Detecção e transmissão planta-semente de Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides... por Alderí Emídio de Araújo - Versão HTML

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que as sementes podem transportar patógenos, os quais ali encontram condições adequadas para sobreviver, mantendo suas características patogênicas, podendo ainda ser disseminados e introduzidos nas lavouras, constituindo-se em fonte de inóculo inicial de doenças que podem reduzir o estande, debilitar as plantas e causar epidemias (BAKER; SMITH, 1966; MENTEN et al., 2005;)

No caso do algodoeiro, a semente é veículo de transporte e transmissão de vários patógenos, os quais podem causar doenças iniciais importantes ou epidemias de graves proporções. Neste sentido a produção de sementes com controle da qualidade sanitária e sua utilização isenta de patógenos, deve-se constituir uma premissa básica no sistema de produção de algodão.

Embora ainda sejam poucos os estudos que forneçam elementos para o

estabelecimento de padrões de sanidade que visem minimizar os efeitos da incidência de patógenos nas sementes de algodoeiro, tem sido consenso a necessidade de, à luz do conhecimento atual, serem definidos critérios que determinem níveis máximos de ocorrência de patógenos específicos em lotes de sementes, que assegurem o mínimo de danos à cultura durante o seu estabelecimento e no decorrer de seu ciclo.

Assim é que o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento estabeleceu normas específicas e padrões de identidade para produção e comercialização de sementes de diversas cultura, incluindo o algodão (DOU, 2005 apud BRUNETTA; BRUNETTA; FREIRE, 2007). O padrão de sanidade em nível de campo para C.

gossypii var. cephalosporioides é zero para as sementes C1 e C2 e 2% para as sementes S1 e S2.

A definição de padrões de sanidade para sementes de algodoeiro impõe a necessidade de se produzir sementes isentas do agente causal da ramulose e, como conseqüência, a necessária realização do teste de sanidade de sementes visando à detecção de patógenos, para que sejam atendidas as exigências da legislação vigente.

O método empregado normalmente para a detecção do agente causal da

ramulose é o do papel de filtro, que se baseia na avaliação de sinais do patógeno desenvolvido sobre as sementes, seguida da sua identificação morfológica, e ou, sintomas nas plântulas (NEERGAARD, 1979), cujos resultados têm sido satisfatórios.

Entretanto uma das desvantagens do método é o crescimento das plântulas durante o 26

período de incubação das sementes que, muitas vezes, pode criar condições para o desenvolvimento de fungos indesejáveis e prejudicar a visualização e caracterização do patógeno (DHINGRA; ACUÑA, 1997; BARBA et al., 2002). Visando minimizar esse problema, assim como aumentar a sensibilidade do método têm sido utilizadas técnicas para inibir a germinação.

Essas técnicas constituem variações do método do papel de filtro e entre as mais utilizadas destacam-se o congelamento e o uso de solução de 2,4 D (LIMONARD, 1966; REGO, 2007). Entretanto o uso do 2,4 D apresenta a desvantagem da manipulação de um produto tóxico, enquanto o congelamento necessita de ampliação da logística do laboratório visando a utilização de freezer e a transferência de material incubado de um local para outro, resulta em dispêndio de tempo e mão-de-obra. O uso da restrição hídrica tem se mostrado eficiente para inibir a germinação das sementes em testes de sanidade como alternativa aos métodos tradicionais (CAMARGO, 1998, COUTINHO, 2000), e vem sendo empregado com sucesso em testes de sanidade de sementes de algodão (GUIMARÃES, 1991; MACHADO, 2002). Entretanto deve-se ressaltar que, em que pese a eficiência destas variações, é importante maximizar os benefícios de seu emprego, tendo em vista que as mesmas sempre representarão custos adicionais ao método do papel de filtro.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência dos solutos manitol NaCl e KCl como inibidores de germinação comparados ao método do papel de filtro tradicional, ao 2,4D e ao congelamento, sobre a germinação de sementes de algodoeiro e sobre a detecção de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides.

2.2 Desenvolvimento

2.2.1 Revisão bibliográfica

A sanidade de sementes deve ser uma preocupação permanente de técnicos e produtores visando minimizar os efeitos danosos causados por patógenos a elas associados que podem causar danos expressivos ao estabelecimento da cultura, assim como contribuir decisivamente para a ocorrência de severas epidemias durante todo o seu ciclo.

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Diversos patógenos podem estar presentes tanto externa como internamente na semente do algodoeiro podendo induzir doenças importantes. Entre estes destacam-se Rhizoctonia solani, Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (WATKINS, 1981; GOULART, 2005), , várias espécies de Fusarium (RONCADORI et al., 1971; DAVIS, 1977) além de Colletotrichum gossypii e Colletotrichum gossypii var.

cephalosporioides, o primeiro conhecido, normalmente, como agente causal do tombamento de plântulas e da antracnose e o segundo, como agente causal da ramulose (CIA; ARAÚJO, 1999; GOULART, 2005).

De acordo com Cia (1977) C. gossypii var. cephalosporioides foi detectado pela primeira vez em sementes de algodoeiro no município de Rancharia estado de São Paulo. Posteriormente, inúmeros trabalhos têm demonstrado o transporte e a transmissão do fungo pela semente e avaliado o impacto do plantio de sementes infectadas sobre o desenvolvimento da ramulose no campo (LIMA et al., 1985; SANTOS et al., 1994; ARAÚJO, 2004; ARAÚJO; CHITARRA, 2005).

Os testes de sanidade de sementes de algodão vêm sendo amplamente

utilizados visando identificar precocemente patógenos por elas transportados e/ou transmitidos para que se possam tomar as medidas de controle adequadas antes que a semente seja colocada no campo.

De acordo com Pizzinatto (1987) diversos métodos, os quais envolvem diferentes processos, têm sido utilizados em testes de sanidade de sementes de algodão.

Entretanto para a detecção de vários patógenos ou de um patógeno específico, deve-se empregar ou padronizar, tanto quanto possível, um método rápido, simples e reproduzível.

Colletotrichum gossypii foi detectado em sementes de algodão por Lehman (1938) através do exame microscópico de sementes e plântulas infectadas no teste padrão de germinação, ou seja, papel toalha umedecido e esterilizado e incubação a 280C. Por outro lado Halfon-Meiri e Volcani (1977) desenvolveram o método de sintoma em plântula para detecção de X. axonopodis pv malvacearum e Colletotrichum gossypii.

A novidade do método era a detecção de ambos os patógenos em uma mesma amostra de sementes. O método baseia-se na identificação dos sintomas de ambos os 28

patógenos em diferentes partes de plantas com 14 dias de idade, tendo se mostrado um método bastante sensível.

Ruano (1980) comparou os métodos do papel de filtro e o de sintoma em plântulas para detecção de diferentes fungos em sementes de algodoeiro. O autor empregou sementes com línter e, ao contrário de Lehman (1938) e Helfon-Meiri e Volcani (1977), utilizou substrato de areia e vasos de plástico para a avaliação de sintomas em plântulas, após 14 dias de incubação, sob temperatura de 23-260C e regime de luz alternada de 12 horas de luz e 12 de escuro. O autor verificou que o método de sintoma em plântula foi mais sensível para a detecção de C. gossypii.

Uma das limitações do método de sintoma em plântulas empregando-se

substrato de areia, é a mobilização de materiais necessários, o tempo e a mão-de-obra despendidos no processo, assim como o espaço necessário para a sua execução.

Assim sendo, sua utilização não tem sido recomendada em análises de rotina.

Basicamente dois métodos têm sido empregados para detecção de fungos em sementes de algodoeiro, sendo o método do papel de filtro, com algumas variações, o mais utilizado, enquanto o método de incubação em meio de ágar é utilizado apenas em algumas circunstâncias (BRASIL, 1992, MACHADO, 2002).

O método do papel de filtro tem se mostrado eficiente na detecção de C. gossypii var cephalosporioides (LIMA et al., 1985; SANTOS, 1993; TANAKA; MENTEN; MACHADO, 1996). Por esse método, as sementes são dispostas de maneira eqüidistantes em placas de Petri ou outro recipiente transparente sobre papel absorvente, normalmente em três camadas, as quais são o bastante para fornecer o nível de umidade necessário para a duração do teste. As sementes são incubadas por um período de tempo determinado, em geral uma semana, sob temperatura de 20 ±

20C, com fotoperíodo de 12 horas (NEERGAARD, 1979).

A germinação rápida das sementes de algumas espécies durante o período de incubação, pode resultar em contaminação da amostra e dificuldades na detecção e caracterização dos patógenos (MACHADO, 1988). Neste sentido o uso de inibidores de germinação tem sido encorajado.

O congelamento das sementes e o uso de 2,4 D (diclofenoxiacetato de sódio) em solução com a água utilizada no umedecimento do papel absorvente constituem as 29

modificações mais tradicionais do método do papel de filtro visando inibir a germinação das sementes, ou mesmo reduzir o comprimento das plântulas (LIMONARD, 1968; NEERGAARD, 1979). O 2,4 D é normalmente recomendado na concentração de 0,2%

(LUCCA FILHO, 1987), entretanto pode variar de acordo com a cultura e com o patógeno alvo que se deseja detectar. Essa variação pode ser entre 10 e 2000 ppm (BRASIL, 1992)

Farias et al. (2003) utilizaram 2,4 D a 0,5% para inibir a germinação de sementes de milho em teste de sanidade. Por outro lado Goulart (2001) avaliando a incidência de fungos em sementes de soja no Mato Grosso do Sul, utilizou 2,4 D na concentração de 0,02% visando inibir a germinação das sementes. Trabalhando também com sementes de soja, Machado et al, (2003) empregaram solução de 2,4 D a 10 ppm para inibir a germinação.

Em sementes de algodão, vários autores têm utilizado o 2,4 D na concentração de 10 ppm (MACHADO, 2002; ARAÚJO, 2004; TEIXEIRA et al, 2002). De acordo com.

Sobreira (1988) essa concentração prejudicou o crescimento de C. gossypii var.

cephalosporioides, entretanto Goulart (2001) trabalhando com sementes de soja não verificou problemas na detecção de C. truncatum, tendo utilizado 0,02% de 2,4 D para inibir a germinação.

O método do papel de filtro com congelamento tem sido bastante utilizado na detecção de fungos associados a sementes de gramíneas (COUTINHO et al., 2001; GARCIA JÚNIOR et al., 2007), porém tem se estendido a diferentes espécies.

Magalhães et al. (2004) utilizaram o método do papel de filtro com congelamento para a detecção de espécies de Alternaria em cenoura, enquanto Teixeira et al, 2002

utilizaram o mesmo método para detecção de patógenos associados a sementes de arroz, milho, trigo e cenoura.

Nascimento et al, (2003) também utilizaram o método do congelamento visando a detecção de fungos em sementes de amendoim bravo ( Pterogyne nitens). O

congelamento não tem sido normalmente utilizado em sementes de algodão. De acordo com Farias et al., 2003 a ruptura das células pode induzir a produção de exsudatos das sementes, que são drenados pelo substrato de papel podendo provocar infecções secundárias.

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O método consiste basicamente em manter os recipientes com as sementes sob a temperatura de incubação por 24 horas, transferindo-os em seguida para um freezer com temperatura de -180C a -200C por 24 horas e, posteriormente, transferindo-os outra vez para a temperatura de incubação (NEERGAARD, 1979, BRASIL, 1992).

A restrição hídrica vem sendo amplamente utilizada como método para inibir a germinação das sementes durante o período de incubação do teste de sanidade e, assim, facilitando a identificação e caracterização de patógenos a elas associados.

O processo de germinação das sementes está intrinsecamente ligado à absorção de água pelo embrião e pelos tecidos circunvizinhos. Todas as células dos tecidos embrionários o dos demais tecidos apresentam potencial hídrico, que pode ser específico para cada tecido, célula ou até mesmo a cada compartimento celular. Em função disso, a semente como um todo pode se comportar como uma célula gigante, apresentando relações hídricas específicas (CASTRO; HILHORST, 2004).

As sementes, em geral, apresentam um padrão trifásico de absorção de água e hidratação durante o processo de embebição. A fase I é rápida e dirigida pelo potencial matricial da semente seca. Nessa fase ocorrem aumento da respiração e acúmulo de ATP, síntese de mRNA e reparo de DNA, ativação de polissomos e síntese de proteínas a partir de mRNAs recentemente sintetizados. A fase II se caracteriza pela preparação e ativação do metabolismo na qual ocorrem a síntese e duplicação do DNA, início da degradação de reservas, alongamento das células da radícula, protusão da radícula e mitose. Na fase III ocorre um aumento no conteúdo de água da semente devido à absorção associada com o início do crescimento do embrião (BEWLEY; BLACK, 1994; CASTRO; HILHORST, 2004).

O conhecimento das diferentes fases do processo germinativo das sementes deu margem a estudos sobre técnicas de controle da absorção de água pelas sementes.

Dentre estas o condicionamento osmótico visa permitir a ocorrência das fases I e II e impedir que a umidade alcance níveis que permitam o elongamento celular e a conseqüente emergência da radícula, fenômeno verificado na fase III (HEYDECKER; HIGGINS; 1975; BRADFORD, 1986 apud MACHADO, 2002). Neste sentido o uso de diferentes solutos tem sido proposto para controlar o processo de hidratação das sementes e, assim, impedir que o processo de germinação se complete, evitando 31

problemas decorrentes do crescimento das plântulas durante o período de incubação do teste de sanidade.

Um problema a ser considerado é a possibilidade da restrição hídrica induzir redução no crescimento fúngico. Neste sentido, alguns estudos têm sido realizados visando identificar os potenciais osmóticos mais adequados que dificultem a germinação, mas não interfiram significativamente no crescimento dos patógenos.

Rey et al., 2005 avaliaram o crescimento micelial de raças de Colletotrichum lindemuthianum utilizando sacarose e NaCl sob diferentes potenciais osmóticos, constatando crescimento radial máximo nos potenciais de -0,6 e -0,8 MPa.

Farias et al, (2003) utilizaram NaCl, KCl, polietilenoglicol, manitol e sacarose visando inibir a germinação de sementes de trigo e milho e verificaram uma redução expressiva no percentual de sementes germinadas com o incremento no nível de restrição hídrica imposta ao substrato e não observaram diferenças na incidência de fungos associados às sementes.

Coutinho (2000) verificou que a restrição hídrica induzida por NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos variando entre -0,6 a -0,9 MPa, inibiram eficientemente a germinação das sementes e não interferiram na detecção de fungos a elas associados.

Machado (2002) avaliou o efeito da restrição hídrica induzida por NaCl e Manitol, em diferentes potenciais osmóticos, com o objetivo de utilizar a restrição hídrica como método alternativo ao uso do 2,4 D na inibição da germinação de sementes de algodoeiro em testes de sanidade. O autor verificou que os solutos em potenciais osmóticos entre -0,6 e -1,2 MPa inibiram a germinação das sementes em níveis similares ao 2,4 D e observou também que os solutos utilizados em potencial osmótico de -1,0 MPa não interferiram no desenvolvimento de Fusarium oxysporum f. sp.

vasinfectum, Lasiodiplodia theobromae, Colletotrichum gossypii e C. gossypii var.

cephalosporioides.

2.2.2 Material e métodos

2.2.2.1 Obtenção do inoculo

O ensaio foi realizado no Laboratório de Patologia de sementes da ESALQ/USP.

Utilizou-se o isolado 242 de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, obtido no 32

estado de Goiás e pertencente à micoteca da Embrapa Algodão, Campina Grande-PB.

O isolado foi repicado para placas de Petri com meio de cultura BDA onde se manteve em crescimento até dez dias.

2.2.2.2 Inoculação das sementes

Sementes de algodoeiro da cultivar Delta Opal, num total de 50 por placa, foram colocadas em contato com micélio e conídios do patógeno conforme metodologia descrita por Tanaka e Menten (1991). Em seguida as placas foram agitadas de modo que as estruturas fúngicas pudessem estabelecer contato, tanto quanto possível, com o máximo de superfície das sementes. Posteriormente as placas foram deixadas em repouso sob condições de temperatura ambiente do laboratório, por um período de 24

horas, quando foram retiradas e colocadas em saco de papel Kraft. Em seguida as sementes inoculadas foram submetidas ao teste de sanidade pelo método do papel de filtro, visando identificar o percentual de infecção do lote pelo patógeno.

2.2.2.3 Inibidores de germinação

Utilizaram-se manitol, KCl e NaC,l nos potenciais osmóticos de -0,6 e -0,8 MPa.

Para obtenção da quantidade de soluto empregado utilizou-se o software SPPM

(MICHEL; RADCLIFFE, 1995). O 2,4 D foi utilizado na concentração de 10µg/ml e o congelamento foi realizado como descrito em Brasil (1992). No cálculo das soluções osmóticas foi utilizada a temperatura de 200C.

2.2.2.4 Teste de sanidade

As sementes foram colocadas sobre três camadas de papel de filtro, em placas de Petri plásticas de 9 cm de diâmetro, em um total de dez sementes por placa, utilizando-se os diferentes inibidores de germinação em solução, para promover o molhamento do substrato e um tratamento com água destilada. Esta última também foi empregada no teste de sanidade quando se aplicou, às sementes, o congelamento. As placas foram incubadas em câmara de crescimento sob luz ultravioleta a 20 ± 20C

durante sete dias. Decorrido esse período foi feita a avaliação da incidência de C.

gossypii var. cephalosporioides nos diferentes tratamentos.

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2.2.2.5 Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento foi o inteiramente casualizado com seis tratamentos regulares, três tratamentos adicionais e quatro repetições, constituindo-se cada repetição de cinco placas de Petri de 9 cm de diâmetro com 10 sementes cada uma.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste t e de Tukey através do procedimento GLM

do software de estatística SAS® (SAS Institute, 2003). Os dados de percentagem de incidência foram transformados para x(2,3) visando atender aos pressupostos da análise de variância.

2.2.3 Resultados e discussão

A incidência de C. gossypii var. cephalosporioides obtida no teste de sanidade das sementes de algodoeiro, pelo método do papel de filtro, sem o uso de inibidores de germinação, após a inoculação, foi de 96%. Esse resultado é compatível com aquele obtido por Tanaka e Menten (1991), empregando sementes sem assepsia. No presente trabalho, mesmo com mesmo após a assepsia superficial realizada com hipoclorito de sódio a 2%, por um minuto, após a inoculação, os níveis de incidência do patógeno nas sementes permaneceram elevados, sendo reduzidos em apenas 3% .

Não estava incluído nos propósitos deste trabalho comparar métodos de inoculação, mas tão somente empregar um método que permitisse obter uma quantidade de inóculo nas sementes, necessário à avaliação do desempenho de inibidores de germinação, quanto à eficiência na detecção do patógeno. Entretanto convém ressaltar que, mais recentemente, utilizando a técnica de restrição hídrica, Machado et al. (2004) obtiveram percentuais de incidência do patógeno nas sementes acima de 80%, quando utilizaram potencial osmótico de -0,8 MPa. Também Celano (2004) obteve percentual de incidência de C. gossypii var. cephalosporioides, de cerca de 75%, quando inoculou sementes de algodoeiro empregando o método da restrição hídrica. Os autores argumentam que a inoculação por esse método permite a infecção pelo patógeno de maneira mais efetiva, evitando, assim, apenas a contaminação superficial.

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Com base na análise de variância observou-se significância para os tratamentos manitol, NaCl e KCl, pelo teste F, e efeito da interação inibidores x potencial osmótico em relação às variáveis estudadas. Os solutos foram mais eficientes em reduzir o percentual de germinação e o comprimento da radícula, bem como induziram maior incidência do patógeno nas sementes. As sementes submetidas ao congelamento não germinaram, porém a incidência do patógeno nesse tratamento foi baixa (Tabela 2.1).

Os dados do presente trabalho concordam com aqueles obtidos por Machado (2002) que observaram menor percentagem de germinação e menor comprimento de radícula, em teste de sanidade de sementes de algodoeiro, empregando os solutos NaCl e Manitol, em relação à água destilada e ao 2,4 D.

Tabela 2.1 - Efeito de solutos com diferentes potenciais osmóticos empregados em teste de sanidade de sementes de algodoeiro, sobre a germinação das sementes, comprimento da radícula e incidência de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides em relação ao tratamento-padrão de água destilada, ao 2,4D e ao congelamento. Piracicaba, 2007

Comprimento da

Tratamentos* Germinação

(%)

Incidência (%)

radícula (cm)

Água destilada

96,00a

34,45ª

67,00a*

2,4D 97,00a

8,73b

63,00a

Congelamento 0,00 0,00 46,50b

Média

96,59 a 21,59 ª 58,80 a

Manitol 73,12a

10,44C

77,00A

NaCl 71,00A

12,41B

74,50A

KCl 63,25B

14,46ª

60,50B

Média

69,10 b

12,43 b 70,67 b

CV:

7,574 12,01 18,49

*Tratamentos comparados nas colunas

a, b: significativo a 1% de probabilidade pelo teste de Tukey para tratamentos adicionais.

A, B: significativo a 1% de probabilidade para os solutos pelo teste de Tukey para solutos.

a, b: significativo a 1% de probabilidade para solutos x tratamentos adicionais pelo teste t.

O potencial osmótico de -0,8 MPa foi mais eficiente em inibir a germinação das sementes tanto quando se empregou o soluto manitol como inibidor quanto o NaCl. O

soluto KCl mostrou-se eficiente em inibir a germinação nos dois potenciais osmóticos utilizados (Tabela 2.2). Esses resultados também estão de acordo com aqueles obtidos por Machado (2002) que empregando NaCl e manitol nos potenciais osmóticos de -0,8

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MPa observou uma maior redução na percentagem de germinação das sementes e comprimento das plântulas de algodoeiro, em relação ao potencial de -0,6 MPa e semelhante à obtida como uso de 2,4 D como inibidor de germinação.

Braccini et al. (1996), trabalhando com sementes de soja, verificaram que potenciais osmóticos inferiores a -0,3 MPa foram críticos para a germinação das sementes, enquanto Farias et al. (2003), avaliando o efeito da restrição hídrica induzida por diferentes solutos sobre a germinação de sementes de trigo e milho, constataram que o percentual de germinação das sementes foi drasticamente reduzido com o aumento no nível de restrição hídrica aplicada ao substrato. O manitol induziu níveis de germinação próximos a zero quando utilizado em potenciais osmóticos inferiores a -0,8

Assim como foi observado em sementes de milho e trigo por Farias et al, (2003) que constataram redução nos níveis de germinação para zero e 1% respectivamente, no presente trabalho o KCl foi eficiente na redução dos níveis de germinação das sementes de algodoeiro nos potenciais osmóticos de -0,8 e -0,6 MPa, porém não atingindo os níveis obtidos por aqueles autores.

Coutinho et al. (2001) também constataram que o NaCl e o KCl, utilizados nos potenciais osmóticos de -0,6 e -0,7 MPa, induziram ou retardaram a germinação de plântulas de arroz e feijão em teste de sanidade de sementes dessas espécies pelo método do papel de filtro.

O aspecto fundamental que faz o uso de inibidores de germinação ganhar importância na realização de testes de sanidade de sementes, é a germinação e o conseqüente crescimento da radícula durante o período de incubação, dificultando a visualização de patógenos associados às sementes bem como, em alguns casos, aumentando a probabilidade da ocorrência de contaminações externas. Neste sentido, em que pese a germinação ser uma variável importante, o comprimento da radícula ganha maior dimensão que àquela, no que se refere à exeqüibilidade do teste de sanidade.

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Tabela 2.2 - Efeito de inibidores de germinação em diferentes potenciais osmóticos sobre a percentagem de germinação de sementes de algodoeiro em teste de sanidade pelo método do papel de filtro. Piracicaba, 2007

Potencial Osmótico

Inibidor de germinação

- 0,6 Mpa

- 0,8 MPa

Germinação (%)

Manitol 81,0aA

65,3bB*

NaCl 86,5aA

59,0bB

KCl

64,0bA

62,55bA

*Médias seguidas da mesma letra minúscula na vertical e maiúscula na horizontal, não diferem pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade.

No presente trabalho, houve efeito significativo dos solutos, pelo teste F, sobre o comprimento da radícula, em relação aos tratamentos adicionais de água destilada e 2,4D. Não houve germinação quando as sementes de algodoeiro foram submetidas ao congelamento.

Entre os solutos, não houve diferença de comprimento de radícula nos potenciais osmóticos utilizados, em relação ao Manitol e ao KCl. Já em relação ao NaCl, a radícula se desenvolveu menos quando se utilizou o potencial osmótico de -0,8

(Tabela 2.3)

Machado et al. (2003) observaram redução crescente do comprimento da radícula em sementes de soja com a crescente elevação da restrição hídrica. Os mesmos resultados foram obtidos por Coutinho et al (2001) que constataram inibição crescente do crescimento da radícula em sementes de arroz e feijão, quando a restrição hídrica do substrato foi elevada, utilizando os solutos Manitol, NaCl e KCl.

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Tabela 2.3 - Efeito de inibidores de germinação em diferentes potenciais osmóticos sobre o comprimento da radícula em teste de sanidade de sementes de algodoeiro pelo método do papel de filtro.

Piracicaba, 2007

Potencial Osmótico

Inibidor de germinação

- 0,6 Mpa

- 0,8 MPa

Comprimento da radícula (cm)

Manitol

9,48aA

11,40aA*

NaCl

14,86bA

9,95aB

KCl

15,41bA

13,51bA

*Médias seguidas da mesma letra minúscula na vertical e maiúscula na horizontal, não diferem pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade

O congelamento interferiu de maneira significativa na germinação das sementes de algodoeiro impedindo que esta ocorresse. Rey et al. (2005), trabalhando com inibidores de germinação de sementes de trigo e milho também verificaram que o congelamento reduziu os níveis de germinação a zero. Problemas fisiológicos associados ao congelamento de sementes, provavelmente seja um fator de desestímulo ao seu emprego como inibidor de germinação em sementes de algodoeiro. Farias et al.

(2003) afirmam que o congelamento induz a morte das sementes pela ruptura das células, liberando exsudatos que são drenados no substrato de papel, podendo induzir contaminações por fungos secundários. Embora não quantificado, esse problema não foi observado no presente trabalho. Entretanto, os níveis de incidência de C. gossypii var. cephalosporioides foram muito baixos comparados aos demais tratamentos, tanto a água destilada e 2,4 D, quanto aqueles onde foram empregados os solutos.

A literatura é escassa no que se refere à avaliação comparativa do congelamento com outros métodos empregados para inibir a germinação de sementes no teste de sanidade. O método é rotineiramente utilizado na detecção de fungos em sementes de gramíneas como arroz, trigo, cevada e milho (NAKAMURA; SADER, 1986; COUTINHO, et al. 2001; TEIXEIRA et al. 2002; GARCIA JÚNIOR, 2007). Barba et al. (2002) trabalhando com diferentes métodos de detecção de Bipolaris sorokiniana em sementes de cevada, incluindo meios seletivos, não constataram diferenças na detecção do patógeno quando as sementes foram submetidas ao congelamento. Farias et al. (2003) também não constataram diferenças entre o congelamento e a restrição hídrica na detecção de fungos associados a sementes de milho e trigo. Por outro lado Athayde 38

Sobrinho et al. (2003) trabalhando com sementes de feijão caupi e diferentes inibidores de germinação, verificaram que o congelamento inibiu a expressão de Macrophomina phaseolina, cujos valores foram significativamente inferiores aos tratamentos com NaCl, KCl e manitol em concentrações que variaram de -0,6 MPa a -0,9 MPa.

Uma preocupação recorrente em testes de sanidade empregando a restrição hídrica é quanto à possibilidade de inibição do crescimento fúngico prejudicar a sua detecção. Entretanto, no presente trabalho, o potencial osmótico de -0,8 MPa tanto para o manitol quanto para o NaCl, mostrou-se mais eficiente em favorecer a incidência do patógeno nas sementes e, por conseguinte, a sua detecção, em relação ao potencial osmótico de -0,6 MPa (Tabela 2.4). Farias et al. (2003) verificaram que a restrição hídrica induzida em sementes de milho e trigo por NaCl ,KCl e manitol não prejudicou a detecção de fungos como Alternaria, Bipolaris, Fusarium, Phoma, Trichoderma, Cephalosporium e Penicillium.

Trabalhando com uma amplitude maior de potenciais osmóticos, Machado (2002) observou que a restrição hídrica induzida por NaCl em potenciais osmóticos variando entre -0,6 e -1,2 MPa não afetou a detecção de C. gossypii e C. gossypii var.

cephalosporioides em sementes de algodoeiro

Do mesmo modo Machado et al. (2004) avaliaram o efeito da restrição hídrica imposta por Manitol em potenciais osmóticos variando entre -0,4 e -1,0 MPa e constataram que o crescimento de C. gossypii var. cephalosporioides não foi afetado.

Tabela 2.4 - Efeito de inibidores de germinação em diferentes potenciais osmóticos sobre os níveis de detecção de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides em sementes de algodoeiro, em teste de sanidade pelo método do papel de filtro. Piracicaba, 2007

Potencial Osmótico

Inibidor de germinação

- 0,6 Mpa

- 0,8 MPa

Incidência (%)

Manitol 62,00aA

92,00aB*

NaCl 62,50aA

86,50aB

KCl

67,50aA

62,5bA

*Médias seguidas da mesma letra minúscula na vertical e maiúscula na horizontal, não diferem pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade

39

No presente trabalho, o KCl, nos dois potenciais osmóticos, reduziu a incidência do patógeno nas sementes. Os percentuais de incidência do patógeno obtidos com o emprego desse soluto foram compatíveis com aqueles obtidos quando se utilizou o 2,4

D. O efeito deletério desse último sobre o crescimento fúngico foi relatado por Sobreira (1988) que observou redução na incidência de C. gossypii var. cephalosporioides em sementes de algodoeiro a partir de 10 ppm.

Coutinho et al. (2001) constataram que a restrição hídrica proporcionada pelos solutos NaCl, KCl e Manitol e com potenciais osmóticos de -0,8 e -0,9 MPa em sementes de arroz, não interferiu no crescimento micelial de C. lindemuthianum, Phoma sorghina, Pyricularia grisea, Gerlachia oryzae e Rhizoctonia solani. Por outro lado Rey et al. (2005) avaliaram o crescimento micelial de C. lindemuthianum, em meio de cultura Mathur, sob diferentes potenciais osmóticos de NaCl e Sacarose, e concluíram que a restrição hídrica pode ser empregada como inibidor de germinação de sementes de feijoeiro, em testes de sanidade para a detecção do patógeno, sem afetar o seu desenvolvimento. No presente trabalho, o KCl reduziu a incidência de C. gossypii var.

cephalosporioides enquanto os solutos manitol e NaCl, no potencial osmótico de -0,8

MPa não afetaram a sua detecção.

Farias et al. (2003) afirmam que, para ser utilizado em análises de rotina, o soluto deve ser de fácil aquisição, baixo custo e deve promover a inibição ou retardamento da germinação em potenciais osmóticos menos negativos, para diminuir a quantidade de soluto necessário ao preparo da solução. Com base nessa premissa, embora Machado (2002) afirme que manitol e NaCl, no potencial osmótico de -1,0 MPa, não interferiram no desenvolvimento e detecção de C. gossypii var. cephalosporioides, os resultados do presente trabalho sugerem que o potencial osmótico de -0,8 MPa, também avaliado pelo autor, deva ser utilizado para detectar o agente causal da ramulose em sementes de algodoeiro, em análises de rotina.

2.3 Conclusões

Os solutos foram mais eficientes em reduzir a germinação das sementes de algodoeiro. Embora o congelamento tenha impedido a germinação, a incidência do patógeno nas sementes foi reduzida e, apesar de ter havido acentuada redução do 40

comprimento da radícula no tratamento com 2,4D, as desvantagens relacionadas ao seu manuseio, não justificam o seu emprego em testes de sanidade. O potencial osmótico de -0,8 MPa nos solutos manitol e NaCl proporcionou menor germinação e comprimento de radícula, bem como foi mais eficiente na detecção de C. gossypii var.

cephalosporioides. A restrição hídrica proporcionada pelo soluto KCl induziu menor germinação, porém induziu maior comprimento de radícula nos dois potenciais osmóticos testados, -0,6 e -0,8. além de reduzir a incidência do patógeno nas sementes. Com base nos resultados aqui obtidos os solutos manitol e NaCl, no potencial osmótico de -0,8 MPa, são os mais recomendados para o emprego da técnica de restrição hídrica, na detecção de C. gossypii var. cephalosporioides em sementes de algodoeiro.

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45

3 EFEITO DE NÍVEIS DE INCIDÊNCIA DE Colletotrichum gossypii South var.

cephalosporioides Costa NA SEMENTE E DO CONTROLE QUÍMICO DA PARTE

AÉREA SOBRE O PROGRESSO DA RAMULOSE DO ALGODOEIRO.

Resumo

A ramulose, causada por Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, constitui-se em uma das mais importantes doenças do algodoeiro no Brasil. O agente causal é transmitido pela semente e a doença tem nela sua principal fonte de inóculo inicial. Neste sentido, o estabelecimento de padrões de sanidade do patógeno nas sementes torna-se imperativo. Para tanto, o conhecimento sobre a transmissão semente-plântula no campo e o progresso da doença em função dos níveis de incidência nas sementes, bem como a estratégia de controle visando reduzir a intensidade da doença, é fundamental. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de níveis de incidência do patógeno nas sementes e do controle químico da parte aérea, sobre o progresso da ramulose no campo. Instalaram-se dois experimentos, sendo um no ano agrícola de 2005/2006 e outro em 2006/2007 em Santa Helena de Goiás-GO. Os experimentos foram em blocos casualizados com três repetições e parcelas de seis linhas de cinco metros. Os tratamentos foram de 0%, 2% 4%, 6%, e 8% de incidência nas sementes, não pulverizados, com uma e duas pulverizações para controle da doença na parte aérea. Os valores das áreas abaixo das curvas de progresso da incidência (AACPI) e da severidade (AACPS) da doença foram maiores quando os níveis de incidência nas sementes também o foram. Não houve efeito significativo do controle químico sobre a intensidade da doença no ano de 2006, porém esse efeito foi significativo em 2007, com a quantidade de doença sendo reduzida em ordem crescente do número de pulverizações. O controle químico não foi eficiente quando o nível de incidência nas sementes foi zero e 2%. Não foi observado efeito significativo dos tratamentos sobre o rendimento de algodão em caroço; porém no ano de 2006, esse rendimento foi menor que em 2007, em função da maior intensidade da doença verificada naquele ano.

Palavras-chave: Fungo; Doença; Transmissão; Pulverização; Padrão de sanidade EFFECT OF INCIDENCE LEVELS OF Colletotrichum gossypii South var.

cephalosporioides Costa IN THE SEEDS AND THE CHEMICAL CONTROL OF THE

CANOPY ON THE PROGRESS OF RAMULOSIS OF COTTON

Abstract

The ramulosis caused by Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides is one of the most important disease of cotton in Brazil. The pathogen is transmited by seeds and it is the main inoculum source. Therefore to determine the health patterns in the seeds is very important. In order to this objective it is necessary to know the rate transmission of the pathogen to the seedlings in the field conditions, and the progress of disease under 46

different levels of incidence in the seeds. And besides it is no less important to define a control strategy to reduce the disease intensity. The purpose of this research was evaluate the effect of different levels of incidence of the pathogen in the cotton seeds and the chemical control of foliage on the progress of ramulosis in the field. The experiments was carried out in Santa Helena of Goiás city in the seasons of 2006 and 2007 in randomized blocks with three repetitions, the plots had five linear meters and six planted lines. The treatments were 0, 2, 4, 6 and 8 percent of incidence in the seeds and not sprayed, one spray and two sprays to control of disease in the canopy. The areas under incidence progress curve (AUIPC) and severity (AUSPC) were higher when the incidence in the seeds was increased. There was not significant effect of chemical control on the disease intensity in 2006 season, but there was significant effect of sprays in the 2007 when the disease intensity was reduced with the increase in the number of sprays. The chemical control was not efficient when the level of incidence in the seeds was zero and 2%. There was not significant effect of the treatments under cottonseed yield, therefore in the 2006 season the cottonseed yield was less than in 2007, because the higher intensity of disease in that season.

Keywords: Fungus; Disease; Transmission; Spray; Health pattern

3.1 Introdução

A semente se constitui em um dos mais importantes veículos de disseminação de inoculo de fitopatógenos a longas distâncias. Sendo o principal meio de propagação da maioria das espécies cultivadas, torna-se responsável pela introdução de agentes causais de inúmeras doenças em áreas onde eles ainda não ocorreram.

A ramulose, causada por Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, destaca-se como uma das mais importantes doenças do algodoeiro no Brasil. Um aspecto que a torna particularmente importante é o fato de seu agente causal ser transportado e transmitido pelas sementes. Nos últimos anos a doença tem avançado para novas áreas produtoras e o controle químico da parte aérea tem sido iniciado mais cedo. Isso reflete o aumento na quantidade de inoculo nessas regiões induzido pela prática do cultivo continuado do algodoeiro em uma mesma área. Por outro lado, o uso de sementes infectadas pelo patógeno, além de contribuir para o aumento do nível de inoculo inicial, tem sido, também, responsável pela introdução da doença em áreas indenes.

A produção de sementes de um modo geral, e especificamente no caso do algodoeiro, envolve um conjunto de práticas que determinam o seu padrão de qualidade. Esse conjunto de práticas é constituído de fatores diversos que, muitas 47

vezes, fogem à ação do homem. Entre estes destacam-se os relacionados às condições do ambiente tais como pluviosidade, umidade relativa e temperatura. (LIMA; ARAÚJO; CARVALHO, 1998)

Algumas práticas devem ser consideradas visando obter sementes com boa qualidade sanitária, sobretudo no que se refere à incidência da ramulose. Entre estas se podem destacar: a localização dos campos de produção em áreas não cultivadas com o algodoeiro, ou que sejam mantidas em sistema de rotação com espécies não hospedeiras do agente causal da doença; evitar o plantio em regiões cujas condições climáticas favoreçam a incidência da doença tais como alta pluviosidade, temperaturas amenas e alta umidade relativa, e realizar inspeções nos campos de produção de sementes visando eliminar as plantas com sintomas de ramulose (LIMA; ARAÚJO; CARVALHO, 1998).

Um dos problemas com os quais se depara o produtor de sementes é o fato de que as regiões produtoras de algodão no Brasil, em sua maioria, apresentam condições de ambiente favoráveis ao desenvolvimento de C. gossypii var. cephalosporioides.

Neste sentido, os cuidados com os campos de produção de sementes são redobrados, o número de pulverizações visando proteger a lavoura do patógeno é maior e, muitas vezes, tratando-se de cultivares com maior suscetibilidade, os campos podem ser condenados.

Tendo em vista o fato de que a severidade da doença no campo nem sempre apresenta correlação com a percentagem de sementes infectadas pelo patógeno e que mesmo plantas pouco afetadas podem apresentar grande número de sementes infectadas (LIMA et al., 1985) muitas vezes, mesmo a partir de campos onde foi detectada baixa incidência da doença, constatam-se sementes com níveis elevados de infecção pelo agente causal da ramulose.

Para evitar que sejam descartadas grandes quantidades de sementes e visando atender aos padrões de sanidade estabelecidos pela legislação, os produtores utilizam o tratamento químico das sementes como alternativa para controle de patógenos a elas associados incluindo o C. gossypii var. cephalosporioides e patógenos veiculados pelo solo (GOULART, 2005).

48

A possibilidade do uso de sementes com algum nível de infecção pelo agente causal da ramulose ou a ocorrência de falhas no tratamento químico em função de fatores diversos, incluindo aqueles relacionados ao ambiente, representa um risco permanente à introdução de inóculo em novas áreas ou ao seu aumento em áreas já cultivadas com o algodoeiro, o que implicaria em epidemias precoces de ramulose, que exigiriam o controle químico na parte aérea.

Assim sendo é importante que se conheça como a doença progride a partir de diferentes níveis de inoculo proveniente das sementes e se o seu progresso poderia ser alterado a partir do controle químico da parte aérea.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o progresso da ramulose do algodoeiro em função de diferentes níveis de inoculo de C. gossypii var. cephalosporioides nas sementes e do controle químico da parte aérea.

3.2 Desenvolvimento

3.2.1 Revisão bibliográfica

Em função da transmissão de C. gossypii var. cephalosporioides semente-plântula ser elevada, atingindo níveis entre 60 e 70% (TANAKA, 1990; MACHADO et al., 2003) é de se esperar que níveis crescentes de incidência nas sementes possam induzir maior número de focos de ramulose no campo e maior intensidade de doença.

Machado et al. (2003) estudaram o efeito de níveis de inóculo nas sementes em relação à incidência da ramulose no estado de Mato Grosso. Os autores constataram que a partir de 1% de sementes infectadas ocorria 3,37% de plantas com sintomas de ramulose por hectare. Tendo trabalhado com níveis de infecção nos lotes de sementes variando de 1 a 5%, os autores observaram, ainda, um incremento nos níveis de incidência da doença com o aumento dos níveis de incidência nas sementes. Com 5%

de sementes infectadas, o nível de incidência aos 28 dias após a semeadura atingiu 13,3%, perfazendo um total de 14.763 plantas/ha.

O efeito de níveis de incidência de C. gossypii var. cephalosporioides nas sementes sobre o progresso da ramulose do algodoeiro foi estudado por Araújo (2004) em Minas Gerais. Com níveis de incidência nas sementes variando entre 0 e 16% os 49

autores verificaram que a intensidade da doença foi diretamente proporcional ao nível de incidência do patógeno nas sementes.

Araújo e Chitarra (2005) observaram aumento na severidade da ramulose com o aumento nos níveis de incidência de C. gossypii var. cephalosporioides nas sementes no estado de Mato Grosso. A partir de 1% de incidência do patógeno, houve aumento considerável na severidade da doença.

Com base nestes trabalhos, observa-se que a ramulose pode sofrer grande influência do aumento do nível de inóculo inicial a partir de sementes infectadas e, portanto, o padrão de tolerância do patógeno nas sementes deveria ser baixo. De acordo com Machado (1994), padrão de tolerância de um patógeno em sementes de uma determinada espécie cultivada, é o nível de ocorrência do patógeno em um dado lote de sementes abaixo do qual, danos econômicos, a curto, médio e longo prazos, são considerados aceitáveis.

O padrão de tolerância guarda estreita vinculação com a taxa de transmissão.

Esta última corresponde à relação entre o nível de ocorrência do patógeno na semente determinado pelo teste de sanidade e a doença no campo (MACHADO, 1994; TALAMINI et al., 2001). Porém a infecção da semente não assegura a transmissão do patógeno para a planta. A expressão da doença numa área cultivada depende de um conjunto de fatores de natureza infecciosa e não infecciosa que podem exercer influência direta ou indireta na taxa de transmissão (NEERGAARD, 1979; PIZZINATTO

et al., 1988; TANAKA, 1990; MACHADO, 1994; GOULART, 2005).

De acordo com Mc Gee (1995), fatores fisiológicos e do ambiente desempenham um papel importante na transmissão de patógenos através das sementes. O autor cita o exemplo de Peronosclerospora sorghi, agente causal do míldio do sorgo e do milho que pode ser transmitido imediatamente após as sementes serem colhidas, mas não quando as sementes estão secas, assim como o tombamento de plântulas de repolho causado por Alternaria brassicicola que não ocorre sob temperaturas abaixo de 150C

quando se emprega lotes de sementes altamente infectados.

Sabe-se

que

a

incidência de C.gossypii var. cephalosporioides nas sementes é maior quando a inoculação ocorre em plantas com maçãs já formadas (LIMA et al., 1985; TANAKA, 1990; SANTOS; ZAMBOLIN; BATISTA, 1993). Neste sentido pode 50

ocorrer um fenômeno relacionado diretamente ao hospedeiro que NEERGAARD (1979) denominou de suscetibilidade e resistência relacionada à ontogênese do hospedeiro.

Por outro lado, nem sempre existe uma correlação entre severidade da doença no campo e incidência do patógeno nas sementes. Mesmo quando ocorre alta severidade da doença nos estádios iniciais de desenvolvimento da cultura, o percentual de sementes infectadas é baixo. Muitas vezes quando há baixos índices de incidência e severidade no período em que as maçãs estão formadas, mesmo assim pode ocorrer níveis elevados de infecção nas sementes (LIMA et al., 1985; PIZZINATTO; CIA; FUZZATO,1991).

De acordo com Tanaka e Menten (1992), a transmissão de C. gossypii var cephalosporioides da semente para a plântula varia de acordo com o genótipo podendo atingir 73% em genótipos mais suscetíveis. Esse valor é bastante elevado e significa que mais de dois terços das sementes infectadas pelo patógeno podem induzir sintomas da doença no campo representando, assim, uma importante fonte de inóculo inicial. Trabalhando sob condições de campo Pizzinatto, Cia e Fuzzato (1991) constataram níveis de transmissão semente-plântula variando entre 21 e 64%, sendo observada a maior taxa de transmissão no genótipo mais suscetível.

Além da semente como inóculo inicial, o agente causal da ramulose tem sua sobrevivência em restos de cultura como um dos fatores que podem ser determinantes na ocorrência de epidemias da doença (ARAÚJO et al., 2003).

Segundo Machado (1994), do ponto de vista da patologia de sementes, os patógenos podem ser agrupados em diferentes categorias dependendo de seu modelo epidemiológico. Assim como existem patógenos que dependem exclusiva ou quase exclusivamente das sementes para serem disseminados, também existem aqueles que se estabelecem e se desenvolvem preferencialmente no solo ou em restos de cultura.

Porém também existem aqueles que se reproduzem intensamente e têm altas taxas de dispersão a partir de baixos níveis de inóculo nas sementes.

A abordagem da associação de patógenos com a semente transcende à própria semente, que não deve ser vista apenas como vítima do ataque, mas, também, no papel que representa do ponto de vista epidemiológico (MACHADO, 2000) 51

Maffia et al. (1988) simularam o número de focos iniciais de infecção de C.

lindemuthianum em feijoeiro partindo do pressuposto de que a plântula infectada não morre. Os autores consideraram uma área plantada no espaçamento de 0,3 x 0,1 o que daria 330.000 plantas/ha. Se o patógeno fosse transmitido pelas sementes a uma taxa de 1%, poderiam ocorrer 3.300 focos iniciais de antracnose por hectare.

O inóculo inicial para o progresso da ramulose do algodoeiro reveste-se de importância maior em função de que a doença ocorre no campo com maior intensidade em plantas próximas a uma fonte de inóculo. Santos et al. (1994) avaliaram o gradiente da ramulose e constataram que as primeiras plantas com sintoma da doença surgiram aos 32 dias a partir de uma fonte de inóculo inicial e que a maior incidência ocorreu em áreas mais próximas a esta fonte, decrescendo na medida em que as plantas ficavam mais distantes.

Estudos conduzidos por Araújo (2004) constataram um padrão agregado para o progresso da ramulose do algodoeiro. Alves et al. (2006) avaliando o padrão espacial da ramulose por meio de métodos geoestatísticos, também observaram um padrão agregado para o progresso da doença com alcance máximo de 6,82 m, 80 dias após a semeadura. Desta forma, fontes de inóculo oriundas de sementes infectadas tornam-se cada vez mais importantes para o estabelecimento da doença no campo em proporções epidêmicas.

De acordo com Talamini et al. (2001), uma importante característica de espécies do gênero Colletotrichum associadas às sementes é a sua habilidade de serem transmitidas para a parte aérea da plântula, onde ocorrem esporulação e lesões características. Sendo assim, quanto maiores forem as fontes de inóculo presentes no campo em um dado momento, maior a probabilidade de a doença ocorrer em maior intensidade. A distribuição ao acaso de sementes infectadas em diferentes pontos da área de plantio, tende a contribuir para ocorrência generalizada da doença de forma precoce.

No caso de C. gossypii var. cephalosporioides, a disseminação do inóculo a partir de um foco inicial ocorre através de respingos de chuva que são, normalmente, responsáveis pelo transporte de propágulos a curta distância a partir da dissolução da massa gelatinosa dos acérvulos, enquanto para distâncias maiores a disseminação é 52

proporcionada pela ação do vento a partir dos conídios localizados no ápice das setas(TANAKA; MENTEN; MACHADO, 1996).

Para que a doença se estabeleça é fundamental que as condições de ambiente sejam favoráveis. Santos et al. (1994) verificaram que o maior progresso da ramulose foi alcançado quando a umidade relativa e a temperatura mínima atingiram valores máximos de 90,2% e 18,30C respectivamente. Araújo e Farias (2003), avaliando o progresso da ramulose no estado de Mato Grosso, constataram maior severidade da doença com umidade relativa acima de 90% e temperaturas variando entre 18 e 200C.

A produção de sementes de algodoeiro isentas de C. gossypii var.

cephalosporioides representa um desafio para produtores de sementes do cerrado brasileiro. Entre as práticas culturais mais importantes para a condução de um campo de produção de sementes de algodoeiro está o monitoramento minucioso da ocorrência de doenças cujos patógenos podem ser transmitidos pela semente (BRUNETTA; BRUNETTA; FREIRE, 2007). Em função das condições de ambiente favoráveis à ramulose que predominam no cerrado, não raro faz-se necessária a aplicação de fungicidas na parte aérea visando evitar que a doença, uma vez ocorrendo, permaneça restrita aos focos iniciais, que serão eliminados através da prática do “roguing.”.

Apesar dos cuidados dispensados à condução da lavoura, sementes infectadas pelo patógeno ainda são detectadas com variados níveis de incidência. Para esses casos, visando controlar o patógeno na semente, atender às exigências da legislação vigente e evitar a ação de patógenos causadores de tombamento, é prática indispensável o tratamento das sementes com fungicidas. Em geral, o tratamento é eficiente no controle dos patógenos, porém a ocorrência de ramulose em novas áreas levanta a suspeita de que a introdução deu-se por meio de sementes infectadas.

O controle químico da ramulose por meio da aplicação de fungicidas na parte aérea constitui-se prática comum no cerrado brasileiro. Entretanto, nos últimos anos, o número de aplicações aumentou, provavelmente em virtude da prática de cultivo de algodão em sistema contínuo, sem rotação de culturas.

Machado, Andrade e Cassetari Neto (1999) relatam aumento de 19,2% no rendimento da cultura com quatro aplicações de carbendazin na dose de 1,0 L do produto comercial por hectare. Entretanto, Siqueri (2001) avaliou as misturas de trifenil 53

acetato de estanho+tiofanato metílico nas dose de 0,5 + 0,5 L do produto comercial/ha e carbendazim+trifenil hridóxido de estanho nas doses de 1,0 + 0,5 L do produto comercial por hectare e constatou que duas aplicações, em intervalo de 30 dias, controlaram satisfatoriamente a doença e melhoraram o rendimento da cultura.

Diversos fungicidas vêm sendo avaliados para o controle da ramulose (SIQUERI e ARAÚJO, 2001; IAMAMOTO; GOES; FUJINO, 2003; MACHADO et al., 2007). Apesar disso poucos são os fungicidas registrados para a cultura (SUASSUNA e COUTINHO, 2006). A maioria dos estudos tem buscado equacionar um controle satisfatório com o menor número de aplicações possível. No entanto, para que se alcance tal objetivo, as praticas de manejo da cultura, incluindo o uso de sementes isentas de patógenos, é essencial.

A utilização de sementes infectadas por C. gossypii var. cephalosporioides pode ser responsável pela incidência precoce da doença, obrigando o produtor a iniciar as aplicações de fungicidas na parte aérea, mais cedo, podendo ter como conseqüência um aumento no número de pulverizações.

3.2.2 Material e métodos

3.2.2.1 Obtenção do inóculo

O inóculo utilizado para a infecção das sementes de algodoeiro foi obtido a partir do isolado 242 de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, coletado no estado de Goiás e pertencente à micoteca da Embrapa Algodão, Campina Grande-PB. O isolado foi repicado para placas de Petri com meio de cultura BDA onde se manteve em crescimento até dez dias.

3.2.2.2 Inoculação das sementes

Sementes de algodoeiro da cultivar BRS Ipê, deslintadas com ácido sulfúrico, foram submetidas à assepsia com hipoclorito de sódio a 2% por um minuto e postas a secar à sobra por 24 horas. A seguir foram submetidas ao teste de sanidade pelo método do papel de filtro umedecido com água destilada (NEERGAARD, 1979) e ao teste de germinação conforme as regras para análises de sementes (BRASIL, 1992). A inoculação foi feita utilizando-se a metodologia descrita por Tanaka e Menten (1991). As 54

sementes foram colocadas em contato com micélio e conídios do patógeno crescido em meio de cultura de Batata-Dextrose-Ágar (BDA), em placas de Petri de 9 cm de diâmetro em um total de 50 sementes por placa. Em seguida as placas foram agitadas de modo que as estruturas fúngicas pudessem estabelecer contato, tanto quanto possível, com o máximo de superfície das sementes. Posteriormente as placas foram deixadas em repouso sob condições de temperatura ambiente do laboratório por um período de 24 horas. Decorrido esse período realizou-se um novo teste de sanidade pelo método já descrito, visando assegurar que a infecção das sementes tivesse ocorrido.

Em seguida, as sementes inoculadas foram adicionadas a sub-amostras do lote original de modo que se obtivessem percentuais de infecção nas sub-amostras de 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0%.

3.2.2.3 Tratamento das sementes

Visando evitar o tombamento de plântulas causado por Rhizoctonia solani por ocasião da semeadura no campo, as sementes inoculadas foram submetidas ao tratamento com o fungicida pencycuron, na dose de 300g i.a./100kg. As sementes foram colocadas em um saco plástico apropriado para acondicionamento de alimentos congelados e o fungicida foi colocado em seu interior. Uma vez lacrado, o saco foi agitado durante um minuto de modo a favorecer a cobertura das sementes pelo produto.

3.2.2.4 Área experimental, delineamento, plantio e manejo do experimento O experimento foi instalado no Campo Experimental da Fundação Goiás/Embrapa, no município de Santa Helena de Goiás, em altitude de 562 m, 17° 48' 49'' de latitude Sul e 50° 35' 49'' de longitude Oeste. O solo era do tipo Latossolo Amarelo e foi adubado por ocasião da semeadura com 400 kg/ha de 4-30-16 + 0,5% Zn + 0,4% B; em cobertura foi aplicado 400 kg/ha de 20-0-30 + 0,2% de B, dividido em duas vezes nos estádios B1/B2 e depois em F1/F2.

55

No local do experimento foi instalado um Datalogger portátil, Extech Instruments, modelo 42275 protegido por um abrigo meteorológico e um pluviômetro, visando monitorar a temperatura, umidade relativa e pluviosidade.

O delineamento foi em blocos ao acaso com 15 tratamentos e três repetições, sendo cada parcela constituída de seis linhas de cinco metros, considerando-se como área útil do experimento as quatro linhas centrais. Os tratamentos foram: 0%, 2%, 4%, 6% e 8% de incidência nas sementes, sem pulverização, com uma pulverização e duas pulverizações da parte aérea durante o ciclo.

Sementes da cultivar BRS Ipê, tratadas com o inseticida imidacloprid (270g i.a./100 kg) e os fungicidas tolylfluanida (75 g i.a./100 kg ) + pencycuron (75 g i.a./100

kg) foram distribuídas mecanicamente por meio de uma semeadeira modelo John Deere 9211 Vacumeter acionada por um trator modelo John Deere 6505

.Após a operação, sementes sadias foram retiradas manualmente, ao acaso, e colocadas em seu lugar sementes infectadas por C. gossypii var. cephalosporioides, de modo a se distribuir nas parcelas os diferentes tratamentos. Em cada local onde foi deixada uma semente infectada, foi colocado um estilete de aço pintado na cor amarela, visando evitar que a plântula proveniente de semente infectada fosse removida por ocasião do desbaste. Este foi realizado, decorridos 30 dias após a semeadura visando uniformizar o estande, deixando-o com oito plantas por metro linear. O espaçamento foi de 0,9 m entre linhas sendo distribuídas 10 sementes por metro linear. Visando evitar a entrada de inóculo proveniente de outras áreas, 30 dias antes da instalação do experimento foram semeadas quatro linhas de sorgo ( Sorghum bicolor L) em volta da área. As parcelas foram distanciadas entre si por dois metros entre tratamentos e blocos. O manejo dispensado ao experimento foi realizado conforme as exigências da cultura.

Após o surgimento dos primeiro sintomas de ramulose nas plantas e identificado o seu progresso, foi feita a primeira aplicação de fungicida nos tratamentos onde estava previsto o controle da doença na parte aérea. O fungicida utilizado na primeira aplicação foi o carbendazin na dose de 0,375 L i.a./ha. Uma Segunda aplicação foi realizada com a mistura de fungicidas trifloxystrobina+propiconazol (125+125g/L) na 56

dose de 0,75 g i.a/ha quando foi detectado aumento na incidência da doença nos tratamentos já pulverizados.

3.2.2.5 Avaliação da intensidade da doença e análise estatística As avaliações da intensidade da ramulose foram feitas a intervalos que variaram entre 15 e 30 dias até os 161 dias, por meio da incidência, obtida pela contagem do número de plantas com sintomas da doença nas parcelas, transformado em percentagem e pela severidade. Esta última foi avaliada empregando-se a chave descritiva proposta por Araújo et al. (2003) onde: 1=planta sem sintomas; 2=planta apresentando lesões necróticas nas folhas mais jovens; 3=plantas apresentando lesões necróticas nas folhas, encurtamento de internódios e início de superbrotamento; 4=planta apresentando lesões necróticas nas folhas, encurtamento de internódios, superbrotamento e redução de porte; 5=planta apresentando manchas necróticas nas folhas, encurtamento de internódios intenso superbrotamento com redução de porte. Os dados foram transformados em índice de severidade obtido empregando-se a metodologia proposta por Kzermainski (1999). A partir dos dados foram elaboradas as curvas de progresso da doença em todos os tratamentos e calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), para os valores de incidência e severidade com base em método descrito por Campbell e Maden (1990) onde:

n-1

AACPD = Σ ((Yi+Yi+1)/2)(ti+1-ti)

I=1

Em que:

Y = intensidade da doença no tempo i e i+1; t=tempo: n=número de avaliações Visando identificar possível interação entre os níveis de incidência nas sementes e o número de pulverizações, foi feita análise de variância da AACPD para incidência (AACPI) e severidade (AACPS) e produção de algodão em caroço. Para atender os pressupostos da análise de variância, os dados da AACPI nos anos de 2006 e 2007 e 57