Em busca de novos métodos de tratamento para a retinose pigmentar causada por mutações na rodopsina por Fernanda Balen - Versão HTML

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FERNANDA BALEN

EM BUSCA DE NOVOS MÉTODOS DE TRATAMENTO

PARA A RETINOSE PIGMENTAR CAUSADA POR

MUTAÇÕES NA RODOPSINA

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduacão em Biologia Celular e

Tecidual

do

Instituto

de

Ciências

Biomédicas da Universidade de São

Paulo, para obtenção do Título de Doutor

em Ciências.

Área de concentração: Biologia Celular e

Tecidual

Orientadora: Profa. Dra. Dânia Hamassaki

Co-orientadora: Profa. Dra. Judith Klein-

Seetharaman

Versão

corrigida.

Versão

original

eletrônica encontra-se disponível tanto na

biblioteca do ICB quanto na biblioteca

digital de teses e dissertações da USP

(bdtd).

São Paulo

2012

ABSTRACT

Balen F. Finding new approaches to treat retinitis pigmentosa caused by mutations in the

photoreceptor rhodopsin [Ph.D. Thesis (Cell and Developmental Biology)]. São Paulo:

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2012.

Retinitis Pigmentosa (RP) is an inherited disease that progressively leads to blindness. To

date, more than 150 mutations associated with RP are known in rhodopsin. In vitro studies

have shown that most of these mutations cause misfolding of rhodopsin. It has been

hypothesized that molecular instability of the rhodopsin structure is responsible for disease

severity in patients, but there is still no effective therapy to treat RP. Administration of

vitamin A or retinoid derivatives is being used to rescue correctly folded rhodopsin and to

slow down the degeneration, however, this treatment alone cannot cure RP. The focus of

this thesis was to test the hypothesis that molecules other than retinal can help to rescue

folded rhodopsin and/or reduce photoreceptor cell death. For that, the binding of other

ligands to rhodopsin, was investigated in vitro, by studying the effects of the ligands on

WT rhodopsin as well engineered rhodopsin mutants, and in vivo by making use of

different rat models of RP . The major findings of this thesis are: I) The RP mutations,

Asn-15-Ser (N15S) and Pro-23-His (P23H) were studied and characterized in vitro.

Expression of these mutants in the presence of 9 -cis and 11 -cis retinal reveals that they

differ in characteristics and severity, despite their global classification into the same class.

N15S is slightly defect in structure, stability and cellular localization. P23H, on the other

hand, is severely impaired at the molecular and cellular levels. II) Binding of small

molecules, namely metal ions (Zn2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Mg2+ and Mn2+), the anthocyanin

cyanidin-3-glucoside (C3G) and the chlorophyll-derivative chlorin e6 (Ce6), was tested. It

was shown that these ligands directly interact with rhodopsin in vitro. Biophysical

evidence indicated differential effects of these ligands on rhodopsin function, structure and

dynamics. Ce6 was shown to be the best candidate to confer stability to the rhodopsin

protein in vitro. III) Assessment of the effects of Ce6 on the stability of rhodopsin was

tested in vivo: (a) First, normal rats, Sprague Dawley (SD), were subjected to light-

damage. Treatment with Ce6 appears to have only a minor effect on prevention of retinal

damage. (b) Secondly, the effects of Ce6 on RP progression in vivo were evaluated in the

P23H and Ser334ter (S334ter) rat models. Histological and functional analysis indicated

that Ce6 seems to exert a positive functional effect by slowing the rate of P23H

photoreceptor degeneration in vivo. In contrast, Ce6 increased the photoreceptor

degeneration of the S334ter rat in vivo. Collectively, the studies presented in this thesis

enhance the knowledge related to several RP mutations, namely P23H, N15S and S334ter,

which were found to cause misfolding of the photoreceptor rhodopsin in vitro and/or

mediate the RP disease in vivo. It also conveys a new possibility for treatment of the RP

disease with the identification of molecules (retinals, divalent metal ions, porphyrins and

anthocyanins) that could aid in the stability and folding and modulate photoreceptor

structure and function, thus paving the way to selectively target this receptor and aid

directly in vision-rescue strategies.

Key-words: Retinitis Pigmentosa. Rhodopsin. Photoreceptors.

RESUMO

Balen F. Em busca de novos métodos de tratamento para a retinose pigmentar causada por

mutações na rodopsina [Tese (Doutorado em Biologia Celular e Tecidual)]. São Paulo:

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2012.

Retinose Pigmentar (RP) é uma doença hereditária que progressivamente conduz à

cegueira. Atualmente, são conhecidas mais de 150 mutações da rodopsina. Estudos in

vitro mostraram que a maioria destas mutações altera a conformação da rodopsina

sugerindo que a instabilidade molecular da estrutura da rodopsina é responsável pela

gravidade da RP em pacientes. Todavia, uma terapia efetiva para tratar a RP ainda não foi

estabelecida. Administração de vitamina A ou derivados de retinóides são usados como

tratamento para mediar a correta formação da rodopsina ou reduzir a degeneração.

Contudo, o uso exclusivo desse tratamento não é suficiente para curar a RP. O objetivo

desta tese foi testar a hipótese de que outras moléculas, além dos retinóides, poderiam

influenciar na conformação correta da rodopsina e/ou reduzir a morte dos fotorreceptores.

Com este objetivo, foi investigada in vitro e in vivo a ligação de outros compostos

moleculares à rodopsina. Os efeitos destes compostos foram estudados in vitro na

rodopsina selvagem e mutantes, e in vivo, utilizando diferentes modelos de ratos . Os

principais resultados desta tese são: I) As mutações da RP Asn-15-Ser (N15S) e Pro-23-

His (P23H), foram estudadas e caracterizadas in vitro. A expressão destas mutações na

presença de retinóides 9 -cis ou 11 -cis revelou que ambas apresentam diferenças em

características e severidade, apesar de serem globalmente classificados dentro da mesma

classe. O N15S apresentou estrutura, estabilidade e localização celular levemente anormal.

O P23H mostrou-se altamente anormal, tanto em nível molecular quanto celular. II) A

ligação de pequenas moléculas à rodopsina foi investigada, utilizando-se os íons metálicos

Zn2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Mg2+ e Mn2+, a antocianina cianidina-3-O-glicosídeo (C3G) e o

derivado da clorofila clorina e6 (Ce6). Verificou-se que estes ligantes interagem

diretamente com a rodopsina in vitro. Evidências biofísicas indicaram efeitos

diferenciados destes ligantes na função, estrutura e dinâmica da rodopsina. Entre todos,

Ce6 conferiu maior estabilidade à rodopsina in vitro. III) A avaliação dos efeitos do Ce6

na estabilização da rodopsina foi testada in vivo: (a) Primeiramente, ratos Sprague Dawley

(SD) normais foram submetidos à degeneração por luz. O tratamento com Ce6 apresentou

um efeito muito pequeno na prevenção da degeneração retiniana induzida por

fototoxicidade. (b) Em seguida, o efeito do Ce6 na progressão da RP foi avaliado nos ratos

modelos P23H e Ser334ter (S334ter). Análises histológicas e funcionais indicaram que o

Ce6 parece exercer um efeito positivo diminuindo a taxa de degeneração dos

fotorreceptores dos ratos P23H. Por outro lado, o Ce6 aumentou a degeneração dos

fotorreceptores do rato S334ter. Coletivamente, os estudos apresentados aumentam o

conhecimento relacionado às diversas mutações da RP, P23H, N15S e S334ter, as quais

causam a má-formação da rodopsina in vitro e/ou medeiam a RP in vivo. Este estudo

também conduz a novas possibilidades de tratamento da RP por meio da identificação de

moléculas (retinóides, íons metálicos divalentes, porfirinas e antocianinas) que podem

ajudar na estabilização e formação da rodopsina, assim como na modulação da estrutura e

função do fotorreceptor, objetivando a seleção específica do receptor e auxiliando

diretamente em estratégias para o resgate da visão comprometida pela RP.

Palavras-chave: Retinose Pigmentar. Rodopsina. Fotorreceptores.

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