Efeitos da utilização de insulina e de um implante transitório de biomembrana de látex natural... por Marcos Miranda de Araújo - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

MARCOS MIRANDA DE ARAUJO

Efeitos da utilização de insulina e de um implante

transitório de biomembrana de látex natural,

derivado da seringueira Hevea brasiliensis, em um

modelo experimental de perfuração traumática de

membrana timpânica

RIBEIRÃO PRETO

2012

MARCOS MIRANDA DE ARAUJO

Efeitos da utilização de insulina e de um implante

transitório de biomembrana de látex natural,

derivado da seringueira Hevea brasiliensis, em um

modelo experimental de perfuração traumática de

membrana timpânica

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Doutor em Ciências

Médicas.

Área

de

Concentração:

Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-

Vestibular.

Orientador: Prof. Dr. Miguel Angelo Hyppolito

RIBEIRÃO PRETO

2012

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,

DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Araujo, Marcos Miranda de

Efeitos da utilização de insulina e de um implante transitório de

biomembrana de látex natural, derivado da seringueira Hevea brasiliensis,

em um modelo experimental de perfuração traumática de membrana

timpânica. Ribeirão Preto, 2012.

163p.: 33 il.; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP. Área de Concentração: Mecanismos Fisiopatológicos nos

Sistemas Visual e Audio-Vestibular.

Orientador: Hyppolito, Miguel Angelo.

1. Perfuração da membrana timpânica; 2. Cicatrização; 3. Insulina;

4. Latex; 5. Colágeno; 6. Imuno-histoquímica;

7. Processamento de imagem assistida por computador.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aluno: Marcos Miranda de Araujo

Título: Efeitos da utilização de insulina e de um implante transitório de

biomembrana de látex natural, derivado da seringueira Hevea brasiliensis, em

um modelo experimental de perfuração traumática de membrana timpânica.

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Doutor em Ciências

Médicas.

Área

de

Concentração:

Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-

Vestibular.

Aprovado em:____/____/____

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituição:______________________

Assinatura:___________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição:______________________

Assinatura:___________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição:______________________

Assinatura:___________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição:______________________

Assinatura:___________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição:______________________

Assinatura:___________________________

Dedicatória

À minha esposa Adriana Sanches Garcia de Araújo,

amor da minha vida, companheira fiel de todos os

momentos, enriquecendo-me de justiça, honra,

prosperidade e vida.

“Muitas mulheres procedem virtuosamente, mas tu

a todas sobrepujas” (Provérbios 31:29).

Ao meu filho Lucas Garcia de Araújo, amado

milagre de Deus na minha vida e fonte de

inspiração.

“Os filhos são herança de Deus” (Salmos 127:3)

Aos meus pais, Roberval e Maria, a minha gratidão

eterna por me ensinarem os verdadeiros valores

desta vida.

Aos meus irmãos, Marina e Roberto, pela amizade e

boas lembranças de uma convivência inesquecível.

Agradecimentos

Ao orientador Prof. Dr. Miguel Ângelo Hyppolito, tutor,

incentivador e um grande exemplo de seriedade,

compromisso e raciocínio científico. Sábias palavras de

estímulo nos momentos de decisões.

À Prof. Dra. Maria Célia Jamur, serenidade de mestre, pelo

acolhimento, permitindo livre acesso às dependências dos

Laboratórios de Histotecnologia, além da contribuição

fundamental na Metodologia deste estudo.

Ao Prof. Dr. Joaquim Coutinho-Netto (in memoriam), que, em

conversas fugazes, conseguiu ampliar os horizontes de

discussão do estudo, sendo um dos responsáveis pelos avanços

das pesquisas dos derivados da seringueira Hevea brasiliensis.

Às técnicas Adriana Andrade Batista Murashima e Vani

Maria Alves, pelas inúmeras contribuições e pela amizade

construída com vários momentos de trabalho em conjunto.

Meu sincero carinho e agradecimento!

À técnica Maria Rossato, pela disponibilidade e dedicação ao

Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e

Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Ao técnico Anderson Souza, pelas orientações na captura de

imagens histológicas, a minha gratidão.

Aos médicos patologistas Michel Antonio Kiyota Moutinho,

Richard Augusto Ribeiro e Elizete Lopes Guilherme, por me

receberem em seu Serviço de Patologia de São Carlos, a minha

gratidão.

Ao Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e

Cirurgia de Cabeça e Pescoço, pela oportunidade de

realização do curso de Doutorado.

À FAPESP, pelo apoio financeiro.

Epígrafe

“O estudo em geral, a busca da verdade e da

beleza são domínios em que nos é consentido

ficar crianças por toda a vida”.

(Albert Einstein)

“Continuar com os objetivos e aceitar o tempo

são a melhor forma de obter os resultados

desejados”.

(Autor desconhecido)

RESUMO

Resumo

ARAUJO, M. M. Efeitos da utilização de insulina e de um implante

transitório de biomembrana de látex natural, derivado da seringueira

Hevea brasiliensis, em um modelo experimental de perfuração traumática

de membrana timpânica. 2012. 163f. Tese (Doutorado) - Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

Nos últimos anos, houve uma tendência na busca por substâncias reguladoras

que pudessem otimizar o processo de cicatrização de membranas timpânicas

(MTs) perfuradas. Objetivos: Determinar os efeitos da utilização da insulina

tópica e da biomembrana de látex natural, de forma isolada e em associação,

no processo de cicatrização de perfurações traumáticas de MTs. Materiais e

Métodos: MTs de 61 ratos Wistar foram perfuradas nas porções anterior e

posterior ao cabo do martelo. Os animais foram divididos em quatro grupos:

Controle, Insulina, Látex e Insulina+Látex. No grupo Insulina, as perfurações

foram tratadas com uso tópico de insulina regular. No grupo Látex, tratadas

com biomembrana de látex natural. No grupo Insulina+Látex, tratadas com

associação da insulina e da biomembrana de látex. As MTs foram avaliadas

por técnicas histológicas com três, cinco e sete dias após sua perfuração

traumática. Foram analisadas as morfometrias das espessuras das camadas

epitelial, fibrosa e mucosa; tamanho da perfuração; área de secção transversal

da MT; avaliação semiquantitativa e qualitativa da produção de colágeno por

microscopia de polarização; e avaliação imuno-histoquímica das células

epiteliais, dos miofibroblastos e da vascularização. Resultados: A insulina e a

biomembrana de látex anteciparam o fechamento das perfurações traumáticas

de MTs (p<0,01); estimularam precocemente o aumento da espessura da

camada epitelial externa (p<0,01); promoveram aumento precoce da espessura

da camada fibrosa (p<0,01); contribuíram para a maior identificação do

anticorpo anti-panqueratina como marcador epitelial (p<0,05); aumentaram a

marcação do anticorpo anti-alfa-actina de músculo liso (p<0,05), caracterizando

maior proliferação de miofibroblastos. A insulina, isoladamente, provocou maior

formação do colágeno tecidual (p<0,05), com fibras colágenas mais espessas e

melhor organizadas (p<0,05). Conclusão: A insulina e a biomembrana de látex

natural, de forma isolada e em associação, aceleraram o processo de

cicatrização de perfurações traumáticas de MTs.

Palavras-chave: Perfuração da membrana timpânica; Cicatrização; Insulina;

Látex; Colágeno; Imuno-histoquímica; Processamento de imagem assistida por

computador.

ABSTRACT

Abstract

ARAUJO, M. M. Effects of the treatment using insulin and a transitory

natural latex biomembrane implant from rubber tree Hevea brasiliensis, in

an experimental model of traumatic perforation of tympanic membrane.

2012. 163f. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

In recent years, there has been a tendency to search for regulatory substances

that can optimize the healing process of perforated tympanic membranes

(TMs). Objectives: To determine the effects of using topical insulin and natural

latex biomembrane, alone or in combination, in the healing process of traumatic

perforations of TMs. Methods: TMs of 61 Wistar rats were perforated in two

sections, anterior and posterior to the malleus. The rats were divided into 4

groups: Control, Insulin, Latex, and Insulin+Latex. The Insulin group was

treated with topical regular insulin. The Latex group was treated with natural

latex biomembrane. The Insulin+Latex group was treated with a combination of

insulin plus latex biomembrane. The TMs were histologically examined 3, 5, and

7 days post-perforation through morphometric analysis of the thickness of the

epithelial, fibrous, and mucosal layers; size of the perforation; cross sectional

area of the TM; semiquantitative and qualitative evaluation of the collagen

production by polarization microscopy, and immunohistochemical evaluation of

epithelial cells, myofibroblasts, and vascularization markers. Results: Insulin

and latex biomembrane accelerated the healing process of the perforated TMs

(p<0.01); stimulated early thickening of the outer epithelial layer (p<0.01);

promoted premature increase in the thickness of the fibrous layer (p<0.01);

contributed to a larger identification of anti-pankeratin antibody as epithelial

marker (p<0.05); increased labeling of anti-alpha smooth muscle actin antibody

(p<0.05), indicating greater proliferation of myofibroblasts. When insulin was

used alone, it resulted in greater formation of collagen tissue (p<0.05), with

thicker and better-organized collagen fibers (p<0.05). Conclusion: Insulin and

natural latex biomembrane, used alone or in combination, accelerated the

healing process of traumatic perforations of TMs.

Keywords: Tympanic membrane perforation; Wound healing; Insulin; Latex;

Collagen; Immunohistochemistry; Image processing, computer-assisted.

LISTA DE FIGURAS

Lista de Figuras

Figura 1-

Visão esquemática macroscópica da membana timpânica.

(Adaptada de Wenig; Michaels, 2007) ....................................... 29

Figura 2-

Desenho esquemático histológico da secção transversal da

MT de macacos. (Adaptado de Lim, 1968) ................................ 30

Figura 3-

Distribuição celular ao longo do tempo durante as fases de

cicatrização tecidual. (Adaptada de Witte; Barbul, 1997) ........... 33

Figura 4-

Diagrama esquemático mostrando as cadeias moleculares

da insulina, pró-insulina, IGF-I, IGF-II e relaxina. (Modificado

de Blundell; Humbel, 1980) ........................................................ 38

Figura 5-

Mecanismos de sinalização do receptor de insulina,

descrevendo a cascata de mecanismos moleculares

relacionados com o transporte de glicose, a síntese de

proteína e o crescimento celular. (Modificado de Youngren,

2007) .......................................................................................... 42

Figura 6-

(A) Agulha 30x0,8 mm; (B) MT de rato sob otomicroscopia;

(C) Insulina humana regular; (D) Membrana de látex de 1,2

mm de diâmetro; (E e F) Posicionamento de membrana de

látex sobre as perfurações de MT .............................................. 50

Figura 7-

Imagem de alta resolução de MT corada em HE ilustrando

aferição da espessura total da MT e de cada camada

(epitelial, lâmina própria, mucosa) separadamente ................... 55

Figura 8-

Imagem de alta resolução de MT corada em HE ilustrando

as medições das perfurações anterior (ant); posterior (post)

(traço amarelo); (CAE) conduto auditivo externo; (m) cabo

do martelo (Magnificação de 40x) .............................................. 56

Figura 9-

Imagem do programa Image Pro-Plus® v. 7.0 ilustrando: (A)

MT; após, determinação das medidas Área e Perímetro; (B)

com a função “Filled” (do inglês “preenchido”), e (C) “Outline”

(do inglês "delineado”) ............................................................... 57

Figura 10-

Ilustração do histograma de cores (à esquerda) identificando

as 256 cores de imagem de 8-bit (à direita) ............................... 59

Figura 11-

Imagens de cortes histológicos de MT ilustrando a aplicação

do algoritmo color deconvolution. (A) Corte histológico de MT

corado com Hematoxilina e DAB com marcação para

anticorpo anti-panqueratina identificado por coloração de

tonalidade marrom. (B) O mesmo corte histológico após a

decomposição de cores, identificando apenas a coloração de

Lista de Figuras

tonalidade marrom

marcada pelo cromógeno DAB.

(Magnificação de 20x, submetidas a zoom de 100%) ................ 60

Figura 12-

Imagens de corte histológico de MT do grupo Controle após

três dias de perfuração traumática corado em HE ..................... 64

Figura 13-

Imagens de corte histológico de MT do grupo Insulina após

três dias de perfuração traumática corado em HE ..................... 66

Figura 14-

Imagens de cortes histológicos de MT do grupo Controle

após cinco dias de perfuração traumática corado em HE .......... 68

Figura 15-

(A) Imagens de cortes histológicos de MT do grupo Insulina;

(B, C e D) do grupo Insulina+Látex. Após cinco dias de

perfuração traumática corado em HE. ....................................... 70

Figura 16-

Imagens de corte histológico de MT do grupo Controle após

sete dias de perfuração traumática corado em HE .................... 72

Figura 17-

Imagens de cortes histológicos de MT após sete dias de

perfuração traumática corado em HE ........................................ 73

Figura 18-

Imagens de cortes histológicos de MT após cinco dias de

perfuração traumática com coloração PicroSirius Red (PSR) .... 75

Figura 19-

Imagens de cortes histológicos de MT com coloração

PicroSirius Red (PSR). (A, B, C e D) grupo Insulina após

cinco dias de perfuração ............................................................ 76

Figuras 20- Cortes histológicos com marcação Imuno-histoquímica para

anticorpo

anti-panqueratina

e

contra-coloração

com

Hematoxilina .............................................................................. 78

Figuras 21- Cortes histológicos com marcação Imuno-histoquímica para

anticorpo anti-alfa actina de músculo liso e contra-coloração

com Hematoxilina ...................................................................... 80

Figura 22-

Cortes histológicos com marcação imuno-histoquímica para

anticorpo anti-fator de von Willebrand e contra-coloração

com Hematoxilina ...................................................................... 82

Figura 23-

Representação gráfica da espessura epitelial (µm) ao longo

do tempo (Dias) (# indica p≤0,01 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)........................................................... 84

index-15_1.png

index-15_2.png

Lista de Figuras

Figura 24-

Representação gráfica da espessura fibrosa (µm) ao longo

do tempo (Dias) (# indica p≤0,01 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)........................................................... 85

Figura 25-

Representação gráfica da espessura mucosa (µm) ao longo

do tempo (Dias) (# indica p≤ 0,01 e {} indica 0,01 < p≤0,05

em relação ao Grupo Controle em cada tempo) ........................ 86

Figura 26-

Representação gráfica das perfurações timpânicas (µm) ao

longo do tempo (Dias) (# indica p≤0,01 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)........................................................... 87

Figura 27-

Representação gráfica das áreas das MTs (µm2) ao longo do

tempo (Dias) .............................................................................. 88

Figura 28-

Representação gráfica dos perímetros das MTs (µm) do

tempo (Dias) ({} indica 0,01 < p≤0,05 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)........................................................... 90

Figura 29- Representação gráfica da porcentagem de área de

birrefringência do colágeno (%) ao longo do tempo (Dias).

Porcentagem de área de birrefringência do colágeno

correspondeu à razão da área ocupada pelo colágeno total e

a área total da MT (# indica p 0,01 e {} indica 0,01 < p≤0,05

em relação ao Grupo Controle em cada tempo) ........................ 91

Figura 30-

Representação gráfica da porcentagem da birrefringência de

tonalidade red, orange, yellow e green (vermelho, laranja,

amarelo e verde) do colágeno tecidual (%) ao longo do

tempo (Dias). A porcentagem de birrefringência de cada

tonalidade correspondeu à divisão do número de pixels de

cada área correspondente a cada variação de cores pelo

total de pixels de colágeno tecidual avaliado em cada MT ({}

indica 0,01 < p≤0,05 em relação ao Grupo Controle em cada

tempo) ........................................................................................ 93

Figura 31-

Representação gráfica da porcentagem de área corada com

cromógeno DAB identificando o anticorpo primário anti-

panqueratina (%) ao longo do tempo (Dias). A porcentagem

de área corada com DAB foi calculada dividindo a área da

MT corada com DAB dividida pela área total da MT. (# indica

p 0,01 e {} indica 0,01 < p≤0,05 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)........................................................... 95

Figura 32-

Representação gráfica da porcentagem de área corada com

cromógeno DAB identificando o anticorpo primário anti-alfa-

actina de músculo liso (%) ao longo do tempo (Dias). A

porcentagem de área corada com DAB foi calculada

Lista de Figuras

dividindo a área da MT corada com DAB dividida pela área

total da MT ({} indica 0,01 < p≤0,05 em relação ao Grupo

Controle em cada tempo)............................................................... 96

Figura 33-

Representação gráfica da porcentagem de área corada com

cromógeno DAB identificando o anticorpo primário anti-fator

de von Willebrand (%) ao longo do tempo (Dias). A

porcentagem de área corada com DAB foi calculada

dividindo a área da MT corada com DAB dividida pela área

total da MT ..................................................................................... 97

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

Lista de Símbolos e Abreviaturas

®-

Marca registrada

µm-

Micrômetro

ABNT-

Associação Brasileira de Normas Técnicas

Akt-

Serina/treonina quinase (do inglês serine-threonine kinase)

ANVISA-

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

bFGF-

Fator de crescimento de fibroblasto básico (do inglês basic

Fibroblast Growth Factor)

BSA-

Albumina de soro bovino (do inglês Bovine serum albumin)

Da-

Dalton

DAB-

Diaminobenzidina

EDTA-

Etileno diamino tetra acetato

EGF-

fator de crescimento Epidérmico (do inglês Epidermal

Growth Factor)

ELISA-

Teste imunoenzimático que permite a detecção de

anticorpos e antígenos específicos (do inglês Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay)

EUA-

Estados Unidos da América

FDA-

Food and Drug Administration

FGF-

Fator de crescimento de Fibroblasto (do inglês Fibroblast

Growth Factor)

FvW-

Fator de von Willebrand

GCon-

Grupo Controle

GH-

hormônio de crescimento (do inglês Growth Hormone)

GIns-

Grupo Insulina

GInsLat-

Grupo Insulina mais Látex

GLat-

Grupo Látex

Lista de Símbolos e Abreviaturas

Grb2-

Proteína 2 ligante do receptor para fator de crescimento (do

inglês growth-factor-receptor-bound protein 2)

HE-

Hematoxilina-eosina

HRP-

Peroxidase de rábano (do inglês Horseradish Peroxidase)

IGF-

Fator de crescimento insulina-símile (do inglês Insulin-like

Growth Factor)

IGF-I-

Fator de crescimento insulina-símile-I (do inglês Insulin-like

Growth Factor-I)

IGF-II-

Fator de crescimento insulina-símile-II (do inglês Insulin-like

Growth Factor-II)

IHQ-

Imuno-histoquímica

IL-

Interleucina

IR-

Receptor da insulina

IRS 1-

Substrato 1 do receptor de insulina (do inglês insulin

receptor substrate 1)

IRS 2-

Substrato 2 do receptor de insulina (do inglês insulin

receptor substrate 2)

MAPK-

Quinase ativadora da atividade mitogênica (do inglês

mitogen-activated protein kinase)

mm-

Milímetro

MT-

Membrana Timpânica

NaOH-

Hidróxido de sódio

p-

P roporção, representação da significância estatística

PBS-

Solução de fosfato tamponada (do inglês Phosphate-

buffered saline)

PDGF-

Fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês

Platelet Growth Derived Factor)

PI 3-kinase-

Fosfatidil inositol 3- quinase

Lista de Símbolos e Abreviaturas

PLGA-

Ácido poliláctico glicol, substância utilizada para confecção

de microesferas como matriz de liberação lenta

PSR-

Coloração PicroSirius Red

Raf-

Quinase serina-treonina ativada pelo Ras

Ras-

Membro da família de proteínas ligantes de GTP

RGB-

Vermelho, verde e azul (do inglês Red, Green, Blue)

Shc-

Molécula adaptadora e substrato do receptor de insulina

SOS-

Fator de troca guanina nucleotídeo para o Ras

SUS-

Sistema Único de Saúde

TGF-

Fator de crescimento de transformação (do inglês

Transforming Growth Factor)

TGF-β-

Fator de crescimento de transformação beta (do inglês

Transforming Growth Factor-Beta)

U-

Unidade internacional, medida padronizada

VEGF/ VEGFR-

Fator de crescimento vascular endotelial/ receptor do fator

de crescimento vascular endotelial (do inglês Vascular

Endothelial Growth Factor/ Vascular Endothelial Growth

Factor Receptor)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 22

2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 28

2.1. Anatomia e Histologia da Membrana Timpânica .............................................. 29

2.1.1. Pars tensa .............................................................................................. 30

2.1.2. Pars flaccida .......................................................................................... 31

2.2. Etiologia e Epidemiologia das Perfurações de MT ........................................... 31

2.3. Cicatrização ..................................................................................................... 32

2.3.1. Fase inflamatória ou exsudativa ............................................................. 33

2.3.2. Fase proliferativa .................................................................................... 34

2.3.3. Fase de remodelação ............................................................................. 36

2.4. Fatores de Crescimento ................................................................................... 37

2.5. Fatores de Crescimento da Família Insulina-Símile ......................................... 37

2.5.1. Insulina ................................................................................................... 39

2.5.2. Receptor de insulina ............................................................................... 40

2.6. Biomembrana de Látex Natural........................................................................ 43

3. OBJETIVOS.................................................................................................. 45

4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 47

4.1. Processamento Histológico e Coloração De Rotina ......................................... 51

4.1.1. Coloração com hematoxilina e eosina .................................................... 52

4.1.2. Coloração com Picrosirius Red............................................................... 52

4.1.3. Avaliação imuno-histoquímica ................................................................ 52

4.2. Microscopia ..................................................................................................... 53

4.2.1. Análise Morfométrica.............................................................................. 53

4.2.2. Análise computadorizada do colágeno de imagens com coloração de

picrosirius red sob luz polarizada............................................................ 58

4.2.3. Análise computadorizada de imagens com coloração imuno-

histoquímica ......................................................................................... 59

4.3. Análise Estatística ........................................................................................... 61

5. RESULTADOS ............................................................................................. 62

5.1. Coloração Hematoxilina e Eosina .................................................................... 63

5.1.1. Três dias após perfuração traumática de MT ......................................... 63

5.1.1.1. Grupo controle ........................................................................... 63