e pelo interesse em garantir a qualidade do abastecimento de água. Em especial ao Dr. Blum e aos profissionais das Estações de Tratamento, Sérgio, Adilson, Almir, Kleber, Solange, Antonio, Léo, Israel, Sheila, Jones e demais funcionários do laboratório de controle interno pelo fornecimento dos dados físico-químicos e demais esclarecimentos e principalmente por toda paciência durante o período de coleta e pela colaboração direta no desenvolvimento deste estudo.

Aos engenheiros Ferreti, Wilson e Carlos pelo fornecimento dos mapas e auxílios prestados.

• À Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de bolsa de estudo, credibilidade e incentivo à ciência.

• À Dynal France pelo fornecimento dos equipamentos e reagentes utilizados para a purificação das amostras, em especial ao Dr. Felix por todos esclarecimentos prestados.

• Aos professores integrantes da banca do Exame Geral de Qualificação, Profa. Dra. Márcia P.Alves Mayer, Profa. Dra. Dolores U. Menhert, Prof.

Dr. Gabriel Padilla Maldonado e suplentes da mesma, Profa. Petra S.Sanchez e Prof. Dr. Glavur R. Matté pelas sugestões e considerações que muito contribuiram para o aperfeiçoamento deste trabalho.

• Aos amigos do laboratório de Microbiologia Ambiental, Adriana, Andréa, Anderson, Bolivar, Carlos ( in memorian) Carol, Débora, Denise, Eveline, Gabriela e Keili pelo companheirismo, apoio e pelo maravilhoso clima de trabalho em equipe. Em especial a Elisa Mara, pela “modestia”, por toda orientação inicial e colaboração durante o desenvolvimento deste.

• A Andréa Trevisan pelas dicas e orientações durante a fase de elaboração da dissertação e pela alegria contagiante.

• Ao Sr. Luis e Natália pela simplicidade e por toda colaboração indispensável nos trabalhos realizados no laboratório.

• À Rosa C. Gamba, pela determinação e atuação direta no desenvolvimento deste estudo e pela amizade que cresceu a partir do mesmo.

• Aos funcionários da secretaria da Microbiologia, Ana, Naíde e Alice e funcionários da secretaria da Pós-graduação do ICB, Celso e Hiroko pela paciência e atenção dedicados.

• Aos funcionários da biblioteca do ICB/USP pelo apoio nas pesquisas literárias e pelas correções bibliográficas.

• À Profa. Dra. Irma N. Rivera pelas informações e sugestões e principalmente pelo afeto, estímulo e dedicação à ciência.

• Ao Prof. Dr. René P. Schneider, pelas sugestões, contribuições e inúmeros artigos fornecidos.

• Ao Prof. Dr. Sebastião Timo Iaria pelo consentimento da utilização do espaço físico e equipamentos de seu laboratório.

• Ao amigo Fábio Gioia, da MS3 Comunicações, pela valiosa colaboração na elaboração do lay-out deste trabalho.

• Ao colega Fausto pelo estudo estatístico realizado e por esclarecimentos prestados.

RESUMO

O protozoário parasita Cryptosporidium emergiu como um dos mais importantes contaminantes da água responsável por vários surtos de criptosporidiose, afetando mais de 427.000 indivíduos em todo o mundo. Até hoje, pelo menos oito espécies do gênero Cryptosporidium foram descritas, mas somente o C. parvum têm sido associado às doenças gastroentestinais em humanos. A criptosporidiose pode ser fatal para imunocomprometidos e pode debilitar severamente indivíduos imunocompetentes. Os oocistos de Cryptosporidium são resistentes às pressões ambientais, podendo sobreviver por vários meses no ambiente aquático e são também resistentes à desinfecção por cloro utilizada no tratamento convencional de água. Este estudo teve como objetivos determinar a ocorrência e densidade de Cryptosporidium em amostras de água superficiais e tratadas (após floculação, coagulação, sedimentação, filtração e desinfecção) coletadas em duas Estações de Tratamento de Água da cidade de São Paulo. A relação entre os parâmetros da qualidade da água e a ocorrência de oocistos de Cryptosporidium também foi analisada. As amostras de água foram coletadas em intervalos mensais durante o período de um ano. Estas amostras foram concentradas por "precipitação do carbonato de cálcio" (VESEY et alii, 1993a) e através da técnica da "membrana filtrante" (ALDOM & CHAGLA, 1994). Os oocistos foram identificados pela técnica de imunofluorescência direta e a presença destes foi confirmada por microscopia de contraste de fase. Os níveis de coliformes totais e E.coli nas amostras de água foram determinados pela técnica dos tubos múltiplos, empregando substrato fluorogênico e cromogênico (Colilert 18, Iddex). De um total de 24 amostras analisadas, de cada tipo de água (sendo 12 de cada Estação de Tratamento de Água), os oocistos foram detectados em 75% das amostras de água bruta e em 12,5%

das amostras de água tratada, quando estas foram concentradas por precipitação química e em 73,91% das amostras de água bruta e 33,33% das amostras das água tratada, quando as mesmas foram concentradas pela técnica da membrana filtrante. A densidade de oocistos de Cryptosporidium não apresentou correlação significativa com indicadores microbiológicos e os parâmetros físico-químicos de qualidade da água (p > 0,05). Os resultados obtidos sugeriram que o tratamento de água convencional é ineficaz para a remoção de oocistos, ressaltando a necessidade de estabelecer programas de gerenciamento em bacias hidrográficas (mananciais) que efetivamente garantam a baixa densidade de oocistos de Cryptosporidium em águas superficiais captadas para abastecimento.

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO

1. INTRODUÇÃO e OBJETIVOS

01

1.1. Objetivos

06

2. REVISÃO DA LITERATURA

07

2.1. O parasita Cryptosporidium

07

2.1.1. Histórico

07

2.1.2. Taxonomia

08

2.1.3. Ciclo de vida

09

2.2. Criptosporidiose

12

2.2.1. Epidemiologia

12

2.2.1.1. Prevalência e Incidência da

12

criptosporidiose

15

2.2.1.2. Mecanismos de transmissão

2.2.2. Manifestações clínicas e diagnóstico

17

2.2.3. Tratamento

20

2.2.4. Controle e prevenção da criptosporidiose

22

2.3. Ocorrência de Cryptosporidium spp. em água

24

2.3.1. Sobrevivência de C ryptosporidium no ambiente

24

2.3.2. Presença de oocistos em esgoto

25

2.3.3. Presença de oocistos em águas superficiais,

26

subterrâneas e tratadas

2.4. Surtos de criptosporidiose de veiculação hídrica

28

2.5. Métodos para estudo da ocorrência de oocistos de

33

Cryptosporidium em amostras ambientais

2.6. A água em tratamento

38

3. MATERIAIS E MÉTOD0S

46

3.1. Caracterização da região de estudo

46

3.2. Pontos de amostragem

50

3.3. Amostras

54

3.3.1. Coleta das amostras

54

3.3.1.1. Para a determinação de coliformes

54

totais e E.coli

3.3.1.2. Para a pesquisa de oocistos de

58

Cryptosporidium

3.4. Pesquisa de oocistos de Cryptosporidium em

59

amostras de água

3.4.1. Concentração das amostras de água

59

3.4.1.1. Técnica da precipitação do carbonato

59

de cálcio

3.4.1.2. Técnica da dissolução da membrana

60

filtrante

3.4.2. Purificação das amostras de água

62

3.4.2.1. Separação imunomagnética (IMS)

62

3.4.2.2. Flotação em gradiente de Percoll-

63

sucrose

3.4.3. Detecção e quantificação de oocistos

64

3.4.3.1. Detecção de oocistos pela técnica de

64

imunofluorescência direta (IF) e confirmação

por microscopia de contraste de fase

3.4.3.2. Quantificação de oocistos nas amostras

65

de água

3.4.4. Controle negativo das metodologias

66

utilizadas

3.4.5. Análise da sensibilidade das metodologias

66

empregadas

3.5. Determinação de coliformes totais e E. coli

66

3.6. Parâmetros físico-químicos

67

3.7. Análise estatística dos resultados

67

4. RESULTADOS

68

4.1. Pesquisa de oocistos de Cryptosporidium em

68

água

4.1.1. Técnica da membrana filtrante para a

69

concentração das amostras de água

4.1.2. Técnica da precipitação do carbonato de

70

cálcio

4.1.3. Purificação das amostras de água

72

4.1.4. Imunofluorescência direta (IF) e Microscopia

72

de contraste de fase

4.1.5. Controle negativo das metodologias

74

utilizadas

4.1.6. Sensibilidade das metodologias empregadas

74

4.2. Indicadores bacteriológicos

75

4.3. Parâmetros físico-químicos

75

4.4. Análise estatística dos resultados

78

4.4.1. Comparação das metodologias de

78

concentração para detecção de oocistos de

Cryptosporidium

4.4.2. Avaliação da eficiência de tratamento de

79

água na remoção de oocistos

4.4.3. Comparação da qualidade da água bruta e

80

tratada das ETAs

4.4.4. Correlações entre a ocorrência de oocistos e

81

os parâmetros físico-químicos

4.4.5. Correlação entre a presença de oocistos de

82

Cryptosporidium e indicadores bacteriológicos

5. DISCUSSÃO

83

5.1. Pesquisa de oocistos de Cryptosporidium em

83

águas superficiais

5.2. Pesquisa de oocistos de C ryptosporidium em

86

águas tratadas

5.3. Avaliação das metodologias propostas para a

89

pesquisa de oocistos de Cryptosporidium em amostras

de água

5.4. Correlação entre a ocorrência de Cryptosporidium

91

e indicadores bacteriológicos

5.5. Correlação entre a ocorrência e densidade de

95

oocistos de Cryptosporidium e parâmetros físico-

químicos da água

6. CONCLUSÕES

97

7. RECOMENDAÇÕES

99

8. ANEXO

101

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

108

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

Figura

Pág.

1. Ciclo de Vida do Cryptosporidium parvum (SMITH

10

& ROSE, 1998)

2. Etapas do Tratamento Convencional de Água

A. Entrada de água bruta na ETA

43

B. Lagoa de tranquilização

43

C. Decantador

44

D. Decantador; tomada superficial de água

44

decantada

E. Filtros

45

F. Lavagem dos filtros

45

3. Mapa da área de estudo e localização das

48

Estações de Tratamento de Água (ETAs)

4. Área de estudo – RMSP

49

5. A. Esquema da Estação de Tratamento – ETA-A

51

5. B. Esquema da Estação de Tratamento – ETA-B

52

6. Fluxograma da metodologia empregada para

pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. e

indicadores bacteriológicos em amostras de água.

53

7. A. Captação de água da ETA-A – ponto de coleta

55

de água bruta.

7. B. Captação de água da ETA-B – ponto de coleta

56

de água bruta.

8. A. Coleta de água tratada no laboratório interno da

57

ETA-A

8. B. Coleta de água tratada no laboratório interno da

57

ETA-B

9. Frasco de coleta utilizado para pesquisa de

oocistos de Cryptosporidium, empregando a

precipitação do CaCO

61

3 para concentração das

amostras.

10. A. Coleta e concentração de amostra de água

61

bruta através da técnica da membrana filtrante.

10. B. Membrana de acetado celulose (293 mm /

61

1,2µm) após a filtração de amostra de água bruta.

11. Porcentagem de detecção de oocistos de

Cryptosporidium spp. em amostra de água bruta e

tratada (ETA-A e ETA-B).

71

12. Oocisto de Cryptosporidium spp. detectado por IF

73

(400x) em amostra de água bruta.

13. Oocisto de Cryptosporidium sob microscopia de

contraste de fase (1000x) detectado em amostra

de água bruta.

73

14. Oocisto de Cryptosporidium spp. detectado por IF

74

(400x) em amostra de água tratada.

LISTA DE TABELAS

Tabela

Pág.

1. Resumo dos principais surtos de criptosporidiose

associados ao consumo ou contato com águas

contaminadas, relatados na literatura no período

29

de 1983 a 1998

2. Dados técnicos das Estações de Tratamento de

50

Água

3. Volumes (litros) filtrados das amostras de água

bruta e tratada nas ETAs, A e B, utilizando-se a

técnica da membrana filtrante para a

58

concentração das amostras

4. A. Resultados obtidos na pesquisa de indicadores

bacteriológicos e oocistos de Cryptosporidium na

ETA – A, empregando a técnica da membrana

filtrante e a precipitação do carbonato de cálcio

para a concentração das amostras de água bruta

68

e tratada

4. B. Resultados obtidos na pesquisa de indicadores

bacteriológicos e oocistos de Cryptosporidium na

ETA – B, empregando a técnica da membrana

filtrante e a precipitação do carbonato de cálcio

para a concentração das amostras de água bruta

69

e tratada

5. A. Detecção de oocistos de Cryptosporidium ssp.

70

em amostras de água bruta e tratada, utilizando a

técnica da membrana filtrante para a

concentração das amostras

5. B. Detecção de oocistos de Cryptosporidium ssp.

em amostras de água bruta e tratada, utilizando a