Efeito dos extratos de Harpagohytum procumbens (garra-do-diabo) e suas frações na atividade da... por Maria Cecilia Cattai Anauate - Versão HTML

ATENÇÃO: Esta é apenas uma visualização em HTML e alguns elementos como links e números de página podem estar incorretos.
Faça o download do livro em PDF, ePub, Kindle para obter uma versão completa.

Maria Cecília Cattai Anauate

Efeito dos extratos de Harpagohytum procumbens (garra-do-

diabo) e suas frações na atividade da COX-1 e COX-2 e na

produção de NO em sangue total

Tese apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Área de Concentração: Reumatologia

Orientadora: Profa. Dra. Suzana Beatriz

Veríssimo de Mello

São Paulo

2007

“QUANDO UMA CRIATURA HUMANA DESPERTA PARA

UM GRANDE SONHO E SOBRE ELE LANÇA TODA A

FORÇA DE SUA ALMA, TODO UNIVERSO CONSPIRA A

SEU FAVOR”.

Goethe

UM AGRADECIMENTO ESPECIAL A MINHA AMIGA, MÁRCIA.

POR SUA ORIENTAÇÃO, DEDICAÇÃO E DISPONIBILIDADE EM

CONSPIRAR AO MEU FAVOR NA REALIZAÇÃO DESSE SONHO.

A MINHA FAMÍLIA MEUS AGRADECIMENTOS.

AO MEU MARIDO, GILBERTO E MEUS FILHOS, RAFAEL E MARINA

OBRIGADA PELO APOIO INCONDICIONAL NESSE PROJETO DE

VIDA.

AGRADECIMENTOS

À Profa Dra Suzana Beatriz Veríssimo de Mello, minha orientadora, pelo

acompanhamento, dedicação e orientação dos meus estudos.

À Profa Dra Luce Maria Brandão Torres, pesquisadora do Instituto de Botânica

de São Paulo, por sua importante participação no preparo do material vegetal utilizado nos ensaios in vitro.

À Profa Dra Márcia Regina Braga, pesquisadora e chefe do Departamento de

Fisiologia do Instituto de Botânica de São Paulo, pelo incentivo, orientação, e por sua amizade e apoio na realização desse projeto.

À Profa Dra Elaine Cardoso Monteiro Lopes, pesquisadora do Departamento de

Fisiologia do Instituto de Botânica de São Paulo, pela ajuda e especial participação.

À Maria Aurora Gomes da Silva e à Maria de Fátima Almeida pelo carinho e pelo ensino dos protocolos experimentais e pela presteza no auxílio da realização dos procedimentos.

A farmácia de manipulação, Pró-fórmula situada à Alameda do Jurupis, n0 1278, Moema por ter cedido gentilmente os extratos bruto hidro-alcoólico do Harpagophytum procumbens com certificado de atividade biológica e de procedência.

À Tatiana Marques Ferreira da Rocha, aluna da Profa Luce do Instituto de

Botânica de São Paulo pela ajuda na preparação e separação do material vegetal .

À Maria de Fátima Correia da Silva pela ótima assistência de secretaria.

SUMÁRIO

Lista de siglas

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO……………………………………………………

1

1.1 Osteoartrite………………………………………………………

1

1.2 Osteoartrite de coluna lombar…………………………………

2

1.2.1Fisiopatologia da dor lombar…………………………………. 3

1.3 Harpagophytum procumbens (Família Pedaliaceae)

9

2.OBJETIVOS ..............................................................................

15

3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................

16

3.1 Material vegetal......................................................................

16

3.2

Fracionamento

do

extrato

16

3.3 Ensaio em sangue total da atividade da COX-1 e COX-2 ......

23

3.4 Ensaios in vitro........................................................................

24

3.4.1 Avaliação da atividade da COX-1........................................

24

3.4.2 Avaliação da atividade da COX-2........................................

24

3.4.3 Quantificação de Tromboxano B2 e Prostaglandina E2.......

24

3.4.4 Ensaios in vitro – efeitos do extrato bruto da garra-do-diabo

25

3.4.5 Ensaios in vitro – efeitos das diferentes frações da garra-do-diabo 26

3.5 Análise dos metabólitos do NO - NO -

-

2 e NO3 ..................................

26

3.6 Seleção das pacientes.......................................................

27

3.6.1 Avaliação da flexibilidade da coluna lombar e questionários 29

A - Medida da distância mão chão ............................................

29

B - Teste de Thomas........................................................................ 29

C – Questionário sobre a avaliação de saúde.................................. 30

D – Questionário de incapacidade Roland Morris............................ 30

3.6.2 Exames de Imagem........................................................................... 30

3.7 Ensaio ex vivo.............................. ......................................................... 31

3.8 Análises estatísticas............................................................................. 31

4. RESULTADOS....................................................................................... 32

4.1 Ensaio clínico………………………………………………………………. 32

4.2 Ensaio in vitro ………………………………………………………………. 34

4.2.1 Ensaio in vitro – efeito do extrato bruto da garra-do-diabo

34

4.3 Ensaios ex vivem para avaliação da atividade da COX-1 e COX- 2

e produção de NO em sangue total

35

4.4 Efeitos das diferentes frações do extrato da garra-do-diabo na

atividade da COX-1 e COX-2 e produção de NO

37

5. DISCUSSÃO………………………………………………………………… 41

6. CONCLUSÕES........................................................................................ 46

7. ANEXOS................................................................................................... 47

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................

55

LISTA DE SIGLAS

AA = ácido araquidônico

AINH = antiinflamatórias não hormonais

AR = artrite reumatóide

CCDC = cromatografia de camada delgada comparativa

CCDP = cromatografia de camada delgada preparativa

CHCl3: MeOH = clorofórmio : metanol

CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência

cNOS = óxido nítrico sintase constitutiva

CO2 = gás carbônico

COX-1 = ciclooxigenase 1

COX-2 = ciclooxigenase 2

DMC = distância mão chão

EVA = escala visual analógica

FR = fator reumatóide

HAQ = questionário de saúde

HPLC = high performance liquid cromatography

1 HRMN = ressonância nuclear magnético de hidrogênio

IGF = fator de crescimento I similar à insulina

IC50 = concentração inibitória

IL = interleucina

IL-1β = interleucina 1 β

IL-1 ra = receptor anti-interleucina 1

iNOS = óxido nítrico sintase induzida

INSS = Instituto Nacional do Sistema de Saúde

LPS = lipopolissacarídeo

LOX = lipooxigenase

LT = leucotrieno

MEC = matriz extracelular

MMP = metaloproteinase da matriz

M/V = massa/ volume

NF-кB = fator nuclear kb

NO = óxido nítrico

NO -

2 = nitrito

NO -

3 = nitrato

NOS = óxido nítrico sintase

OA = osteoartrite

O -

2 = anion superóxido

ONOO - = anion peróxinitrato

PCR = proteína C reativa

PGs = prostaglandinas

PGE2 = prostaglandina E2

PGH2 = prostaglandina endoperóxido H2

PGI2 = prostaciclina

PMN = polimorfonuclear

Rfs = fator de referência

RL = radicais livres

RM = questionário de incapacidade Roland Morris

RNAm = ribossoma nuclear mensageiro

RNM = ressonância nuclear magnético

RPM = rotação por minuto

TIMP = inibidor tecidual de metaloproteinase

TGF-β = fator de transformador de crescimento

TMS = tetrametilsilano

TNF-α = fator de necrose tumoral – alfa

TR = tempo de retenção

TX = tromboxano

TXA2 = tromboxano A2

TXB2 = tromboxano B2

UV = ultravioleta

VHS = velocidade de hemosedimentação

WOMAC = Western Ontário and MacMaster Universities Osteoarthritis Index

RESUMO

Anauate MCC. Efeitos dos extratos de Harpagophytum procumbens (garra-do-diabo) e suas frações na atividade da COX-1 e COX-2 e produção de NO em sangue total

[tese]. São Paulo; Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007.

OBJETIVO: O presente estudo avaliou o efeito dos extratos de H. procumbens e suas frações na atividade da COX-1 e COX-2 e produção de NO em ensaio de sangue total de voluntários sadios e pacientes com OA. MÉTODOS: A atividade da COX-1 foi

determinada através da produção de TxB2 por plaquetas e da COX-2 pela produção de PGE

-

-

2 por monócitos estimulados por LPS. A produção de NO2 /NO3 foi determinada por reação de Griess. Os ensaios in vitro foram realizados por incubação do extrato do extrato de H.procumbens e frações em sangue total. Os controles inibidores da atividade da COX-1 e COX-2 foram indometacina e etoricoxibe. A atividade enzimática das COXs e produção de NO foram avaliadas antes e após o tratamento com garra-do-diabo em pacientes com OA de coluna lombar. RESULTADOS: O tratamento com

garra-do-diabo foi eficaz clinicamente e aumentou a atividade da COX-1 e COX-2 basal sem LPS. O extrato bruto do H. procumbens não alterou a atividade das COX.

Entretanto, o harpagosideo inibiu a atividade da COX-1, COX-2 e a produção de NO.

CONCLUSÃO: A garra-do-diabo mostrou-se eficaz no tratamento de pacientes com OA de coluna lombar. O harpagosideo deve ser alvo estudos específicos.

Descritores: 1.Osteoartrite 2.Ciclooxigenase 1 3.Ciclooxigenase 2 4.Óxido nítrico 5. Harpagophytum procumbens 6. Iridóides/ uso terapêutico.

SUMMARY

Anauate MCC. EFFECTS OF HARPAGOPHYTUM PROCUMBENS (DEVIL’S CLAW)

EXTRACTS AND ITS FRACTIONS ON COX-1 AND COX-2 ACTIVITY AND NITRIC

OXIDE PRODUCTION IN WHOLE BLOOD

OBJECTIVE: The present study evaluated the effect of H. procumbens extracts and its fractions on COX-1 and COX-2 activity and NO production in whole blood assays of volunteers and OA patients . METHODS: The COX-1 and COX-2 activity was quantified as platelet TXB2 production in blood clotting and as PGE2 production in heparinized LPS-stimulated whole blood, respectively. Total NO -

-

2 /NO3 was determined by Griess

reaction. In vitro assays were performed through incubation of the extract and fractions with whole blood from volunteers. Controls of the inhibition of COX-1 and COX-2 activity were indomethacin and etoricoxib. Before and after treating OA lumbar spine patients with devil’s claw the COX-1 and COX-2 activity and NO production were evaluated in their whole blood. RESULTS: The treatment promoted clinical improvement and

increase in the activity of COX-1 and basal COX-2, without LPS. The crude extract did not affect the activity of both enzymes. However, harpagoside inhibited COX-1 and COX-2 activity and NO production. CONCLUSION: Devil’s claw promoted clinical

improvement of OA patients and harpagoside must be focus of specific studies.

Descriptors: 1.Osteoarthritis. 2. Ciclooxygenase 1. 3. Ciclooxygenase 2. 4. Nitric oxide.

5. Harpagophytum procumbens. 6. Iridoids /therapeutic use.

1

1.INTRODUÇÃO

1.1 OSTEOARTRITE

A Osteoartrite (OA) pode ser definida como um grupo heterogêneo de alterações na cartilagem articular e no osso subcondral. Apesar de diversas etiologias, tem características clínicas, radiológicas, biológicas e patológicas semelhantes (Brandt et al., 2003). É a doença articular mais comum e no Brasil tem prevalência de cerca de 20% e, de acordo com os dados do INSS, é responsável por 7,5% de todos os

afastamentos do trabalho. As mulheres apresentam uma suscetibilidade maior ao desenvolvimento da doença e as mulheres negras são as mais propensas (Seda et al., 2001).

O quadro inicial da OA é dinâmico, marcado pela alteração no equilíbrio entre a reparação da cartilagem articular e do osso subcondral e a sua degradação. Os fatores de crescimento IGF-1 e TGF-β, que são citocinas anabólicas, estimulam a síntese de proteoglicanos e colágeno, que desempenham papel fundamental na tentativa de

reparação da matriz cartilaginosa e esse processo leva ao espessamento cartilaginoso.

A secreção das citocinas inflamatórias (IL-1 e TNF-α), bem como da citocina

modulatória (IL-6), pelos condrócitos parece ser a principal responsável pelo aumento da produção das metaloproteinases matriciais (MMPs), de seus ativadores e do inibidor tecidual das metaloproteinases (TIPMs) (Figura 1). Com o aumento da liberação dessas enzimas, ocorrem alterações nas propriedades fisiológicas da cartilagem (Fernandes et al., 2002). Com a evolução do processo, a superfície da cartilagem torna-se áspera e/ou desgastada com a formação de fissuras (fibrilação) e erosões, com exposição do osso subcondral. Após o desgaste da cartilagem, ocorre uma

neoformação óssea e o resultado final é a alteração da função articular. A inflamação é um elemento fundamental na fisiopatologia da OA, pois acelera o catabolismo da cartilagem (Berenbaum et al., 2001).

2

O quadro clínico é geralmente insidioso e caracterizado por dor articular

protocinética (antes da movimentação), acompanhada de aumento da sensibilidade articular e limitação do movimento (Long et al., 2001).

Regulação da síntese e degradação da cartilagem

Fatores de crescimento

IL-1

TNF-α

TGF-β

PDGF

IGF

bFGF

Degradação da cartilagem

Reparação da cartilagem

Apoptose dos condrócitos

Expressão de IL-1ra, TIPM, colágeno tipo II

Síntese das MMPs

proteoglicanos;

Síntese dos eicosanóides

Proliferação condrocitária

Regulação da expressão do IL-1 receptor

Antagonistas do receptor de IL-1(IL-1ra) a as proteases inibitórias (TIMP-1,

TIMP-2 e α – 2-macroglobulinas) podem diminuir o processo de degradação da

cartilagem.

Figura 1 - Processo de remodelação da cartilagem. Na OA existe aumento das enzimas degradativas, com desequilíbrio que leva ao desarranjo do colágeno e dos proteoglicanos da matriz.

1.2 OA de coluna lombar

Dor lombar ou lombalgia pode ser definida como dor, tensão muscular ou

sensibilidade localizada abaixo da margem das costelas e acima da borda inferior dos glúteos com ou sem irradiação da dor para a perna. Embora o episódio agudo de dor lombar seja freqüente e permaneça geralmente menos que três meses, os episódios recorrentes são responsáveis pela incapacidade física e alterações psicológicas (Chrubasika et al., 2003). A OA é a principal causa de incapacidade física nos países industrializados, sendo a segunda causa de procura por assistência médica entre as doenças crônicas. Os fatores de risco para ocorrência de dor lombar estão

3

relacionados à idade, sexo, tabagismo, etc. O estresse, a dor, o humor depressivo e as funções cognitivas são os fatores psicossociais que influenciam o aparecimento da dor (Chantre et al., 2000).

1.2.1 Fisiopatologia da dor lombar

As fontes potenciais de lombalgia incluem os discos intervertebrais, articulações das facetas, vértebras, estruturas neurais, músculos, ligamentos e fáscia. Os mecanismos e as vias pelas quais os processos degenerativos do disco intervertebral levam ao quadro doloroso ainda não estão bem compreendidos (Biyani et al., 2004).

O disco intervertebral é composto de tecido fibrocartilaginoso que apresenta

propriedades mecânicas de absorção e dissipação das cargas da coluna lombar,

permitindo o seu movimento suave. Possui estrutura única composta por um núcleo pulposo gelatinoso interno circundado por um anulo fibroso externo. No processo de envelhecimento ocorre uma desidratação do núcleo pulposo com diminuição do

número de células da matriz cartilaginosa extracelular (MEC) e da concentração dos proteoglicanos. A presença de co-morbidade tais como diabetes, doenças vasculares e o fumo podem acelerar o processo degenerativo (Biyani et al., 2004).

A mudança na estrutura do disco altera sua resposta à sobrecarga e o

alinhamento da coluna vertebral em repouso, transformando as articulações facetárias, os ligamentos e os músculos para-vertebrais em fontes adicionais de dor. As mudanças do disco na forma e no volume ocorrem com o envelhecimento a partir dos 50 anos (Biyani et al., 2004) (Figura 2).

index-14_1.png

index-14_2.png

4

A

B

Figura 2 - Coluna lombar com aspecto normal (A) e com mudanças no volume e na forma do disco intervertebral (B), sinais de degeneração que ocorrem quase universalmente com o envelhecimento.

Os eventos bioquímicos que ocorrem com a degeneração do disco

intervertebral, em particular o papel dos mediadores químicos envolvidos na regulação do processo inflamatório, como a interleucina -1 (IL-1) e fator de necrose tumoral-α

(TNF- α), tromboxano A2 (TxA2) e óxido nítrico (NO), têm sido apontados como fontes geradoras de dor na região lombar (Takayashi et al., 1996) (Figura 3).

A ação da IL-1 está relacionada ao aumento dos fatores de catabolismo nos

condrócitos, como as MMPs e o NO, levando a um dano da MEC. Através da

estimulação da IL-1, ocorre aumento da expressão das formas indutíveis das enzimas óxido nítrico sintase (iNOS) e ciclooxigenase 2 (COX-2) nos condrócitos (Amin et al.,1999). A participação do NO como mediador na lesão do disco intervertebral e a sua relação com o envelhecimento e a doença degenerativa do disco intervertebral ainda não são totalmente compreendidas. Além disso, o aumento na produção de NO diminui os níveis do inibidor natural da IL-1, o antagonista de receptor IL-1 que é uma citocina 5

anticatabólica, produzindo aumento ainda maior na concentração dessas citocina no local da inflamação (Solovieva et al., 2004). A compressão mecânica da cartilagem aumenta a produção de COX-2 e PGE2, através de uma via nitrito dependente

(Takayashi et al., 1996).

Produz

Dor - Inflamação

hiperalgesia

térmica

Stress

Ativação

produção de NO

Leucotrienos

Celular

resposta

(LT)

imune

Hiperalgesia

Citocinas

Fosfolipase A2

Mecânica.

IL-1 ,IL-6 e TNF-α

5-lipooxigenase

Membrana

Ácido

Fosfolipídios

Araquidônico

Dano

Celular

Ciclooxigenases

PGH2

Degradação

Tromboxano A

Prostaglandina E

matriz

2

2

Aumenta

produção

TxB

PGE

2

2

MMPs.

Figura 3 - Relação entre os mediadores químicos responsáveis pela produção de dor e inflamação.

O NO é um radical livre gasoso liberado nos tecidos por duas classes diferentes de enzimas sintases (NOS), uma constitutiva (cNOS) e outra forma enzimática induzida (iNOS), cuja síntese é estimulada por fatores imunológicos, é citosólica e cálcio independente. Essa forma enzimática é produzida por macrófagos, polimorfonucleares (PMN), células endoteliais, hepatócitos, fibroblastos, condrócitos e sinoviócitos (Stefanovic-Racic et al., 1994), com implicações na inflamação. A inibição da produção do NO, principalmente o gerado pela iNOS, pode ter um valor terapêutico

particularmente durante a inflamação e o choque séptico (Kim et al.,1999). O NO é capaz de reagir rapidamente com o ânion superóxido (O2 -) e essa reação é capaz de gerar outros radicais destrutivos. O peróxinitrato (ONOO–) em especial, que quando 6

protonado pode ser decomposto e formar o radical OH, com grande capacidade

oxidante. Sendo assim, a produção dessas espécies reativas de nitrogênio pode estar ligada à destruição tecidual que ocorre durante o processo inflamatório e,

particularmente, no dano articular (Su et al., 1996). Adicionalmente, a liberação endógena de NO aumenta a atividade da enzima COX macrofágica que pode resultar na produção de PG pró-inflamatórias (Mello et al., 2000). (Figura 4). A modulação da produção de NO e o conhecimento do seu papel fisiológico e a sua participação nas doenças cardiovasculares e inflamatórias pode ser outra estratégia terapêutica essencial para o desenvolvimento de drogas no tratamento de doenças inflamatórias crônicas (Kang et al., 1996).

Relações ent

entre a síntes

ese de PGs e de NO

Estímulo Inflamatório

Indutíveis

NOS

NOS

+

COX

COX-2

+

+

O - + NO ONOO

PGs

PGs

2 + NO ONOO-

Vasodil

asodilatação, Dor e Cito

Citoxici

xicidade

Inf

Inflamação Crônica

Figura 4 - Relação entre a síntese das prostaglandinas e a produção de NO.

A liberação dos AA por ação da fosfolipase A2, que hidrolisa fosfolipídios da membrana celular, serve como substrato para duas vias enzimáticas distintas: a via das COXs, que desencadeia a síntese das PGs e dos TXs, e a via das lipooxigenases (LOX), responsável pela síntese dos LT. A síntese das PG inicia-se com a atividade da 7

COX catalisando a adição do O2 molecular ao AA para formar PGH2. O metabolismo da PGH2 pelas enzimas isomerases teciduais específicas leva à formação de um produto final biologicamente ativo e localmente específico como as PGE2 expressa nos

sinoviócitos e TxA2 presente nas plaquetas incluindo também a formação de PGD2, PGF2 e PGI2 (Penglis et al., 2000).

A COX, enzima chave que catalisa a síntese das PG, também conhecida como

PGG/H sintase, possui duas isoformas distintas bastante similares: a COX-1 e COX-2.

As duas isoformas são expressas a partir de dois genes diferentes, possuem estrutura protéica primária similar e catalisam essencialmente a mesma reação. A COX-1 foi a primeira a ser caracterizada e é expressa constitutivamente, ou seja, está presente nas células em condições fisiológicas, principalmente nos vasos sangüíneos, plaquetas, estômago e rins. As PGs que são derivadas da COX-1 têm papel importante na

homeostasia e participam da proteção celular da mucosa gástrica, da hemodinâmica renal e trombogênese plaquetária. Por outro lado, as PGs derivadas da COX-2

contribuem de forma mais significativa para os processos de inflamação e malignidade.

A COX-2 pode ser induzida na presença de citocinas (IL-1, IL-2 e do TNF-α), ésteres do forbol, fatores de crescimento e endotoxinas, sendo expressa caracteristicamente nas células envolvidas no processo inflamatório, como macrófagos, monócitos e sinoviócitos (Penglis et al., 2000). Entretanto, achados mais recentes mostram que a COX-2 pode ser expressa constitutivamente nos vasos renais, na mácula densa

cortical, nas células intersticiais dos rins, no ducto coletor e na porção delgada da alça de Henle, na traquéia e no sistema nervoso central. A COX-2 pode também ser

mediadora nas funções fisiológicas do endotélio vascular. A liberação da prostaciclina (PGI2), resultante da metabolização da AA pela COX-2 endotelial, desempenha papel importante no mecanismo de defesa homeostático que promove vasodilatação,

fibrinólise e limita a ativação plaquetária. O eicosanoide produzido pela metabolização do AA através da COX-1, o TXA2, promove vasoconstrição e agregação plaquetária. É

importante salientar que, o envelhecimento pode aumentar a expressão de COX-2 em determinadas áreas, e a conseqüente produção de PG fisiológica passar a ser atributo 8

dessa enzima, tornando-se, portanto, arriscada a inibição completa da atividade da mesma com drogas de ação seletiva (Salinas et al.,2007) .

Uma terceira isoforma de COX, COX-3, foi recentemente descoberta em cães; é produzida pelo gene da COX-1 e é expressa no córtex cerebral e coração. É

seletivamente inibida pelas drogas analgésicas e antitérmicas como o acetaminofen e dipirona e pode ser inibida por certos antiinflamatórios não hormonais (AINHs). Ainda não está claro se os AINHs inibidores seletivos da COX-2 também inibem a COX-3 e se essa inibição pode ser um mecanismo primário central através do quais essas drogas diminuem a dor e, provavelmente, a febre (Chaiamnuay et al., 2006).

A inibição da atividade das COXs, COX-1 e/ou COX-2, é o principal alvo das

drogas AINHs impedindo a formação de PG. As inibições não seletivas das isoenzimas COXs levam a efeitos terapêuticos benéficos, mas também a grande número de efeitos adversos. Os efeitos adversos gastrintestinais dos AINHs estão associados à

supressão da expressão constitutiva da COX-1, resultando em lesão gástrica,

hemorragia e ulceração. Teoricamente, a inibição seletiva da COX-2 nas células inflamatórias poderia ter efeitos favoráveis, mas efetivamente essa inibição nos vasos sangüíneos, cérebro e coração pode ter efeitos deletérios. A inibição seletiva da COX-2

pode levar a um desequilíbrio entre as PGI2 e TXA2 que pode ser resumido pelo aumento do risco de eventos cardiovasculares, levando a vasoconstricção e trombose.

Sendo assim, todos AINHs apresentam algum risco cardiovascular mas com diferentes gradientes de gravidade, que dependem do seu grau de seletividade de inibição da COX-2 que irá gerar um desequilíbrio maior ou menor entre as duas PGs. Em relação à pressão arterial, os inibidores seletivos da COX-2 podem transitoriamente induzir uma elevação de leve a moderada na pressão sangüínea pela diminuição da excreção de sódio urinário. Isso pode contribuir também para o aumento do risco cardiovascular.

Essa alteração da pressão arterial pode também ser observada com o uso de AINHs tradicionais (Chaiamnuay et al.,2006).

9

1.3 Harpagophytum procumbens (Família Pedaliaceae)

Harpagophytum procumbens [Burch] DC Ex Meissn. (garra-do-diabo) é uma espécie vegetal da família Pedaliaceae (Figura 5) e juntamente com H. zeyheri representam as duas únicas espécies do gênero. Originária do deserto de Kalahari, das estepes da Namíbia, Botswana e África do Sul (Brien et al., 2006), não é, portanto uma planta nativa do Brasil. H. procumbens é uma planta herbácea perene, conhecida popularmente como garra-do-diabo ou unha-de-diabo, nome dado em função do

aspecto ramoso e lenhoso do fruto, provido de barbas semelhantes a garras. As raízes tuberosas primárias e secundárias de ambas as espécies são utilizadas por nativos africanos na forma de infusões para o tratamento de doenças reumáticas, diabetes, arteriosclerose e malária. Embora conhecidas desde o século XIX, somente após a primeira guerra mundial começaram os estudos sobre suas propriedades

farmacológicas (para revisão ver Clarkson et al ., 2003).

O extrato seco de raízes secundárias do H. procumbens (garra-do-diabo) tem como principais constituintes químicos os iridóides, presentes em concentração maior que os outros constituintes. Os iridóides são metabólitos secundários derivados da via da mevalonato (monoterpênicos), caracterizados por um grupo amplo de princípios amargos, constituídos por um núcleo fundamental formado pelo ciclopentano ligado a α-pirona, contendo um átomo de oxigênio (Benito et al., 2000). Os seus derivados são encontrados na natureza sob a forma de β-glucosideos: foram denominados iridóides, por serem derivados do iridodial, composto isolado nas formigas da Austrália

( Iridomyrmex spp.) (Costa, 2002). O principal princípio ativo do extrato é um iridóide glicosilado, o harpagosideo (Figura 6), isolado em 1962 e responsável pelas inúmeras propriedades terapêuticas da planta, tendo sido a ele atribuído os efeitos

antiinflamatórios bem como a ação sobre a síntese dos eicosanóides (Setty e Sigal, 2005).

Os outros componentes da planta são os ácidos terpênicos: oleanólico, β-

acetiloleanólico e ursólico; a quinona harpagoquinona; alguns fitoesteróis como estigmasterol e β-sitosteróis; certos flavonóides como a lutoelina, kaempferol; os ácidos

index-20_1.png

index-20_2.jpg

index-20_3.jpg

index-20_4.jpg

index-20_5.jpg

index-20_6.jpg

index-20_7.jpg

index-20_8.png

index-20_9.png

10

fenólicos representados pelos ácidos clorogênico, cafeico e cinâmico livre; alguns aminoácidos; os açúcares (50%), principalmente estaquiose (46%) e pequenas

concentrações de glicose, sacarose e rafinose. Não foram encontrados polissacarídeos como o amido. A presença de monossacarídeos confere uma alta solubilidade da

fração de 50-70% em água. Os minerais presentes são: cálcio, cromo, ferro, magnésio, manganês, potássio, fósforo, selênio, silício e zinco. Seus tubérculos e suas raízes secundárias contêm uma mistura heterogênea de substâncias e, de acordo com os processos de extração, podem conter diferentes frações de constituintes com

propriedades analgésicas e anti nflamatórias agonistas ou antagonistas, sinérgicas ou complementares (Loew et al., 2001).

A

B

Tubérculo

Raízes secundárias

index-21_1.png

11

C

Iridóide

Glicose

Ácido cinâmico

Figura 5 - Aspecto da planta com tubérculos e raízes secundárias responsáveis pelo seu efeito terapêutico (A). A seta indica o fruto que dá o nome popular (B). Estrutura química do harpagosideo (C).

Existem evidências demonstrando que os diferentes extratos de garra-do-diabo

possuem diferentes mecanismos de ação e que são comparáveis aos dos AINH, pela interação da mediação nas vias metabólicas do AA, da COX e da LOX e também

atuando na liberação das citocinas e na produção de NO (para revisão ver, Spelman et al., 2006). Estudos em modelos experimentais de inflamação realizados com extrato seco aquoso das raízes secundárias de H. procumbens (Lanhers et al., 1992) demonstraram efeitos analgésico e anti nflamatório dos extratos (Andersen et al., 2004). Estudos in vitro foram realizados para confirmação da ação dos extratos secos do H. procumbens ou do seu principal composto ativo, o iridóide glicosilado harpagosideo, na síntese de eicosanóides e na produção de NO. Em cultura de

condrócitos de coelho, foi observado efeito condroprotetor do harpagosideo pela inibição da MMP - 2 (gelatinase A) (Chrubasik et al., 2006).

12

Fiebich et al., (2001) mostraram que a síntese de TNF-α em monócitos humanos

estimulados por LPS foi inibida de modo dose dependente pelo extrato hidro alcoólico de H. procumbens. Entretanto, os iridóides harpagideo e harpagosideo não tiveram efeito sobre a liberação de TNF-α em doses baixas. Os mesmos extratos com

concentrações maiores que 100 µg/ml inibiram a liberação de citocinas, IL-6 e IL-1B e PGE2. O extrato aquoso de H. procumbens suprimiu a síntese de PGE2 e a produção de NO pela inibição da expressão de RNA-m em fibroblastos de ratos estimulados por LPS (Jang et al., 2003). Extratos de H. procumbens contendo porcentagens de 8,9% a 27% de harpagosideo foram incubados com células mesangiais de ratos para avaliar seus efeitos na formação de NO induzido pela IL-1β e também na regulação da

transcrição da enzima NOS. Os resultados mostraram que os extratos contendo 2% de harpagosideo não inibiram a formação de NO, sugerindo que somente extratos com grande conteúdo de harpagosideo causam inibição da NO sintase indutível (Kaszkin et al . 2004). O mecanismo de ação do harpagosideo foi investigado usando células HepG2 humanas e macrófagos RAW 264,7 estimuladas com LPS, e o resultado

mostrou inibição do RNAm e expressão protéica da COX-2 e iNOS nas células HepG2.

Essa inibição parece estar relacionada à modulação da atividade do fator de

transcrição do NF-кB (Huang et al., 2006).

As propriedades farmacocinéticas da garra-do-diabo e seus efeitos sobre a

síntese dos eicosanóides (TxB2 e LT) foram avaliados em voluntários sadios, e os resultados indicaram que não houve alteração nos níveis de TXB2, havendo correlação entre os níveis séricos de harpagosideo e a inibição da síntese de LT. Os estudos farmacocinéticos mostraram que os níveis plasmáticos máximos de harpagosideo são alcançados após 1,3 a 2,5 horas (Loew et al., 2001).

Uma série de ensaios clínicos foi realizada para se aquilatar a eficácia clínica dos diferentes extratos de H. procumbens, aquosos ou hidro alcoólicos, contendo concentrações de harpagosideo entre 35 a 60 mg/dia no tratamento de OA de joelhos, coluna lombar e quadris. Um desses estudos foi realizado em comparação com uso de AINH, Vioxx (rofecoxibe) (12,5mg) para tratamento de pacientes com exacerbação da dor lombar (Chrubasika et al., 2003). Os resultados indicam não haver diferença de 13

tratamento entre os dois grupos. Em um outro estudo comparativo para tratamento de pacientes com OA de joelhos e quadril durante 4 meses com diacireina 100mg/dia e extrato aquoso de garra-do-diabo na dose de 2,6 g ao dia os resultados mostraram eficácia comparável, entretanto o extrato de garra-do-diabo foi superior em segurança (Chantre et al., 2000). Outro estudo, realizado com 250 pacientes com OA de joelhos, verificou a eficácia terapêutica do extrato aquoso de garra-do-diabo (60mg/dia de harpagosideo durante 8 semanas). Esse protocolo envolvia quadril e dor lombar inespecífica e foram realizadas avaliações com escala visual analógica (EVA), índice de Arthus para dor lombar e “Western Ontario and MacMaster Universities

Osteoarthritis index” (WOMAC). Os resultados mostraram uma melhora de 50 a 70%

nos parâmetros avaliados (Chrubasikb et al., 2003).

O único ensaio ex vivo realizado para avaliar o efeito da garra-do-diabo sobre a síntese dos eicosanóides, TxB2 e PGE2 foi feito em voluntários sadios que utilizaram 2g do extrato seco contendo 3% de iridóides glicosilados por 21 dias. Entretanto, nesse estudo não especificada a quantidade de harpagosideo presente no extrato. Os autores não observaram nenhum efeito sobre a síntese dos eicosanódes (Moussard et al., 1992). É importante ressaltar que, devido a problemas metodológicos, esse estudo de Moussard permitiu avaliar unicamente a influência do extrato bruto sobre a atividade da COX-1. Os dados da produção de PGE2 não refletiram a atividade da COX-2, pois foi avaliada em condições de não estimulação.

Ensaios in vitro realizados com onze tipos de iridóides isolados do H.

procumbens mostraram que o iridóide 8-O-p-coumaroil harpagideo apresentou atividade inibidora do “burst” respiratório em macrófagos de rato, com valor de IC50 de aproximadamente 32µM, sendo o valor encontrado para o harpagosideo de 200µM (Qi Ji et al., 2006). O resultado desse estudo sugere que nessa mistura heterogênea de iridóides presentes no extrato seco etanólico da garra-do-diabo talvez exista um ou mais iridóides que atuem reduzindo a resposta inflamatória por vias diferentes das descritas para o harpagosideo (Qi Ji et al., 2006).

14

O uso dos produtos contendo H. procumbens entre os pacientes com afecções reumáticas tem sido altamente prevalente nos últimos anos, portanto é importante determinar sua eficácia e segurança no tratamento da OA. A baixa incidência de eventos adversos e os baixos custos fazem com que os fitoterápicos representem uma alternativa no tratamento da OA ao invés do uso de antiinflamatórios tradicionais (Setty e Sigal, 2005).

A melhora no conhecimento da utilização dos fitoterápicos, como o extrato do H.

procumbens, sua aplicabilidade, mecanismo de ação, doses apropriadas e formulações podem preencher a lacuna existente entre o uso folclórico das plantas medicinais e sua prescrição por médicos. Dessa maneira, o presente estudo inédito sobre os efeitos da garra-do-diabo e suas sub-frações sobre a atividade de COX-1, COX-2 e produção de NO visa contribuir para isso.

15

2. OBJETIVO

O presente trabalho teve por objetivos:

• Avaliar, em ensaio de sangue total, a influência do extrato de H.

procumbens sobre as atividades da COX-1 e COX-2.

• Avaliar uma possível ação dos metabólitos do extrato sobre a atividade

dessas enzimas e produção de NO em pacientes com OA de coluna

lombar.

• Investigar a importância dos diversos constituintes do extrato bruto sobre a atividade dessas enzimas e produção de NO.

16

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Material Vegetal

Extrato hidro alcoólico bruto (seco) das raízes secundárias de Harpagophytum procumbens (Burchell) DC. Ex Meissn. (Pedialiaceae) (garra-do-diabo), contendo 1,78% de harpagosideo, com certificado de procedência e atividade biológica.

3.2 Fracionamento do extrato

O fracionamento do extrato hidro alcoólico de H. procumbens e as análises fitoquímicas para obtenção e identificação das frações foram efetuadas no Instituto de Botânica de São Paulo e encontram-se resumidas no fluxograma da Figura 6.

17

Extrato seco

(26g)

Cromatografia

Flash

CHCl :MeOH

3

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Frações

Análise de iridóides revelada com

vanilina sulfúrica (3%) em etanol

Isolamento

CCDP frações reunidas de 5 a

G G G

G G

12 (ricas em iridóides)

de

0

1

2

3

4

iridóides

CLAE

Figura 6 - Esquema do fracionamento do extrato seco da garra-do-diabo por cromatografia

“flash” em coluna de sílica (200-400 mm Merck) com gradiente de eluição conforme (Zarate et al., 1992) e por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) (Huang et al., 2006). As frações obtidas por cromatografia “flash” foram monitoradas usando cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC) e revelação com vanilina sulfúrica e cromatografia líquida de alta eficácia (CLAE).

O extrato seco (26g) foi submetido a fracionamento em cromatografia “flash”,

utilizando coluna de vidro de 13,5 cm x 2,0 cm e contendo 14g de sílica gel (200-400

mm) (Merck) formando uma coluna de 5 cm da fase estacionária. A coluna permaneceu sob vácuo, sendo que o eluente CHCl3: MeOH adicionado lentamente (100ml) nas

proporções: 100% clorofórmio, 99:1, 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 100% metanol, resultando em 12 frações, conforme procedimento descrito por Huang et al. (2006). O rendimento das frações obtidas nesse fracionamento encontra-se na tabela 1.

18

Tabela 1- Peso e rendimento (%) das frações

Frações Peso Rendimento

(g)

(%)

F1(100)

0.0122

0.05

F2(99:1)

0.0261

0.10

F3 (98:2)

0.0169

0.07

F4 (96:4)

0.0181

0.07

F5 (94:6)

0.0138

0.05

F6 (92:8)

0.0297

0.11

F7 (90:10)

0.0467

0.18

F8 (85:15)

0.0494

0.19

F9 (80:20)

0.0499

0.19

F10 (70:30)

0.2517

0.97

F11 (50:50)

0.1267

0.49

F12(100%MeOH)

0.1379

0.53

Total

0.7791

O monitoramento do fracionamento foi efetuado por cromatografia de camada

delgada comparativa (CCDC) (Zarate et al., 1992) utilizando cromatoplacas de

alumínio, recobertas com sílica gel 60 F 254 (Merck), eluídas com a mistura CHCl3: MeOH (75:25 v/v). As cromatoplacas foram observadas sob luz UV nos comprimentos de onda 254 e 366 nm e reveladas com vanilina sulfúrica a 3% em etanol, um revelador que cora os iridóides (Chantre et al., 2000). As cromatoplacas foram fotografadas em sistema Camag Reprostar 3 a 256 e 366 nm e sob luz branca. Os resultados foram expressos em Rf. O perfil cromatográfico das 12 frações é apresentado nas Figuras 7 e 8.

index-29_1.jpg

index-29_2.jpg

index-29_3.jpg

19

Rf=0,49

Rf=0,33

Rf=0,10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 7 - Foto em sistema CAMAG da placa cromatográfica em CCDC das 12 frações do extrato de H. procumbens obtidas por cromatografia “flash”, e revelada com vanilina sulfúrica (3%). Eluição com CHCl3: MeOH (75:25 v/v) , mostrando os iridóides glicosilados.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 8 - Foto em sistema CAMAG da placa cromatográfica em CCDC das 12 frações do extrato obtidas por cromatografia “flash”. Eluição em CHCl3: MeOH (75:25 v/v) e visualização no comprimento de luz UV curto (256 nm).

index-30_1.jpg

20

As frações de F5 a F12 foram reunidas e alíquotas de cinco µl foram aplicadas nas placas cromatográficas de sílica gel 60 P254 (Merck) com 1mm de espessura, preparadas segundo Sthal (1969), eluídas em CHCl3: MeOH (75:25 v/v) e visualizadas em câmara de UV a 254nm e 366nm para determinação das áreas onde ficaram

adsorvidas as substâncias. As cinco sub-frações (G0 a G4) obtidas foram eluídas da sílica com metanol e o solvente eliminado em evaporador rotatório, pesadas e

armazenadas para análise. O perfil cromatográfico dessas sub-frações obtido com vanilina sulfúrica foi coerente com aquele descrito por Chantre et al., (2000). As três manchas de cor lilás de Rfs = 0,10; 0,33 e 0,49 foram atribuídas aos iridóides harpagideo, 8-p-coumaroil harpagideo e o harpagosideo, respectivamente. (Figura 9) Rf=0,49

Rf=0,33

(G1)

(G2)

Rf=0,10

(G3)

G1

G2

G3

Figura 9 - Cromatograma em CCDC das frações G1, G2 e G3 obtidas por CCPD. Rf= 0,49

(harpagosideo), Rf= 0,33 (8-p-coumaroyl harpagide), Rf= 0,10. Eluida em CHCl3: MeOH (75:25) e revelada com vanilina sulfúrica (3%)

As frações de 5 a 12 obtidas por cromatografia flash e as frações G1, G2 e G3

obtidas pela CCDP ricas em iridóides (teste positivo com vanilina sulfúrica) foram submetidas à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em cromatógrafo Varian Pro-Star série 00368, equipado com detector UV/Vis Pro-Star modelo 310, sistema de bomba Varian Pro-Star modelo 330, Workstation Star versão 6, 41, coluna analítica de

index-31_1.jpg

index-31_2.jpg

index-31_3.jpg

index-31_4.jpg

index-31_5.jpg

index-31_6.jpg

21

fase reversa C-18, 90 A, tamanho de 150 mm x 4,6mm com partículas de 5 mm de diâmetro. Foram aplicados 20µL de cada amostra filtrada em Millex HV 0,45 µm, utilizando como fase móvel da bomba A, água deionizada 50% e na bomba B, metanol grau CLAE (Baker). A eluição foi realizada com fluxo de 1mL/min, a detecção foi efetuada em 278 nm e o tempo de corrida foi de 30 minutos (Chantre et al., 2000; modificado). Os resultados foram expressos em tempo de retenção (Tr) em minutos e a concentração em %.

A mistura das frações de 5 a 12 obtidas por cromatografia flash foi denominada extrato B para os ensaios in vitro, e correspondem às frações ricas em iridóides (figura 10). Essa mistura de frações foi analisada em CLAE e os resultados mostraram que o harpagosideo estava presente na concentração de 56,1% e o ácido cinâmico na

concentração de 25,8%. As doses utilizadas nos ensaio foram de: 1 (30µg/ml), 2

(100µg/ml) e 3 (300µg/ml).

Extrato C

(fração 5)

Extrato A

(fração 7)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Extrato B

(frações 5 - 12)

Figura 10 - Perfil cromatográfico das frações de 1 a 12 (CCDC) mostrando a seleção dos extratos A, B e C utilizados nos ensaios in vitro.

22

A fração 5, obtida por cromatografia “flash” e denominada de extrato C (figura 10) foi selecionada com base na concentração de 2,7% harpagosideo e 84,6% de ácido cinâmico (CLAE) (figura 11). Os dados de deslocamento químico do espectro de

1HRMN que confirmaram a presença de ácido cinâmico livre nessa fração estão

descritos a seguir. As doses utilizadas no ensaio foram 1 (30µg/ml), 2 (100µg/ml) e 3

(300µg/ml).

A fração 7, obtida por cromatografia flash, denominada extrato A (figura 11) para os ensaios in vitro, foi selecionada com base na concentração de 88,6% harpagosideo CLAE (figura 12), sem ácido cinâmico. As doses utilizadas no ensaio foram de

1(30µM), 2(100µM) e 3 (300µM).

m Volts

317

Extrato C

12.

2,7 %harpagosideo +

700

Extrato A

84,6% ácido cinâmico

88,8% harpagosideo

600

500

400

300

6

2

68

200

5

2.

2202.2.2

7

971.

4

96

100

4.

3

1

56

6

726

3.

3.8

6.

9 8

475

194

8.

.03 .16

10.

20 20

0

-74

5

10

15

20

25

30

Minutes

Fração G1 - harpagosideo

(CCDP)

Rf=0,49

Figura 11 - Cromatogramas em sistema CLAE das frações obtidas por CCDP. Fase móvel A 50% metanol/fase móvel B 50%, fluxo de 1 ml/min, λ 278 nm, 30 minutos de tempo de eluição.

Varian Pro Star. Ensaio in vitro: Azul extrato A=88,8% harpagosideo; Vermelho =extrato C=

2,7% harpagosideo e 84,6% ácido cinâmico livre. Verde = fração G1 (CCDP) Rf= 0,49=

harpagosideo.

23

Extrato C

84,6% harpagosideo

Tr= 28,625min

m V olts

OH

20 0

3

1

5

4

O

15 0

2

7

10 0

Tr=24,251min

harpagosideo

50

51.2

24

5

62

28.

7

9

5

3

3

8

3

6

3

12

49

5

9

3

77

6

6

20

26

80

4

5

2

7

9

6

8

7

6

5

7

2

025054

89

70

96

273

56

.7

.1

.2

.3

.4

4.

09

16

36

0.

2.

3.

3.

4.

4.

6.

8.

9.

11.

14

18

18.

19.

20.

21

22.

25.

27

29

0

-2 2

5

10

1 5

2 0

2 5

30

Min ut es

Figura 12 – Cromatogramas em sistema CLAE em coluna phenomenex Luna 5uC 18250 X

4,60mm, bomba A H2O deionizada (50%) e bomba B metanol grau HPLC (Baker) (50%), fluxo de 1 ml/min, λ 278 nm, em 30 minutos, em sistema Varian Pro Star. Azul =extrato B= mistura das frações 5 a 12, a seta assinala o tempo que o harpagosideo aparece no sistema CLAE.

Vermelho = extrato C 84,6 % de ácido cinâmico e a estrutura química do harpagosideo.

3.3 Ensaios em sangue total da atividade da COX-1 e COX-2

Dentre as diferentes técnicas utilizadas para a avaliação da atividade das

enzimas COX-1 e COX-2 optou-se pelo método descrito por Patrignani et al., (1994) que expressa o resultado da atividade da COX-1 pela produção de TxB2 por plaquetas durante a coagulação e a atividade da COX-2 pela produção de PGE2 em sangue

humano total estimulado por LPS de Escherichia colli. Esse método permite avaliar a eficácia seletiva de drogas inibidoras de COX-2 em triagens clínicas, sendo o único método que permite ensaios ex vivo de drogas com potencial antiinflamatório.

24

3.4 Ensaios in vitro

3.4.1 Avaliação da atividade da COX-1

Uma amostra de 500µL de sangue venoso sem anticoagulante foi incubada por

1 hora a 37ºC e 5% de CO2. Após centrifugação (5 minutos, 1500 rpm), uma alíquota de 100µl de plasma (sobrenadante) foi misturada a 400µl de metanol, para precipitação de proteínas e o sobrenadante (200µl) armazenado a –70ºC para posterior

quantificação de TxB2 por radioimunoensaio (Patrignani et al., 1994).

3.4.2 Avaliação da atividade da COX-2

Uma amostra de 500µl de sangue venoso contendo 10 UI (1 gota) de heparina

foi incubada com 10µl/ml de LPS por 24h a 37ºC e 5% de CO2. Esse mesmo protocolo foi utilizado para incubação com extrato bruto hidro-alcoólico da garra-do-diabo e suas frações. Para avaliação da atividade basal da enzima, um tubo controle foi incubado sem LPS. Após centrifugação, uma alíquota de 100µl de plasma foi misturada a 400µl de metanol para precipitação de proteínas e o sobrenadante foi estocado a -70oC, para posterior quantificação de PGE2 (200µl em cada eppendorf) por radioimunoensaio (Patrignani et al., 1994, Mel o et al., 2000).

3.4.3 Quantificação de TXB2 e PGE2

As concentrações de TXB2 e PGE2 no sobrenadante seco por aeração com

nitrogênio foram determinadas por radioimunoensaio com separação magnética

empregando-se reagentes disponíveis comercialmente. Após a reconstituição dos reagentes com tampão, aos tubos 1 e 2 foram acrescentados 900µl do tampão e 100µl do eicosanóide marcado (contagem total); nos tubos 3 e 4, 200µl de tampão, 100µl do eicosanóide marcado (contagem não específica); nos tubos 5 e 6, 100µl do tampão, 25

100µl do eicosanóide marcado e 100µl de anti-soro não específico (B0). Os tubos 7 e 8

receberam 10µl do eicosanóide marcado, 100µl do anti-soro e 100µl do eicosanóide em duplicata em concentrações determinadas. Nos demais tubos foram colocados 100µl das amostras, 100µl do eicosanóide marcado e 100µl do anti-soro. Após incubação por 24 horas a 4oC, foram adicionados a todos os tubos, exceto nos tubos 1 e 2 , 750µl de uma suspensão de carvão magnético coberto por dextran e os tubos foram submetidos à centrifugação para separação magnética.O sobrenadante foi transferido para os frascos contendo 7 ml de líquido de cintilação e estes levados para contagem. Da média do número de contagens por minuto de cada amostra, foi subtraída a média da ligação não específica; o resultado foi dividido pela contagem total; o resultado foi dividido por aquele encontrado na ausência do ligante frio (B0) e foi expresso na forma de porcentagem, sendo os valores das concentrações padrões dos ligantes frios plotados em gráfico contra as concentrações. Os valores em pg/ml das amostras foram obtidos desse gráfico.

3.4.4 Ensaios in vitro – efeito do extrato bruto da garra-do-diabo na atividade enzimática da COX-1 e COX-2.

Para os ensaios in vitro, foram selecionados dentro do serviço de Reumatologia cinco voluntários sadios, que não estavam tomando nenhum tipo de droga

antiinflamatória pelo menos 15 dias antes do ensaio. O extrato hidro alcoólico bruto das raízes secundárias do H. procumbens foi dissolvido (1mg/1ml) em água destilada e 10µl de cada solução foram adicionados aos tubos. A concentração final de H.

procumbens no ensaio foi de 0,62; 1,25; 2,5; 5,0 e 10 µg. Essas concentrações representam doses crescentes de harpagosideo presentes em cada tubo e variaram de 1,12 a 17,8 µg.

26

3.4.5 Ensaios in vitro - efeito das diferentes frações da garra-do-diabo na atividade enzimática da COX-1 e COX-2 e produção de NO

As frações com diferentes composições e concentrações de harpagosideo foram

preparadas e utilizadas no ensaio in vitro para avaliação da atividade de COX-1, COX-2

e NO em sangue venoso de voluntários sadios sem uso de AINH por um período de 15

dias. As doses utilizadas foram: dose 1 contendo 30µM do extrato A e 30µg/ml dos extratos B e C; dose 2 100µM de A e 100µg/ml de B e C; dose 3 foram 300µM de A e 300µg/ml dos extratos B e C. Como controles positivos foram utilizados indometacina 40µM como inibidor da atividade da COX-1 e etoricoxibe 300µM como inibidor seletivo da atividade da COX-2 (Tacconelli et al., 2002).

Os ensaios para atividade da COX-1 e COX-2 foram realizados como descrito

anteriormente no item ensaio in vitro.e produção de NO foi determinado como descrito a seguir.

3.5 Análise dos metabólitos do NO - NO -

-

2 e NO3

Uma amostra de 500µl de sangue venoso periférico sem anticoagulante foi

retirada de voluntários sadios (ensaio in vitro) e foi adicionada a um tubo contendo 10 U

de heparina (1 gota) ,10µl de LPS e acrescidos de 10µl da dose das frações do extrato seco a ser testada. Para avaliação da produção basal de NO, um tubo controle foi incubado sem LPS. Os tubos contendo as amostras foram estimulados com LPS e

incubados por 24h a 37ºC com as mesmas frações utilizadas no ensaio in vitro. A quantificação de nitrito e nitrato foi realizada através da reação enzimática colorimétrica de Griess. A desproteinização das amostras foi realizada em plasma diluído a ½ em água miliQ, seguida por filtragem em filtro Milipore estéril de 0,44 µm. Para as dosagens de NO -

-

2 e NO3 foram misturados 200µl da amostra filtrada, 100µl de NADPH,

100µl de FAD, e 200µl de tampão padrão. Nos tubos para dosagem de NO -

2 , foram

adicionados 100µl de água e nos tubos para dosagem de NO -

3 100µl da enzima nitrato

27

redutase (Sigma). Os tubos com as amostras, bem como os das curvas padrão para NO -

-

2 e NO3 , foram incubados por 1 h a 25oC em banho - maria. Em seguida, os tubos foram imersos em banho por 3 minutos. Foram adicionados aos 200µl dessas amostras 400µl de reagente de Griess (Sigma) e após 10 minutos de incubação a 60oC, foi efetuada leitura em espectrofotômetro (Hitashi U-2000) a 546 nm. Nessas condições, o método tem sensibilidade de 30pmol para cada íon. Os resultados foram expressos como valores médios dos ensaios realizados em duplicata contra as respectivas curvas padrão. (Gillian et al., 1993). Os valores foram apresentados como a soma dos valores de NO -

-

2 e NO3 (µM) para cada amostra (Ding et al.,1988)

Esta determinação foi também realizada no sangue das pacientes selecionadas

para o ensaio ex vivo antes e após o tratamento.

3.6 Seleção das pacientes

O ensaio clínico foi realizado com 20 pacientes selecionadas de acordo com um protocolo clínico adaptado daquele proposto por Chrubasika et al. (2003). A adaptação foi necessária uma vez que algumas medidas e questionários utilizados no referido protocolo ainda não se encontram validados para a língua portuguesa. Os critérios de inclusão foram os seguintes:

(a)

OA de coluna lombar com dor por pelo menos seis meses, não atribuída a

qualquer causa específica como: prolapso discal, dor no quadril, espondilolistese, osteomalácia ou artrite reumatóide (AR);

(b)

Queixa de exacerbação da dor por pelo menos oito semanas em repouso

ou ao movimento;

(c) Valores maiores ou iguais a 5 na escala visual analógica horizontal de

dor;

28

(d)

Necessidade de tratamento sintomático por um período de seis semanas

avaliado pelo examinador.

Os critérios de exclusão foram os seguintes:

(a)

Trauma recente e possibilidade de fratura;

(b)

Participação em outro ensaio no período de 30 dias;

(c) Doenças sistêmicas graves como: neoplasias, hepatite auto-imune,

cirrose biliar, doenças hematológicas (anemia aplástica, plaquetopenia) e alteração da função renal;

(d)

Histórico de abuso de álcool ou drogas;

(e)

Alergia ao fito-terápico e

(f)

Dificuldade de compreensão.

Outras considerações tardias poderiam afastar as pacientes do estudo, tais

como uma perda acentuada de peso, fatores de risco para infecção medular ou

sintomas de acometimento da cauda eqüina.

As 20 participantes receberam informações verbais e escritas sobre o estudo

antes de serem convidadas a participar e deram consentimento por escrito de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de ética da Universidade de São Paulo (Anexo 1).

Nenhuma paciente fez uso de antiinflamatório não hormonal ou hormonal,

sulfato de glucosamina e condroitina, diacireína ou estatinas por um período de 15 dias antes do início do ensaio. Foi permitido o uso de cloridrato de tramadol (50mg) como medicação de resgate. As pacientes com fibromialgia associada não utilizaram

antidepressivos tricíclicos e foram monitoradas quanto ao número inicial e final dos pontos de gatilho (Anexo 2).

29

Todas as pacientes foram recrutadas em consultório particular na cidade de São Paulo. Para cada paciente uma ficha clínica com seus dados pessoais, peso, altura e índice de massa corporal, atividade física (tipo/duração/tempo), tempo de doença, co-morbidades e medicações em uso, foi preenchida (Anexo 2).

Cada paciente, antes e depois do tratamento, foi examinada (medida da

distância mão chão (DMC) e teste de Thomas) e respondeu aos questionários (“Health assessment questionnaire” (HAQ), questionário de incapacidade de Roland-Morris (RM) e avaliação global do tratamento). Amostras de sangue foram coletadas para análises laboratoriais, tais como velocidade de hemossedimentação (VHS), proteína C

reativa (PCR), cálcio, colesterol e fator reumatóide (FR) e para os ensaios ex vivo. A escala analógica visual (EVA) foi utilizada como parâmetro de inclusão no estudo.

3.6.1 Avaliação da flexibilidade da coluna lombar e questionários

A - Medida da distância mão chão

O teste DMC foi realizado instruindo a paciente a ficar em pé com os pés

afastados em uma distância de aproximadamente 15 cm. Nesse teste, o observador permanece atrás para observar as costas durante o movimento e adicionalmente

observa-a de lado para uma melhor vista do contorno da curva lombo sacro. A

distância entre o dedo médio e o chão foi medida sem que a paciente dobrasse os joelhos (Grom et al., 2000) (Anexo 2).

B - Teste de Thomas

O teste de Thomas foi realizado para avaliação da flexibilidade do quadril. O

teste consiste em deitar a paciente em posição supino sobre a mesa de exames, um joelho é levado ao peito da paciente e mantido por alguns segundos. É necessário que a região inferior da coluna lombar permaneça sobre a mesa. Na presença de uma 30

contratura em flexão do quadril, a perna estendida dobrará no nível do joelho e a coxa elevar-se-á da mesa (Grom et al., 2000) (Anexo 2).

C - Questionário sobre a avaliação de saúde

O HAQ foi também avaliado com a finalidade de medir o desgaste psicológico

associado com a dor lombar como parte do protocolo utilizado por Chrubasika et al.

(2003) (Anexo 4).

D - Questionário de incapacidade Roland Morris (RM)

O questionário RM foi respondido pelas pacientes antes e depois do tratamento (Martin et al., 2000). Esse questionário é simples, curto e facilmente entendido e enfoca exclusivamente as funções motoras (andar, curvar, vestir, sentar, deitar, dormir e cuidar-se). Apresenta escore com 24 pontos no qual a paciente assinala qual (is) a(s) frase (s) que descreve(m) a sua dor lombar naquele momento; as alterações de 2 a 3

pontos no escore são consideradas critérios de melhora para quadro de dor crônica (Anexo 5).

3.6.2 Exames de imagem

Os exames de Rx e a RNM da coluna lombar foram realizados antes do início do

tratamento para a caracterização do grau de OA das pacientes. A classificação de Modic utilizada foi usada para interpretação da doença degenerativa lombar discal com mudança no sinal adjacente na medula (Jones et al., 2005).

Essas mudanças à RNM podem ser caracterizadas por hipossinal em T1,

hiperssinal em T2 e realce na fase pós-contraste, indicando edema no osso subcondral (Modic I). Com a evolução do processo, ocorre a substituição da medula

hematopoiética por medula amarela (gordurosa) devido regressão do quadro

31

inflamatório visualizado como aumento do sinal em T1 e em T2 e ausência de realce (Modic II); na fase tardia do processo existe o predomínio de esclerose óssea (tecido fibrótico e neoformação óssea) caracterizada por um aumento de densidade nos Raios-X e por áreas de hipossinal em T1 e T2 sem realce (Modic III).

3.7 Ensaios ex vivo

Uma amostra 5 ml de sangue total de cada paciente participante foi coletada

antes e após o tratamento com garra-do-diabo para avaliação da ação terapêutica nas atividades das enzimas COX-1, COX-2 e produção de NO. Todos os passos para

essas avaliações já foram descritos acima no ítem ensaio in vitro.

Nesse protocolo, cada paciente recebeu 180 cápsulas gelatinosas contendo 500

mg do extrato hidro alcoólico seco das raízes secundárias da garra-do-diabo, para serem ingeridos (VO) quatro vezes ao dia, por seis semanas. O conteúdo diário de harpagosideo foi de 35,6 mg (ESCOP, 1997).

3.8 Análise estatística

Os resultados dos valores não paramétricos foram expressos em mediana

(variação). As comparações dentro do mesmo grupo foram analisadas por teste “t-Student” e quando a distribuição normal foi observada, os resultados foram expressos em média ± e.p.m. Para as medidas analisadas, o valor significativo foi p <0,05.

32

4. RESULTADOS

4.1 Ensaio clínico

O ensaio clínico foi realizado em 20 pacientes que apresentavam OA de coluna

lombar com exacerbação da dor. O tratamento com extrato bruto de garra-do-diabo na dose de 2g/dia, contendo 35,6mg de harpagosideo, foi mantido por seis semanas.

Nossa casuística está apresentada na Tabela 2. A média de idade das pacientes foi de 58 anos, variando entre 44 a 69 anos; a duração média da doença foi de 8,5

anos (2 - 20 anos), 55% das pacientes (11) tinham fibromialgia antes do tratamento, entretanto, não houve diferença estatística entre os grupos com e sem fibromialgia frente aos parâmetros analisadas (p>0,05). Cerca de 85% das pacientes realizavam atividade física por ocasião do estudo.

Tabela 2 - Características antropométricas e dados clínicos das 20

pacientes no início do ensaio clínico

Parâmetros avaliados

Valores

Idade (anos)

58 (44 – 69)

IMC (kg/m2)

26,8 (20,8 – 36,4)

Tempo de doença (anos)

8,5 (2 – 20)

Dor a menos de 8 anos (%)

40

Fibromialgia (%)

55

Modic – Tipo II (%)

98

33

O quadro de OA de coluna lombar foi confirmado por exames de Raios-X e RNM

e classificado pelo índice de Modic. As pacientes foram classificadas como sendo 98%

do tipo II e 2% do tipo I. Os resultados da avaliação clínica e parâmetros laboratoriais antes e depois do tratamento estão resumidos na tabela 3. Os valores de cálcio, EVA, DMC e RM foram reduzidos pelo tratamento (p<0,05). A avaliação funcional (HAQ) embora tenha melhorado, não atingiu níveis de significância estatística (p=0,063). O

VHS não foi alterado pelo tratamento. A prova de atividade inflamatória, proteína C

reativa (PCR) foi realizada por todas as pacientes e os resultados foram <0,5 mg/dL

antes do tratamento e após o tratamento.

Tabela 3. Avaliação clínica das 20 pacientes antes e após o tratamento com 2g/dia do extrato da garra-do-diabo por 6 semanas.

Parâmetros Antes

do

Após

Valor de

p

tratamento

tratamento

z

VHS

13,5(3 -49)

10(2 -51 )

-1,43 0,153

Cálcio Total

9,65(8,6-10,6)

9,2(7,8-9,8)

-2,66

0,008*

Colesterol

202(149 - 332 )

204(162 - 313)

-0,4 0,687

total

EVA

6(5 -8 )

3,5(0 -9 )

-3,36

0,001*

DMC

13,5(0 -36 )

8(0 -21 )

-2,17

0,030*