Estudo do gene GPR54 nos distúrbios puberais centrais idiopáticos por Milena Gurgel Teles Bezerra - Versão HTML

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MILENA GURGEL TELES BEZERRA

Estudo do gene GPR54 nos distúrbios

puberais centrais idiopáticos

Tese apresentada a Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção de

título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Ana Claudia Latronico

São Paulo

2008

index-2_1.png

Este trabalho foi realizado na Unidade de

Endocrinologia do Desenvolvimento e no

Laboratório de Hormônios e Genética Molecular

LIM/42 da Disciplina de Endocrinologia do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo, com o apoio da

FAPESP (processo 05/50146-5) e da CAPES

(4482-05-0).

Dedicatória

Dedico este trabalho ao meu marido,

João Evangelista Bezerra Neto, amor

da minha vida, amigo e companheiro

de todos os momentos.

Agradecimentos

Agradeço a todos que contribuíram direta e indiretamente para a

realização deste trabalho. Algumas menções especiais:

À Profa. Dra. Ana Claudia Latronico, minha orientadora, um exemplo

admirável de competência profissional, como médica, pesquisadora e

professora. Agradeço sua amizade, dedicação, incentivo, paciência,

otimismo contagiante e alegria cativante que tornaram a realização dessa

tese uma atividade extremamente prazerosa.

À Profa. Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça, pela oportunidade,

pelos valiosos ensinamentos profissionais e de vida. Pela incansável busca

pela excelência, constante dedicação e impressionante capacidade de

coordenação e organização. Obrigada por suas sugestões e conselhos

enriquecedores.

Ao Dr. Vinicius Nahime Brito, pelo companheirismo, paciência,

ensinamentos, incentivo e valiosa amizade.

Ao Prof. Dr. Ivo J. P. Arnhold, pelo apoio, incentivo, pelos comentários

sempre pertinentes e inteligentes, e pelos ensinamentos de vida.

À Dra. Ana Elisa Correa Billerbeck, pelos preciosos ensinamentos

sobre os fundamentos de biologia molecular, pela ajuda na bancada e

principalmente pela amizade.

À Dra. Emilia Modolo Pinto, pelos ensinamentos na bancada, por seus

prestativos ensinamentos na bancada e amizade.

À Dra. Ericka Barbosa Trabach, por sua excelência técnica,

capacidade de trabalho, disponibilidade constante e, sobretudo, amizade e

apoio incondicionais.

À Dra. Rocio Riatto Della Coletta, pelo apoio e incentivo constantes,

cumplicidade e amizade.

Ao Dr. Alexander Augusto de Lima Jorge, pela admirável dedicação à

pesquisa e constante disponibilidade em ajudar e ensinar todos à sua volta.

À Dra. Elaine Costa, pelos ensinamentos no ambulatório de pacientes

de hipogonadismo hipogonadotrófico.

Às Dras. Ursula Kaiser e Suzy Bianco pela importante colaboração na

realização dos estudos funcionais desse trabalho.

A todos os funcionários do Laboratório de Hormônios e Genética

Molecular LIM/42, pela paciência com os pós-graduandos, ensinamentos,

generosidade e dedicação; especialmente às secretárias Francinilda da Silva

P. Oliveira (Nildinha), Ana Lúcia Farah, Cristiane Sandrini pela eficiência e

auxílios constantes, e, ainda, Francisca Pereira, Maria Aparecida Medeiros,

Cristina Rossi, Francineide Pereira Alves, Miriam Yumie Nishi, Alzira

Sampaio e Gisele por toda a ajuda na bancada.

A todos os funcionários do Ambulatório da Unidade de Endocrinologia

do Desenvolvimento.

Aos colegas pós-graduados: Sorahia Domenice, Maria Cândida

Fragoso, Tânia Bachega, Regina Martin, Luciani Carvalho, Rafaela Vieira

Correa, pela colaboração e cooperação.

Aos colegas pós-graduandos:

Letícia Silveira, Priscilla Cukier pela ajuda na organização da

casuística de pacientes de puberdade precoce;

Ana Paula Abreu, pela ajuda na organização da casuística de pacientes

de hipogonadismo hipogonadotrófico;

Antônio Lerário por compartilhar uma gama enorme de conhecimentos

técnico-práticos;

Catarina Brasil D’Alva pela amizade e conselhos profissionais preciosos;

Karina Freitas, Márcia Helena Costa, Karina Berger, Madson Almeida,

Frederico Marchisotti, Maria Edna, Débora Cabral, Larissa Gomes, Luciana

Brito, Carolina Cani, Camila Gomes, Maíra, Luciana Montenegro, Maria

Estela, Everlayny. Obrigada a todos os colegas do LIM-42 pelo convívio

agradável e pela troca de experiências e dúvidas.

À FAPESP e à CAPES pelo apoio financeiro que permitiu a realização

deste trabalho.

Aos meus pais José Telles e Francy Mary, e irmãos Guilherme,

Germanno e Mirella, constantes fontes de amor, apoio e estímulo em minha

vida.

Ao meu esposo maravilhoso, João Evangelista, por seu amor intenso,

puro e sincero, por seu apoio, companheirismo e cumplicidade que me

tornam uma pessoa completa, feliz e realizada.

Sumário

Lista de abreviaturas

Lista de figuras

Lista de tabelas

Resumo

Summary

1. Introdução ...................................................................................................1

1.1 Distúrbios puberais em humanos .....................................................3

1.2 Distúrbios puberais e defeitos genéticos ..........................................6

1.3 GPR54 e HHIn..................................................................................9

1.4 Modelos murinos ............................................................................12

1.5 Caracterização do gene GPR54.....................................................13

1.6 Ligante do GPR54 - kisspeptina .....................................................14

1.7 Estudos in vivo do sistema kisspeptina-GPR54 .............................15

1.8 GPR54 e Puberdade Precoce ........................................................18

2. Objetivos...................................................................................................19

3. Métodos ....................................................................................................21

3.1 Casuística.......................................................................................22

3.2 Avaliação hormonal ........................................................................25

3.3 Avaliação molecular........................................................................26

3.3.1 Extração do DNA genômico de leucócitos periféricos .............26

3.3.2 Reação de polimerização em cadeia (PCR) ............................27

3.3.3 Seqüenciamento automático ...................................................28

3.3.4 Predição de mudança de sítio de splicing................................28

3.3.5 Digestão por enzima de restrição ............................................28

3.3.6 Ensaio de amplificação por ligação de múltiplas sondas

(MPLA).....................................................................................29

3.4 Estudos in vitro ...............................................................................30

3.4.1 Mutagênese sítio-dirigida.........................................................31

3.4.2 Estudos de sinalização do GPR54 ..........................................31

3.4.3 Ensaio de fosfatidilinositol (IP).................................................31

3.4.4 Ensaio de ERK fosforilada .......................................................32

3.4.5 Ensaios de ligação ao receptor................................................33

3.4.6 Ensaios de Ligação ao Receptor ao Longo do Tempo ............33

4. Resultados ................................................................................................35

4.1 Puberdade Precoce........................................................................36

4.1.1 Análise do DNA .......................................................................36

4.1.2 Estudo Funcional da Mutação R386P .....................................37

4.2 Hipogonadismo Hipogonadotrófico.................................................39

4.2.1 Análise de DNA .......................................................................39

4.2.2 Predição de splicing.................................................................40

4.2.3 Análise do gene GPR54 pelo método MLPA ...........................40

4.3 Retardo puberal..............................................................................41

5. Discussão .................................................................................................43

5.1 Puberdade Precoce........................................................................45

5.2 Hipogonadismo Hipogonadotrófico e Retardo Puberal...................48

6. Conclusões ...............................................................................................51

7. Anexos......................................................................................................53

8. Referências...............................................................................................75

Apêndice

Lista de abreviaturas

Lista de abreviaturas

μg/kg

Microgramas por quiilograma

ACTH Hormônio

adrenocorticotrófico

Arg-Phe-NH2

Arginina e fenilalanina com resíduo amida

Bmax

Capacidade máxima de ligação

BSA

Albumina séria bovina

CHO

Células derivadas de ovário de hamster chinês

COOH Carboxiterminal

COS-7

Células de rim de macaco verde africano

cpm Contagens

por

minuto

CRH

Hormônio liberador de corticotrofina

DAX1

Gene do fator codificado por uma região crítica do

cromossomo X associada ao sexo reverso e à

hipoplasia adrenal congênita

DMEM

Dulbecco’s modified eagle medium

DNA Ácido

desoxirribonucléico

DP Desvio-padrão

E2 Estradiol

EC50

Concentração efetiva máxima

EDTA Ácido

etilenodiamino tetracético

EGF

Fator de crescimento epidermal

ERKs Proteinoquinases

reguladas por sinal extracelular

FGFR1

Gene que codifica o receptor do fator de

crescimento de fibroblasto do tipo 1

FSH Hormônio

folículo-estimulante

FSHR

Gene do receptor de FSH

FSHβ

Gene da subunidade β receptor de FSH

GABA

Ácido gama aminobutírico

GnRH

Decapeptídeo hipotalâmico liberador de

gonadotrofinas

GnRH1

Gene que codifica o hormônio liberador de

gonadotrofinas

GnRH-R

Receptor de GnRH

GPR54 Receptor

acoplado à proteína G - 54

gpr54 -/-

knockout do gene gpr54 murino

HEPES Ácido

4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfônico

HESX1

Gene homeobox da bolsa de Rathke

HHIn Hipogonadismo

hipogonadotrófico isolado

normósmico

IC Idade

cronológica

IFMA Ensaio

imunofluorométrico

IFMA Imunofluorométrico

IgG Imunoglobulina

G

IL-1 Interleucina

1

IL-6 Interleucina

6

IO Idade

óssea

IP Fosfatidilinositol

IP3

Trifosfato de inositol

KAL1

Gene que codifica a proteína de matriz anosmina

Kd

Constante de dissociação

KiSS1

Gene que codifica a kisspeptina

LH Hormônio

luteinizante

LH

Gene da subunidade β receptor de LH

LHR

Gene do receptor de LH

LHX3

Gene homeobox LIM 3

MAPquinases

Proteinases ativadas por mitogênese

MgSO4

Sulfato de magnésio

MLPA

Ensaio de amplificação por ligação de múltiplas

sondas

NaCl

Cloreto de sódio

NaOH

Hidróxido de sódio

NELF Fator

nasal

embriônico do hormônio liberador de LH

NH2 Aminoterminal

NPY Neuropeptídeo

Y

pb

Pares de base

PBS

Solução salina tamponada com fosfato

PC1

Gene da enzina pró-convertase 1

pERK Proteinoquinase

regulada por sinal extracelular

fosforilada

PIP2

Difosfato de inositol

PMSF Fluoreto

de

fenilmetilsulfonil

PPDG

Puberdade precoce dependente de gonadotrofinas

PPIG

Puberdade precoce independente de gonadotrofinas

PROK2 Proquineticina-

2

PROKR2

Receptor da proquineticina- 2

PROP1

Gene profeta do fator de transcrição específico da

pituitária 1 (Pit1)

ptn Proteína

RCCP

Retardo constitucional do crescimento e

desenvolvimento

Rho Rodopsinas

RIE Radioimunoensaio

RNA Ácido

ribonucléico

RNAm: RNA

mensageiro

RNM

Ressonância nuclear magnética

SDS

Dodecil sulfato de sódio

SF1

Gene do fator esteroidogênico 1

SNC

Sistema nervoso central

TE

Tampão tris e EDTA

TGF β

Fator de crescimento de fibroblastos β

TGFα

Fator de crescimento de fibroblastos α

Tris-HCl Trisaminometano

hidrocloreto

VIP

Peptídeo intestinal vasoativo

Vmax Velocidade

máxima

WT Selvagem

Lista de figuras

Lista de figuras

Figura 1 - Esquema representativo do gene do receptor GPR54

humano......................................................................................65

Figura 2 - Modelo da estrutura de um receptor acoplado à proteína G......66

Figura 3 - Seqüência de nucleotídeos do gene GPR54 selvagem e

mutante (R386P)........................................................................67

Figura 4 - Representação da seqüência de aminoácidos do receptor

GPR54. ......................................................................................68

Figura 5 - Ensaio de deslocamento de ligação.. ........................................69

Figura 6 - Produção de IP após estímulo com kisspeptina em células

transfectadas com o GPR54 selvagem ou mutante R386P.......70

Figura 7 - Fosforilação de ERK ao longo do tempo em células

transfectadas com GPR54 selvagem ou mutante R386P..........71

Figura 8 - Estudo de ligação ao receptor ao longo do tempo.....................72

Figura 9 - Seqüência do intron 2 e exon 3 do GPR54 selvagem e com

a mutação indel..........................................................................73

Figura 10 - Representação esquemática dos exons 2 e 3 do gene

GPR54. ......................................................................................74

Lista de tabelas

Lista de tabelas

Tabela 1- Causas de hipogonadismo hipogonadotrófico ...........................54

Tabela 2- Doenças monogênicas do eixo reprodutivo ...............................55

Tabela 3- Dados clínicos e hormonais dos pacientes com PPDG

idiopática....................................................................................56

Tabela

4-

Dados clínicos e hormonais dos pacientes com HH

idiopático....................................................................................59

Tabela 5- Dados clínicos e hormonais dos pacientes com RCCP .............61

Tabela 6- Valores normais de testosterona e LH no sexo masculino,

obtidos nos ensaios IFMA e RIE em pré-púberes e adultos ......63

Tabela 7- Valores normais de estradiol e LH no sexo feminino,

obtidos nos ensaios de IFMA e RIE em pré-púberes e

adultos. ......................................................................................63

Tabela 8 - Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos cinco

exons do gene GPR54...............................................................64

Tabela 9 - Características clínicas e hormonais de três pacientes com

HHIn, e mutações do gene GPR54............................................64

Resumo

Teles,MG. Estudo do gene GPR54 nos distúrbios puberais centrais

idiopáticos [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo; 2008. 84p.

O complexo de sinalização kisspeptina-GPR54 é um regulador chave para

ativação dos neurônios de GnRH e do eixo reprodutivo. Mutações inativadoras no

GPR54 foram identificadas em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico

normósmico isolado (HHIn). A partir desse achado, hipotetizamos que mutações

ativadoras no GPR54 resultariam na liberação prematura de GnRH e,

conseqüentemente, no aparecimento de puberdade precoce, dependente de

gonadotrofinas (PPDG). No presente estudo, investigamos a presença de

mutações ativadoras e/ou polimorfismos em pacientes com PPDG, assim como a

presença de mutações inativadoras e/ou polimorfismos em pacientes HHIn ou

retardo constitucional do crescimento e desenvolvimento puberal (RCCP). Cento

e catorze pacientes com distúrbios puberais centrais idiopáticos foram

selecionados, sendo 53 com PPDG, 33 com HHIn e 28 com RCCP. Cento e

cinqüenta controles brasileiros que relatavam desenvolvimento puberal normal

foram estudados. A região codificadora do GPR54 de todos os pacientes foi

amplificada utilizando-se oligonucleotídeos intrônicos específicos, seguida de

purificação enzimática e seqüenciamento automático. No grupo de puberdade

precoce, identificamos uma nova variante em heterozigose no exon 5 do GPR54,

que se caracterizou pela troca do aminoácido arginina por prolina na posição 386

(R386P) do receptor. Esta substituição foi encontrada em uma menina adotada

com PPDG e estava ausente nos controles normais. Estudos in vitro

demonstraram que as quantidades de fosfatidil-inositol (IP) e o grau de

fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (pERK) em condições

basais não foram significativamente diferentes entre as células transfectadas com

o receptor selvagem ou com o receptor contendo a mutação R386P, indicando

que não havia ativação constitutiva do receptor. No entanto, estudos por tempos

mais prolongados demonstraram que a quantidade de IP e o grau de pERK

permaneceram significativamente mais altos nas células transfectadas com o

receptor mutante quando comparadas ao selvagem, indicando ativação da

sinalização intracelular, porém por um mecanismo não-constitutivo. No grupo de

hipogonadismo, duas novas variantes foram identificadas em três pacientes. Uma

mutação do tipo inserção/deleção ( indel) em homozigoze no sítio aceptor de

splicing no intron 2 (IVS2-4_-2delGCAinsACCGGCT) do GPR54 foi identificada

em dois irmãos com HHIn. Uma troca em heterozigose, E252Q, foi identificada

em um paciente com HHIn esporádico. As duas alterações estavam ausentes no

grupo controle. Polimorfismos foram encontrados nos pacientes com RCCP. Em

conclusão, descrevemos a primeira mutação ativadora do GPR54 associada ao

fenótipo de PPDG. Descrevemos uma nova mutação inativadora em sítio de

splicing em pacientes com HHIn, entretanto mutações inativadoras do GPR54

são uma causa rara de HHIn.

Descritores: 1.Puberdade precoce dependente de gonadotrofinas

2.Hipogonadismo hipogonadotrófico isolado 3.Retardo constitucional do

crescimento e desenvolvimento 4.Receptor GPR54 5.Mutações ativadoras

6.Mutações inativadoras

Summary

Teles MG GPR54 gene analysis in patients with idiopathic central pubertal

disorders [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo”; 2008. 84p

The kisspeptin-GPR54 signaling complex is a gatekeeper of pubertal activation

of GnRH neurons and of the reproductive axis. Inactivating mutations in the

GPR54 receptor were identified in patients with normosmic isolated

hypogonadotropic hypogonadism (nIHH). Based on this observation, we

hypothesized that gain-of-function mutations of the human GPR54 receptor

might be associated with premature activation of GnRH release, leading to

gonadotropin-dependent precocious puberty (GDPP). In the present study, we

investigated the presence of GPR54 activating mutations or polymorphisms in

patients with GDPP and inactivating mutations or polymorphisms in patients

with nIHH or constitucional delay of puberty (CDP). A hundred fourteen patients

were selected; 53 with GDPP, 33 with nIHH and 28 with CDP. A hundred and

fifty Brazilian controls who reported normal pubertal development were also

studied. The entire coding region of GPR54 of all patients was amplified using

specific intronic oligonucleotides followed by enzymatic purification and

automated sequencing. We have identified a novel variant in heterozygous state

in exon 5 of GPR54, R386P, in an adopted girl with GDPP. This substitution

was absent in all controls. Basal inositol phosphate (IP) and phosphorilated

extracellular signal–regulated kinase (pERK) levels in cells transfected with WT

or R386P GPR54 were not significantly different indicating that there was not a

constitutive activation of the receptor. However, studies performed in more

prolonged times demonstrated that the IP and the pERK levels were

significantly higher in cells transfected with the mutant receptor when compared

to the wild type, indicating that the signaling pathway was still activated although

by a non-constitutive mechanism. In the nIHH cohort, we have identified two

novel variants in three patients. The first variant was an insertion/deletion ( indel)

in homozygous state within the constitutive acceptor splice site of intron 2 of

GPR54 (IVS2-4_-2delGCAinsACCGGCT) identified in two male siblings with

nIHH. The second variant was the change E252Q in heterozygous state in a

patient with sporadic nIHH. Both alterations were absent in the control

population. We have found only polymorphisms in patients with CDP. In

conclusion, we have described the first activating mutation in GPR54 associated

with the GDPP phenotype. We have also described a novel splice site

inactivating mutation in patients with nIHH however, inactivating mutations of

GPR54 represent a rare cause of nIHH.

Descriptors: 1.Gonadotropin-dependent precocious puberty 2.Normosmic

isolated hypogonadotropic hypogonadism 3.Constitutional delay of puberty

4.GPR54 receptor 5.Activating mutations 6.Inactivating mutations

1. Introdução

Introdução

2

A puberdade compreende o período de transição entre a infância e a

vida adulta quando são desenvolvidos os caracteres sexuais secundários e

ocorre a aquisição das funções reprodutivas1. O início da puberdade ocorre

a partir do aumento da amplitude da secreção pulsátil do decapeptídeo

hipotalâmico liberador de gonadotrofinas (GnRH). Este representa o primeiro

passo conhecido do processo de ativação seqüencial do eixo hipotálamo-

hipófise-gonadal. O aumento dos pulsos de GnRH leva à liberação das

gonadotrofinas hipofisárias, hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-

estimulante (FSH) que, por sua vez, estimulam ovários e testículos,

induzindo a secreção dos esteróides sexuais gonadais e a produção de

gametas maduros2.

Os princípios da secreção pulsátil do GnRH, assim como o seu papel

fundamental no início da puberdade foram bem estabelecidos nas últimas

duas décadas3, 4. A secreção do GnRH é proeminente no lactente sendo

seguida de um período de relativa quiescência durante toda a infância1.

A reemergência dos pulsos do GnRH ocorre no final da infância e coincide

com o início da puberdade. No entanto, a regulação de sua secreção e seu

comportamento durante os diferentes estágios da vida são fenômenos ainda

não completamente elucidados.

A secreção de GnRH hipotalâmico é coordenada por uma rede

neuronal complexa, constituída de neurônios estimulatórios e/ou inibitórios e

pela ativação recíproca de mecanismos de comunicação glia-neurônio4-6.

Introdução

3

Os principais neurotransmissores e neuromoduladores inibitórios são os

opióides endógenos, o ácido gama aminobutírico (GABA), o peptídeo intestinal

vasoativo (VIP), o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e a melatonina.

Destacam-se como principais neurotransmissores excitatórios: glutamato,

norepinefrina, dopamina, serotonina e mais recentemente a kisspeptina,

juntamente com o seu receptor, GPR544, 7. Ao neuropeptídeo Y (NPY) são

atribuídas tanto uma atividade excitatória quanto inibitória sobre a secreção de

GnRH8. As células da glia e os fatores de crescimento, tais como fator de

crescimento de fibroblastos (TGFα e β), fator de crescimento epidermal (EGF),

citoquinas e interleucinas (IL-1 e IL-6), estão também implicados no complexo

mecanismo regulatório da secreção de GnRH5, 6. A leptina, hormônio secretado

principalmente pelos adipócitos, tem sido implicada no início da puberdade

humana9. No entanto, evidências obtidas a partir dos estudos em modelos

animais e em humanos apontam para um papel permissivo deste hormônio no

eixo reprodutivo. A leptina atua como mediadora do tônus excitatório de GnRH,

e não como desencadeadora do processo puberal9.

1.1 Distúrbios puberais em humanos

A idade de início puberal varia amplamente e segue uma distribuição

normal ou gaussiana1. Considera-se que o início do processo puberal é

normal quando o aparecimento dos caracteres sexuais secundários ocorre

entre 8 e 13 anos nas meninas, e entre 9 e 14 anos nos meninos1, 10.

Introdução

4

Classicamente, a puberdade é considerada precoce quando se inicia antes

dos 8 anos nas meninas e dos 9 anos nos meninos. Em contraposição, o

atraso puberal é caracterizado pela ausência dos caracteres sexuais

secundários a partir dos 13 anos nas meninas e 14 anos nos meninos1, 2.

A puberdade precoce pode ser classificada quanto à sua origem em

dois grupos. Denomina-se puberdade precoce dependente de

gonadotrofinas (PPDG), ou central quando o desenvolvimento dos

caracteres sexuais secundários é conseqüência da ativação prematura do

eixo hipotálamo-hipófise-gonadal; e puberdade precoce independente de

gonadotrofinas (PPIG), ou periférica quando o seu aparecimento é uma

conseqüência da produção autônoma dos esteróides sexuais, principalmente

pelas gônadas ou adrenais.

A incidência estimada da PPDG é de 1:10.000 – 1:5.00010, 11. A PPDG

é considerada idiopática quando o exame de imagem do sistema nervoso

central (SNC), preferencialmente a ressonância nuclear magnética (RNM),

afasta causas orgânicas de ativação do eixo gonadotrófico. Nos casos de

PPDG idiopática, a incidência descrita é de até dez casos em meninas para

cada caso em meninos10. No sexo masculino, as anormalidades

neurológicas são responsáveis por 2/3 dos casos de puberdade precoce

central, sendo que os tumores do SNC representam o fator etiológico na

metade dos pacientes com esse diagnóstico12.

O atraso puberal pode ser dividido em três subtipos: retardo

constitucional do crescimento e desenvolvimento, caracterizado pelo

início tardio da puberdade normal ou pela atenuação de sua progressão,

Introdução

5

sendo esta a causa mais comum de atraso puberal; hipogonadismo

hipogonadotrófico, caracterizado pela diminuição da síntese e da

secreção das gonadotrofinas e hipogonadismo hipergonadotrófico,

definido pela disfunção gonadal primária, com conseqüente aumento da

secreção de gonadotrofinas2.

O retardo constitucional do crescimento e desenvolvimento (RCCP)

é considerado variação normal e ocorre quando indivíduos saudáveis

entram espontaneamente na puberdade após os 13 anos para as meninas

e após os 14 anos para os meninos13, 14. Classicamente, os pacientes

apresentam baixa estatura, atraso do desenvolvimento sexual e estirão

puberal tardio e atenuado. Os pacientes apresentam boa saúde e bom

padrão nutricional, porém crescem mais lentamente desde a infância. É

mais comum nos meninos15.

O hipogonadismo hipogonadotrófico caracteriza-se pela deficiência da

secreção de GnRH a partir dos neurônios hipotalâmicos ou pela deficiência

da secreção hipofisária de LH e FSH16. Essa forma de hipogonadismo

apresenta várias causas orgânicas (Tabela 1), podendo a deficiência de

gonadotrofinas ser combinada ou isolada. Na ausência de condições

patológicas associadas ao hipogonadismo transitório e de lesões orgânicas

centrais, esta condição é denominada idiopática. O diagnóstico diferencial

entre hipogonadismo hipogonadotrófico isolado idiopático e RCCP pode ser

difícil pois, em ambas as situações, ocorre superposição de achados clínicos

e laboratoriais2. Por isso, o seguimento clínico e laboratorial prolongado é

necessário para a apropriada distinção dessas duas condições.

Introdução

6

1.2 Distúrbios puberais e defeitos genéticos

O início da puberdade humana está relacionado a fatores ambientais,

socioculturais, étnicos e econômicos1. É notável que a variação etária do

início da puberdade segue um padrão familiar, sugerindo a influência de

fatores genéticos1, 17. A idade da menarca semelhante entre mães e filhas, a

concordância do desenvolvimento puberal entre gêmeos monozigóticos

quando comparados a dizigóticos são aspectos que reforçam esse fato1. No

início de 2004, de Vries e cols. 18 estudaram retrospectivamente um grande

número de crianças israelenses com puberdade precoce central. De 453

pacientes estudados, 156 apresentavam a forma idiopática de PPDG.

Destas, 147 eram do sexo feminino e 9 do sexo masculino. Quarenta e três

crianças (27%) preenchiam os critérios para puberdade precoce familial18.

Após análise de segregação dessas famílias, foi possível estabelecer um

padrão de herança autossômico dominante com penetrância incompleta e

sexo-dependente18. Portanto, fatores genéticos parecem ter um papel

importante no início da puberdade.

Na última década, diversos fatores, incluindo receptores hormonais,

proteínas de matriz, neurotransmissores, fatores de transcrição, foram

estudados e anormalidades gênicas foram identificadas em condições de

precocidade e de atraso puberal19-21. Essas descobertas propiciaram um

grande avanço na compreensão da fisiologia e da fisiopatologia do eixo

hipotálamo-hipófise-gonadal nesta importante fase de transição da vida, além

de contribuírem positivamente para a prática clínica da medicina reprodutiva.

Introdução

7

Inúmeras mutações inativadoras em genes que interferem no eixo

gonadotrófico foram relacionadas ao hipogonadismo hipogonadotrófico

(Tabela 2)22-29. O hipogonadismo hipogonadotrófico isolado é

caracterizado por valores baixos de esteróides sexuais na presença de

valores normais ou baixos de LH e FSH, na ausência de outras

deficiências hipofisárias30. É uma condição causada pela secreção ou

ação deficiente do decapeptídeo hipotalâmico GnRH. Pode ocorrer

associado a alterações olfatórias quando é denominado síndrome de

Kallmann ou com olfato normal, nesse caso também chamado de

hipogonadismo hipogonadotrófico isolado normósmico (HHIn).

A síndrome de Kallmann é a forma mais comum de hipogonadismo

hipogonadotrófico, ocorrendo em 1/10.000 indivíduos do sexo masculino e

1/50.000 indivíduos do sexo feminino31. Mutações inativadoras nos genes

KAL1 22, 23foram relacionadas à síndrome de Kallmann de herança ligada ao

X e autossômica dominante, respectivamente22, 23. O gene KAL1 codifica a

proteína de matriz anosmina e o FGFR1 codifica o receptor do fator de

crescimento de fibroblasto do tipo 1. Esses dois fatores são essenciais para

a adequada migração dos neurônios de GnRH para o hipotálamo. Mais

recentemente, mutações no receptor da proquineticina- 2 (PROKR2) e seu

ligante (PROK2) foram relacionadas à síndrome de Kallmann25.

As primeiras mutações inativadoras relacionadas ao HHIn foram

descritas no gene do receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas,

GnRH-R 26 e, mais recentemente, no gene do receptor acoplado à proteína

G, GPR54 28, 29. Mutações inativadoras nos receptores FGFR1 e PROKR2

também foram descritas nos pacientes com HHIn27. Mutações inativadoras

Introdução

8

nos genes que codificam as subunidades beta das gonadotrofinas também

constituem uma causa rara de HHIn32, 33.

Contrastando com as mutações inativadoras descritas em pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico, mutações ativadoras relacionadas à

puberdade precoce foram descritas em pacientes com PPIG. Mutações

ativadoras do receptor de LH promovem aumento da secreção de

testosterona pelos testículos e causam puberdade precoce limitada ao sexo

masculino familial, também conhecida como testotoxicose34-36. Mutações

ativadoras também são responsáveis pelo fenótipo de PPIG na síndrome de

McCune-Albright, que se caracteriza pela presença de mutações somáticas

pós-zigóticas na subunidade α da proteína G em diversos tecidos, inclusive

gônadas, e levam ao quadro de hiperfunção hormonal, manchas café-com-

leite e displasia fibrosa óssea20. Essas duas patologias têm em comum o

fato de que o receptor de LH e a subunidade alfa adquirem a capacidade de

ativar o sinal intracelular mesmo na ausência do ligante, condição chamada

de ativação constitutiva.

A identificação de genes envolvidos no controle do início da

puberdade representa uma etapa importante na compreensão dos

mecanismos que estão envolvidos no início da puberdade humana1, 4.

Entretanto, até o momento não se tem conhecimento sobre alterações

estruturais em genes que afetam o eixo gonadotrófico causando PPDG.

Um novo receptor, GPR54, e seu ligante, kisspeptina, são

considerados elementos-chave para o controle da secreção de GnRH e para

o início da puberdade. Mutações gênicas que causam ativação desse

sistema representam uma possibilidade para explicar o fenótipo de PPDG.

Introdução

9

1.3 GPR54 e HHIn

Em 2003, dois grupos independentes descreveram as primeiras

mutações inativadoras no GPR54 28, 29. Por meio da metodologia de análise

de ligação, duas famílias com HHIn e alto grau de consangüinidade foram

estudadas. Inicialmente, mutações no gene do receptor GnRH foram

excluídas. A utilização de mais de 300 marcadores polimórficos para o

genoma mostrou que um único marcador encontrava-se em homozigose em

todos os afetados, permitindo a identificação de um novo locus na região do

braço curto do cromossomo 1928, 29. De Roux e cols.28, 29, após

seqüenciamento de vários genes candidatos desta região, identificaram uma

macrodeleção de 155 pares de base (pb), em homozigose, localizada na

transição do intron 4 com o exon 5 do gene GPR54 28. Esta deleção removeu

o sítio de splicing, e resultou em uma proteína truncada a partir do

aminoácido 247. Todos os afetados desta família francesa foram

homozigotos para a deleção de 155 pb, contrastando com os membros não

afetados que não apresentaram a deleção ou possuíam apenas um alelo

afetado. No segundo estudo, realizado por Seminara e cols.29, seis membros

de uma grande família árabe apresentavam uma mutação missense em

homozigose no exon 3 do gene GPR54. A troca do nucleotídeo timina na

posição 1143 por uma citosina resultou na substituição do aminoácido

leucina por uma serina na posição 148 (L148S) na segunda alça intracelular

da proteína. Essa alteração esteve ausente em 130 controles normais.

Nesse mesmo estudo, duas novas mutações em heterozigose (R331X e

Introdução

10

X399R) foram identificadas em um paciente negro americano, portador de

HHIn esporádico. A avaliação hormonal desse paciente mostrou

concentrações baixas de LH medidas por um período de 24 horas, porém

com resposta puberal após tratamento crônico com GnRH exógeno29.

O modelo funcional de transfecção do receptor GPR54 em células COS-7

incluiu as três distintas linhagens mutantes (L148S, R331X e X399R) e

demonstrou diminuição da resposta de fosfatidilinositol (IP) nas células que

continham receptores mutados. Estes achados demonstraram pela primeira

vez que o HHIn pode ser causado por mutações inativadoras do receptor

GPR54. Evidenciaram ainda, a importância deste receptor na regulação do

processo puberal e conseqüentemente na fisiologia do eixo gonadotrófico.

Após a primeira descrição, novas mutações foram descritas no gene

GPR54, envolvendo o fenótipo de HHIn. Em 2005, Sample RK e cols.37

estudaram os genes do receptor GPR54 e de seu ligante, KiSS1, em 30

pacientes com hipogonadismo hipogonadotófico ou retardo puberal. Um

paciente com hipogonadismo hipogonadotrófico de origem afro-caribenha e

turca apresentou duas novas mutações do tipo missense em estado de

heterozigose composta. Estas mutações caracterizaram-se pela troca de uma

cisteína por arginina na posição 223 (C223R) na quinta hélice

transmembrana, e pela substituição de uma arginina por leucina (R297L) na

terceira alça extracelular do receptor GPR54. Estudos in vitro do receptor com

a mutação C223R demonstraram uma diminuição de 80% da capacidade de

sinalização. No entanto, estudos funcionais da sinalização intracelular do

receptor com a mutação R297L demonstraram apenas leve comprometimento

de sua função. Apenas polimorfismos no gene KiSS1 foram encontrados

Introdução

11

neste estudo37. Ainda em 2005, Lanfranco e cols. 38 descreveram uma nova

mutação do tipo frameshift em heterozigose, 1001_1002insC. A inserção

ocorreu no sétimo segmento transmembrana do receptor e resultou em um

acréscimo de vários resíduos de prolina hidrofóbicos, conferindo um

alongamento de 43 aminoácidos na porção intracelular da proteína38. No final

de 2006, Tenenbaum-Rakover, Y e cols. 39 descreveram uma nova mutação

do tipo missense em homozigose, L102P, em duas famílias consangüíneas de

ascedência árabe, não relacionadas. A variante foi resultado da troca de uma

timina por citocina na posição 305 do exon 2 do GPR54. Estudos funcionais in

vitro avaliaram o acúmulo de IP e comprovaram uma diminuição completa de

sua geração39. Os indivíduos com a mutação L102P apresentaram uma

resposta variável ao teste de estímulo agudo com GnRH. Um dos membros

afetados foi acompanhado por aproximadamente dez anos, o que possibilitou

melhor caracterização da resposta ao teste de estímulo agudo com GnRH ao

longo do tempo. As concentrações de LH e FSH após o estímulo elevaram-se

progressivamente durante o seguimento chegando a concentrações quase

puberais por volta dos 21 anos de idade. Esse achado sugere que a mutação

inativadora L102P levaria a um defeito do eixo gonadotrófico mais quantitativo

do que qualitativo39.

Até o presente momento foram descritas oito diferentes mutações

inativadoras no GPR54 em pacientes com HHIn, incluindo uma deleção28,

uma inserção38 e cinco mutações do tipo missense 29, 39, 40, sendo todas em

homozigose ou heterozigose composta, caracterizando o padrão de herança

autossômica recessiva dessa condição.

Introdução

12