Estudo dos tipos e subtipos celulares predominantes e da expressão da enzima óxido nítrico sintase.. por Aline Carvalho Batista - Versão HTML

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Estudo dos tipos e subtipos celulares predominantes e

da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível

(iNOS) na Paracoccidioidomicose Bucal

Aline Carvalho Batista

Tese apresentada à Faculdade de

Odontologia de Bauru, da Universidade de

São Paulo, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Doutor em

Odontologia, área de Patologia Bucal.

(Edição Revisada)

BAURU

2004

Estudo dos tipos e subtipos celulares predominantes e

da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível

(iNOS) na Paracoccidioidomicose Bucal

Aline Carvalho Batista

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia

de Bauru, da Universidade de São Paulo, como

parte dos requisitos para obtenção do título de

Doutor em Odontologia, área de Patologia

Bucal.

(Edição Revisada)

Orientadora: Profa. Dra. Vanessa Soares Lara

BAURU

2004

ii

Aline Carvalho Batista

Nascimento

12 de setembro de 1975

1994 – 1997

Curso de Graduação em Odontologia pela Universidade do

Sagrado Coração – Bauru – S.P.

1998 – 1999

Curso de Extensão Universitária em Cirurgia e Traumatologia

Bucomaxilofacial na Universidade do Sagrado Coração – Bauru

– S.P.

2000

2001

Mestrado em Odontologia, Área de Patologia Bucal, na

Faculdade de Odontologia de Bauru – USP.

2002

Professora Assistente da Disciplina de Patologia Geral e Buco-

Dental da Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de

Goiás – Goiânia - GO.

2002 – 2004

Doutorado em Odontologia, Área de Patologia Bucal, na

Faculdade de Odontologia de Bauru – USP.

Associações

ABO-GO: Associação Brasileira de Odontologia de Goiás

SBP: Sociedade Brasileira de Patologia

iii

“É incrível a força que as coisas parecem ter quando

elas realmente precisam acontecer”

Chico Xavier

iv

TOCANDO EM FRENTE

Ando devagar porque já tive pressa

E levo esse sorriso porque já chorei demais

Hoje me sinto mais forte, mais feliz, quem sabe

Eu só levo a certeza de que muito pouco eu sei

E nada sei

Conhecer as manhas e as manhãs, o sabor das massas e das maçãs É preciso amor pra poder pulsar, é preciso paz pra poder sorrir É preciso chuva para florir

Penso que cumprir a vida seja simplesmente

Compreender a marcha e ir tocando em frente

Como um velho boiadeiro levando a boiada

Eu vou tocando os dias pela longa estrada eu vou

Estrada eu sou

Todo mundo ama um dia, todo mundo chora

Um dia a gente chega, no outro vai embora

Cada um de nós compõe a sua história

E cada ser em si carrega o dom de ser capaz

De ser feliz

Ando devagar porque já tive pressa

E levo esse sorriso porque já chorei demais

Cada um de nós compõe a sua história

E cada ser em si carrega o dom de ser capaz

De ser feliz

Almir Sater e Renato Teixeira

v

Dedico este trabalho aos meus Pais, Luiz Antônio e Maria Elvira, a meus Irmãos Micheline, Caroline e Luis Antônio e a toda a minha família Pelo amor incondicional, pelo exemplo de honestidade,

De luta e de caráter

vi

AGRADECIMENTOS PESSOAIS

À orientadora deste trabalho, Profa. Dra. Vanessa Soares Lara, agradeço a dedicação, paciência, confiança e a enorme contribuição à minha formação profissional. À amiga Vanessa Soares Lara, pelo companheirismo, incentivo e amizade verdadeira;

A todos que contribuíram direta ou indiretamente com o

desenvolvimento e finalização deste trabalho, com minha formação profissional e crescimento pessoal, dedico meus sinceros agradecimentos:

Aos Professores do Departamento de Estomatologia, Disciplina de Patologia Bucal: Prof. Dr. Alberto Consolaro, Prof. Dr. Luís Antônio de Assis Taveira e Profa. Dra. Denise Tostes Oliveira;

Aos Funcionários e ex-funcionários da Disciplina de Patologia Bucal: Fátima Aparecida Silveira, Maria Cristina Carrara Felipe, Bernadete Aparecida Alves Camargo, Valdir João Afonso e aos aprendizes Richarland Medeiros e Osiel Pereira Cabrera, pelo carinho, disponibilidade e eficiência com que sempre me auxiliaram; Ao Weliton Silva dos Santos, querido Cena, pelo carinho, apoio e cumplicidade;

As minhas amigas Juliane Guimarães de Carvalho e Camila Oliveira Rodini, pela ajuda e apoio “nunca” negados, pela generosidade, cumplicidade e preciosa amizade. Minha eterna gratidão.

À Tarcília Aparecida da Silva, pela sólida amizade, pelo incentivo e pelas importantes sugestões referente a este trabalho;

A todos os amigos que generosamente e com muito carinho me

acolheram em suas casas: Juliane Guimarães de Carvalho e Cleide Cristina Rodrigues Martinhon, Vinícius Carvalho Porto e Vanessa Soares Lara, Lidiane de vii

Castro Pinto, Cláudia Barbosa Quintella, Elaine Sbroggio de Oliveira Rodini e sua família, Luciana Reis Azevedo, Mariana Carvalho Mandim e demais amigos; Aos colegas do Curso de Doutorado em Patologia Bucal: Tânia Regina Grão Veloso, Andréa Reis da Costa, João Adolfo Costa Hanemann, Maria Fernanda Martins-Ortiz e Maria Renata Sales Nogueira Costa;

Ao Prof. Dr. José Roberto Pereira Lauris, pela colaboração na

realização da análise estatística;

À Profa. Dra. Ana Paula Campanelli, pelas valiosas sugestões, revisão do artigo referente a este trabalho e ricas discussões;

Ao Dr. Cleverson Teixeira Soares e Dr. Raul Negrão Fleury, pela colaboração na obtenção das amostras, pela participação no fornecimento dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD20, pelos ensinamentos e saudáveis discussões; Ao Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha pela sua contribuição no fornecimento dos anticorpos anti-IL-10;

Aos funcionários da Seção de Pós-graduação: Giane Tenório Quintela, Maria Margareth Pereira Mokarzel, Ana Letícia Palombo Momesso e ao aprendiz Jeferson Oliveira Melo, agradeço o carinho e ajuda;

Aos colegas de Disciplina e aos do Centro Goiano de Doenças da Boca (CGDB) da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás: Elismauro Francisco de Mendonça, Eneida Franco Vêncio, Maria Alves Garcia S. Silva, Rejane Faria Ribeiro-Rotta e demais professores, pelo apoio, incentivo e confiança; A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, aos da Disciplina de Patologia e do Centro Goiano de Doenças da Boca (CGDB);

Aos Patologistas do Hospital Araújo Jorge de Goiânia: Dra. Rita de Cássia Alencar; Dr. João Alves de Araújo Filho, Dr. Ailton Cabral Fraga Jr.; Dra.

viii

Eliane Duarte Mota; Dr. Élbio Cândido de Paula e Dra. Glória Jabour B. Oton, pela acolhida e ajuda;

Aos amigos de Goiânia que sempre estão enviando mensagens de

apoio e incentivo: Cristiane Teodoro Moraes, Elismauro Francisco de Mendonça, Rejane Faria Ribeiro-Rotta e Ana Helena G. de Alencar.

ix

AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP);

Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES);

À Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, na pessoa de sua excelentíssima Diretora, Profa. Dra. Maria Fidela de Lima Navarro; À Comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de

Bauru, na pessoa do Presidente, Prof. Dr. José Carlos Pereira; Ao Departamento de Estomatologia da Faculdade de Odontologia de Bauru, na pessoa do Chefe Prof. Dr. Alberto Consolaro;

À Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Goiás, na

pessoa de seu excelentíssimo Diretor Prof. Dr. Gersinei Carlos de Freitas; Ao Departamento de Ciências Estomatológicas da Faculdade de

Odontologia da Universidade Federal de Goiás, na pessoa do Chefe Prof. Dr. Carlos Estrela;

x

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xiii RESUMO............................................................................................................ xv 1

INTRODUÇÃO E SÍNTESE BIBLIOGRÁFICA....................................... 1

1.1 O

fungo

Paracoccidioides brasiliensis.................................................... 1

1.2

A Paracoccidioidomicose infecção e doença.......................................... 2

1.3

Os tipos celulares envolvidos na Paracoccidioidomicose....................... 3

1.4 O papel da resposta imunológica e de seus mediadores na

patogênese da Paracoccidioidomicose.................................................. 7

1.5

O óxido nítrico na resposta imune das doenças infecciosas.................. 11

1.6

Fenômenos imunopatológicos na Paracoccidioidomicose bucal............ 13

2 PROPOSIÇÃO........................................................................................

15

3 MATERIAL

E

MÉTODOS.......................................................................

16

3.1

Obtenção, seleção e caracterização da amostragem............................. 16

3.2 Técnicas

empregadas.............................................................................

17

3.2.1 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina) e Coloração pelo método de Grocott............................................................................................... 17

3.2.2 Técnica

imuno-histoquímica................................................................... 17

3.3 Análise

dos

resultados............................................................................

19

3.3.1 Análise subjetiva geral............................................................................ 19

3.3.2 Análise subjetiva e quantitativa do fungo Paracoccidioides brasiliensis............................................................................................. 20

3.3.3 Análise quantitativa das células inflamatórias e das células CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e triptase de mastócito-positivas............... 20

3.3.4 Análise quantitativa e qualitativa da expressão de iNOS....................... 21

4 RESULTADOS........................................................................................

23

4.1

Caracterização clínica da amostragem................................................... 23

4.2

Caracterização microscópica dos espécimes selecionados................... 24

4.3

Caracterização numérica dos fungos..................................................... 25

4.4

Estudo quantitativo das células inflamatórias e das células CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e triptase de mastócito-positivas................ 28

4.5

Estudo quantitativo e qualitativo das células iNOS+............................... 41

5 DISCUSSÃO...........................................................................................

51

6 CONCLUSÕES.......................................................................................

61

ANEXOS............................................................................................................. 64

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 74

ABSTRACT........................................................................................................ 90

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

Ag Antígeno

APCs

Antigen-Presenting Cells (Células Apresentadoras de Antígeno) BSA

Bovine Serum Albumine (Soro-Albumina Bovina)

CD

Cluster of Differentiation

CGMN

Células Gigantes Multinucleadas

CTLA-4

Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 (Antígeno 4 de Linfócito T Citotóxico) d.p. Desvio

padrão

Fas-FasL Fas-Fas Ligand (Fas- Ligante Fas)

GM-CSF Granulocyte-Monocyte Colony-Stimulating Factor (Fator Estimulador de Colônia de monócitos e granulócitos)

HE

Hematoxilina e Eosina

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

IFN Interferon

iNOS

Inducible Nitric Oxide Synthase (Óxido nítrico sintase induzível) IP-10

Interferon-gamma induced protein 10 (Proteína induzida por interferon gamma)

KC

Cytokine-induced neutrophil chemoattractant (Quimioatraente para neutrófilos induzido por citocina)

IL-2R

Interleucin 2 Receptor (Receptor de interleucina 2)

MHC

Major Histocompatibility Complex (Complexo Maior de

Histocompatibilidade)

MIP

Macrophage Inflammatory Protein (Proteína Inflamatória de Macrófago) NK

Natural Killer (Células Assassinas)

MN Mononucleares

NO

Nitric Oxide (Óxido nítrico)

P Probabilidade

Pb

Paracoccidioides brasiliensis

PBS

Phosphate Buffered Saline (Tampão salina fosfato)

PMN Polimorfonucleares

RANTES Regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (Quimiocina expressa e secretada por células T normais e regulada após ativação)

xiii

TGF

Transforming Growth Factor (Fator Transformador do Crescimento) Th T

helper (Linfócito T auxiliar)

TNF

Tumor Necrosis Factor (Fator de Necrose Tumoral)

Tr1 T

regulatory 1 (T regulatória 1)

Treg T

regulatory (T regulatória)

xiv

RESUMO

A Paracoccidioidomicose é uma doença granulomatosa crônica que induz uma resposta inflamatória e imune específica. A participação do óxido nítrico (NO), produto da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), como uma importante molécula fungicida contra o fungo Paracoccidioides brasiliensis tem sido demonstrada. Com o objetivo de melhor caracterizar as lesões bucais da Paracoccidioidomicose e esclarecer a dinâmica da resposta imune neste sítio inflamatório, propusemo-nos a identificar e quantificar as células iNOS+, CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e mastócitos em 20 amostras de Paracoccidioidomicose bucal (forma crônica) e 8

amostras de mucosa bucal clinicamente saudável (Controle) utilizando a técnica de imuno-histoquímica, por meio da imunoperoxidase. O número de fungos viáveis foi verificado em todas as amostras de Paracoccidioidomicose, e estas foram distribuídas em cinco grupos: 1 (1-50 fungos por mm2), 2 (51-100 fungos por mm2), 3 (101-200

fungos por mm2), 4 (201-400 fungos por mm2) e 5 (401-800 fungos por mm2). Nossos resultados demonstraram leve imunomarcação para iNOS em todos os aglomerados de células epitelióides e células gigantes multinucleadas (CGMN), bem como forte imunomarcação em escassas células mononucleares (MN) localizadas na periferia dos granulomas. Não foi observado significante aumento na proporção de células MN

e CGMN iNOS+ nos grupos de Paracoccidioidomicose bucal quando comparados individualmente com o grupo Controle. Nossos resultados também demonstraram que, embora em baixo número, os polimorfonucleares neutrófilos (PMN) presentes nos granulomas e microabscessos são fortemente iNOS+. Adicionalmente, nosso estudo revelou similaridade no número de células CD4+ quando se considerava os grupos de amostras de Paracoccidioidomicose bucal com elevado número de fungos (grupos 4 e 5) e o grupo Controle. Nossos achados sugerem que a baixa expressão de iNOS por macrófagos e CGMN na Paracoccidioidomicose bucal e o pouco número de células CD4+ nas lesões com elevado número de fungos podem representar uma falha da ativação do sistema imune local, o que permitiu a multiplicação e disseminação do fungo e manutenção das lesões bucais ativas.

xv

Introdução e Síntese Bibliográfica 1

1 INTRODUÇÃO e SÍNTESE BIBLIOGRÁFICA

A Paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb), com alta incidência no Brasil5, 54, 124. Acomete principalmente os trabalhadores rurais do sexo masculino, na faixa etária entre 25 e 67 anos5, 18, 54, 124, 125.

1.1 O fungo Paracoccidioides brasiliensis

O Pb é um fungo dimórfico que se propaga como levedura na

temperatura corporal ou como micélio em baixas temperaturas. A forma miceliana e principalmente os conídios podem ser encontrados no solo, água ou plantas na temperatura ambiente e, provavelmente, são as formas infectantes116, 119. A parede celular do Pb é constituída por lipídeos, polissacarídeos e proteínas, que estão presentes em proporções variáveis na dependência da virulência da cepa116. Neste contexto, tem sido demonstrado in vitro que a magnitude da atividade antifúngica fagocitária varia de acordo com o fungo isolado36, 68.

Os fatores que determinam o grau de virulência do Pb ainda não estão completamente estabelecidos, todavia foi demonstrada uma relação entre a maior virulência e a maior quantidade de um polissacarídeo, estruturado na forma α-1,3-glucana116. Entretanto, uma glicoproteína de 43kDa (gp43) parece atuar como fator dominante de virulência do Pb, a qual induz a produção de anticorpos em pacientes portadores da doença e apresenta atividade proteolítica sobre o colágeno e elastina16, 20, 87. Em adição, tem sido detectada a produção de enzimas proteolíticas em sobrenadante de cultura de Pb, que tem sido relacionada com a instalação e posterior disseminação do fungo no hospedeiro108. Em contrapartida, foi demonstrado que DNA

Introdução e Síntese Bibliográfica 2

do Paracoccidioides brasiliensis apresenta um eficiente papel protetor em camundongos susceptíveis, e que esta proteção é mediada pela produção de IFN-γ123.

A infecção do fungo no hospedeiro ocorre pela inalação de conídios ou fragmentos micelianos, que ganham as vias aéreas e chegam até bronquíolos terminais e alvéolos pulmonares. Nesse local, possivelmente ocorre a transformação do fungo para a forma de levedura, instalando-se a infecção25. Outra via de infecção, ainda motivo de controvérsias, seria a contaminação, em geral traumática, da pele ou mucosa111.

No organismo, o Pb pode ser imediatamente eliminado por células do sistema imunológico ou então, persistir, multiplicar e disseminar por via linfática ou hematogênica para pele e mucosas, bem como para outros órgãos como linfonodos, supra-renal, baço, fígado, intestino, ossos e sistema nervoso4, 25.

1.2 A Paracoccidioidomicose infecção e doença

Após a infecção, não existem sinais ou sintomas imediatos da doença, todavia o hospedeiro desenvolve uma resposta imunológica específica contra antígenos do Pb que pode ser detectada em testes cutâneos de hipersensibilidade tardia, o que caracteriza a Paracoccidioidomicose infecção53, 101. Em áreas endêmicas, tem sido relatado que uma alta proporção de indivíduos assintomáticos pode apresentar testes cutâneos e/ou sorológicos positivos, ou seja, apresenta Paracoccidioidomicose subclínica26, 101, 109.

A evolução e as conseqüências da infecção irão depender da interação de fatores relacionados ao fungo, como virulência e composição antigênica, e ao hospedeiro, como características genéticas e estado imunitário25, 106, 116.

Introdução e Síntese Bibliográfica 3

A Paracoccidioidomicose doença apresenta duas formas clínicas, a forma aguda ou juvenil e a forma crônica ou adulta, as quais são classificadas de acordo com sua história natural e condições clínicas do paciente4, 25, 53. A forma aguda afeta jovens de ambos os sexos, progride rapidamente com disseminação linfática e hematogênica do fungo e geralmente envolve baço, fígado, linfonodos e medula óssea4, 53. Nesta forma clínica da doença, as lesões nas mucosas são pouco freqüentes e o acometimento pulmonar é raro54. A forma crônica é a mais freqüente, progride lentamente, afeta principalmente indivíduos adultos do sexo masculino com mais de 30 anos de idade e, na maior parte dos casos, tem início nos pulmões. Pode permanecer localizada (forma unifocal) ou sofrer disseminação para outros órgãos ou sistemas (forma multifocal) com comprometimento da boca e orofaringe4, 25, 53, 54.

Na boca, a principal região afetada é a gengiva ou mucosa do processo alveolar; em seguida mucosa do palato e lábios5, 18, 124, 125. A orofaringe, língua e soalho são regiões afetadas pela Paracoccidioidomicose principalmente quando os pacientes apresentam lesões múltiplas5, 124. Estudos epidemiológicos relatam que a Paracoccidioidomicose bucal predomina em homens em relação às mulheres com uma proporção de 3:1, e freqüentemente brancos; a média de idade é de 40 anos e há predomínio da forma crônica da doença5, 18, 124.

1.3 Os tipos celulares envolvidos na Paracoccidioidomicose

O Pb induz uma reação inflamatória granulomatosa com predomínio de fagócitos mononucleares e suas células derivadas, células epitelióides e células gigantes multinucleadas (CGMN), além de linfócitos, plasmócitos, eosinófilos e neutrófilos4, 31, 99. Em estudo experimental, utilizando ratos infectados pelo Pb, observou-se um predomínio de neutrófilos e macrófagos, e os fungos estavam

Introdução e Síntese Bibliográfica 4

associados a estas células, no interior de macrófagos e presentes na matriz extracelular32.

Indiscutivelmente, na Paracoccidioidomicose, os macrófagos estão em maior número4, 99 e representam, diretamente, a principal célula de defesa contra o fungo Paracoccidioides brasiliensis 29, 57. Sua adequada ativação é fundamental para a morte do fungo e efetiva apresentação antigênica6, 28-30, 94. Recentemente, tem sido demonstrado que macrófagos provenientes do lavado broncoalveolar de pacientes com Paracoccidioidomicose se encontravam ativados in vivo, apresentando atividade fungicida e produção de peróxido de hidrogênio. Todavia, neste estudo, verificou-se que a eficácia da atividade fungicida destes macrófagos contra o Pb in vitro depende da ativação destas células por TNF-α e IFN-γ37.

Com relação aos linfócitos, MOSCARDI-BACCHI et al.93, em 1989, demonstraram que, no granuloma paracoccidióidico, os linfócitos T (CD3+) localizam-se na periferia dos granulomas e alguns poucos permeiam os aglomerados de macrófagos e suas células derivadas. Estes autores verificaram que a maioria dos linfócitos T expressa o fenótipo auxiliar (CD4+) com poucas células supressoras/citotóxicas (CD8+). No entanto, considerando as populações de linfócitos sangüíneos de pacientes com Paracoccidioidomicose, BAVA et al.13, em 1991, revelaram uma deficiência de linfócitos CD4+ e de linfócitos CD8+, e índices normais de linfócitos B. Neste contexto, também utilizando amostras sangüíneas de pacientes com Paracoccidioidomicose na forma aguda e crônica, MOTA et al.95, 96, em 1985 e 1988, constataram uma supressão de linfócitos T CD4+ em ambas as formas da doença, enquanto que os pacientes com a forma aguda apresentaram um alto índice de linfócitos T CD8+ e de linfócitos B (CD19+). Em contraste, CANO et al.40, em 1995, demonstraram que a depleção de linfócitos T CD8+, na Paracoccidioidomicose

Introdução e Síntese Bibliográfica 5

murina, induziu doença mais grave e/ou disseminada em animais resistentes e susceptíveis.

Em lesões bucais da Paracoccidioidomicose (forma crônica),

ALCÂNTARA4, em 2002, demonstrou que lesões granulomatosas, bem ou mal organizadas, eram compostas predominantemente por células epitelióides; entre as células acessórias, observaram a presença de neutrófilos, eosinófilos, plasmócitos, linfócitos B (CD20+), linfócitos T (CD3+), linfócitos T citotóxicos/supressores (CD8+) e células natural killer (NK), localizadas predominantemente no halo perigranuloma.

Considerando a população linfocitária, estes autores constataram predominância dos linfócitos T CD3+, seguidos pelos linfócitos T CD8+, pelas células NK e linfócitos CD20+ (representando, respectivamente, 62.0%, 33.2%, 12.0% e 5.4% da população linfocitária). Em adição, NEWORAL et al.99, em 2003, também demonstraram um predomínio de macrófagos, células epitelióides e CGMN CD68+, todavia observaram porcentagens similares entre ambas as populações de linfócitos CD8+ e CD4+ em todos os espécimes examinados de Paracoccidioidomicose bucal (forma adulta/crônica).

Apesar da imunidade mediada por células ser a principal responsável pela resistência ao Pb, estudos têm demonstrado que os polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) podem desempenhar um importante papel no controle da infecção pelo Pb67, 68, 80, 81. PMNs de camundongos susceptíveis a este fungo apresentam baixa atividade fungicida, em contraste aos camundongos resistentes85. Experimentos in vitro demonstram que o IFN-γ, o fator estimulador de colônia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF) e a IL-1β aumentam a atividade fungicida dos PMNs ao Pb, reforçando o papel destas células na resposta de defesa contra a infecção69.

Assim como os PMNs, há evidências de que as células NK participam da imunidade inata contra o Pb60, 104. JIMENEZ e MURPHY60, em 1984, relataram que

Introdução e Síntese Bibliográfica 6

células NK murinas eram capazes de limitar o crescimento in vitro do Pb. Em adição, PERAÇOLI et al.104, em 1991, observaram um número aumentado de células NK

(CD16) circulantes e diminuição de sua atividade citotóxica em pacientes com as formas aguda e crônica da Paracoccidioidomicose e, em 1995105, utilizando modelo experimental, verificaram importante atividade citotóxica destas células nos períodos iniciais da infecção e diminuição desta atividade nos períodos finais, sugerindo um papel defensivo dessas células contra o fungo nas fases precoces da infecção106.

Todavia, MOTA et al.96, em 1988, estudando as subpopulações de células mononucleares do sangue periférico de pacientes com as formas aguda e crônica da Paracoccidioidomicose e de indivíduos saudáveis, verificaram um aumento quantitativo de células NK (CD11b) em ambas as formas clínicas da doença.

Outras células inflamatórias podem estar presentes no sítio inflamatório das lesões bucais da Paracoccidioidomicose e podem contribuir com eventos imunorregulatórios, entre estas células destacamos os mastócitos. Os mastócitos são células residentes do tecido conjuntivo que aumentam numericamente em processos inflamatórios crônicos da cavidade bucal12, 110. Apesar de nunca antes demonstradas a presença e a possível participação dos mastócitos na Paracoccidioidomicose, estas células desempenham papel significativo nas reações de hipersensibilidade e em fenômenos inflamatórios e imunorregulatórios88. A migração de células T para locais de inflamação, assim como a ativação destas células, são reguladas por citocinas, mediadores e interações célula-célula. Nesse contexto, os mastócitos podem ser importantes tanto pelo contato direto célula-célula quanto pela liberação de mediadores e citocinas82, 134. Estudos recentes em ratos têm demonstrado que os mastócitos são capazes de estimular a proliferação de células T e a produção de IFN-

γ por estas células, tanto in vitro quanto in vivo 120, 130, 132.

Introdução e Síntese Bibliográfica 7

Está bem estabelecido que o Pb induz a formação de granulomas que se desenvolvem sob o controle imunológico e podem ser denominados de granulomas de hipersensibilidade ou imunes27, 79. O granuloma paracoccidióidico é também considerado, com relação à cinética dos fagócitos mononucleares que o constituem, como granuloma de alta renovação celular, significando a alta e constante morte e substituição dos macrófagos27.

A estruturação da reação granulomatosa na Paracoccidioidomicose parece apresentar dois padrões. Na Paracoccidioidomicose menos severa, demonstra-se imunidade celular preservada e a formação de granulomas organizados, compactos e associados com um menor número de fungos. Em contraste, na forma severa e aguda da doença, observam-se comprometimento imunológico e a formação de granulomas desorganizados com grande quantidade de fungos16, 25, 27, 35, 95. Em concordância, camundongos geneticamente deficientes de IFN-γ ou do receptor de TNF-α, infectados pelo Paracoccidioides brasiliensis, apresentam uma elevada quantidade de leveduras comparativamente aos animais controle e apresentam um infiltrado inflamatório, com ausência de granulomas ou com incipientes formações granulomatosas, composto por escassas células mononucleares, epitelióides e células gigantes multinucleadas121.

1.4 O papel da resposta imunológica e de seus mediadores na patogênese da Paracoccidioidomicose

Vários estudos têm sido realizados na tentativa de elucidar o

mecanismo de imunidade na Paracoccidioidomicose e, conseqüentemente, as possíveis causas da disseminação do Pb para outros órgãos e tecidos. Com estes objetivos, alguns investigadores têm verificado que pacientes com lesões da

Introdução e Síntese Bibliográfica 8

Paracoccidioidomicose possuem uma falha na resposta imune celular, sugerindo que este seria o principal mecanismo de defesa contra o fungo Pb, em detrimento da resposta imune humoral6, 8, 16, 17, 32, 41, 42, 61, 86, 95, 101, 109, 112, 121.

Na resposta imune celular, as células T helper (CD4+) tipo 1 (Th1) sintetizam interleucina 2 (IL-2), interferon gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral beta (TNF-β) que agem na ativação de células T citotóxicas (CD8+), células NK e macrófagos (CD68+) que, por sua vez, através de um mecanismo de feed-back positivo, estimulam a proliferação e diferenciação de células Th11. Por outro lado, na resposta imune humoral, as células T helper (CD4+) tipo 2 (Th2) sintetizam IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 que atuam na supressão da ativação de macrófagos, estimulam a proliferação de linfócitos B (CD20+) e de células Th2, a diferenciação de plasmócitos (CD20+) e a produção de imunoglobulinas (principalmente IgG e IgE)1.

Em adição, vários estudos têm demonstrado um terceiro subtipo de célula T (CD4+) denominada de T regulatória (Treg) ou supressora, identificada como CD4+CD25+ por expressar altos níveis do receptor da IL-2 (CD25). As Treg inibem a ativação e proliferação de células T através do contato direto com as células apresentadoras de antígeno (APCs) e com outras células T, e através da secreção de altos níveis de citocinas imunossupressoras tais como o fator transformador do crescimento beta (TGF-β) (célula T helper 3-Th3) e IL-10 (célula T regulatória 1-Tr1)2, 10, 21, 115, 117.

Em uma variedade de doenças infecciosas, o padrão de resposta Th1

está relacionado à proteção e o Th2 à susceptibilidade64. Na Leishmaniose induzida experimentalmente em camundongos, o IFN-γ promove ativação de macrófagos e conseqüentemente destruição do parasita73, 75. Quando os animais são tratados com anticorpos anti-IFN-γ, ocorre aumento da produção de IL-4, predomínio de anticorpos e baixa ativação de macrófagos, resultando em infecção disseminada75.

Introdução e Síntese Bibliográfica 9

Estudos experimentais utilizando camundongos atímicos revelam que tais animais não controlam a disseminação do Pb, fortalecendo assim a hipótese de que a imunidade mediada por células é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra a infecção por este fungo, como ocorre com outras doenças infecciosas32, 89. Em adição, outro estudo revela que camundongos resistentes à infecção pelo Pb possuem uma resposta imune com predominância de células T

helper tipo 1 (Th1), com elevada secreção de IFN-γ e IL-2, e a susceptibilidade está associada com baixos níveis destas citocinas41, 62. CALICH & KASHINO35 em 1998

sugeriram que, no modelo experimental murino da Paracoccidioidomicose, a resistência à infecção está associada à produção inicial de altos níveis de TNF-α e IFN-γ acompanhada de secreção persistente de IL-2 e IFN-γ, enquanto que susceptibilidade, levando à doença progressiva, caracteriza-se por secreção inicial de baixos níveis de TNF-α e IFN-γ seguida da produção de IL-5, IL-10 e TGF-β. Desta maneira, a ativação celular com antígenos do Pb resulta na liberação de citocinas específicas, as quais desempenham um papel fundamental na modulação da resposta celular, com conseqüente regulação da replicação do fungo e controle de sua disseminação35, 41, 62, 121, 122.

Outros estudos também têm demonstrado que tanto o padrão Th1

como o Th2 parecem estar envolvidos na formação e modulação da resposta granulomatosa da Paracoccidioidomicose39, 107. A mistura de citocinas, de ambos os padrões de resposta, foi também observada por CAMPANELLI39, em 1998, em modelo experimental da Paracoccidioidomicose, todavia demonstrou-se predomínio da expressão de IFN-γ na fase inicial e de IL-4 na fase tardia da infecção.

Recentemente, PERAÇOLI et al.107, 2003, verificaram que monócitos do sangue periférico de pacientes portadores da Paracoccidioidomicose, na sua forma ativa, produzem altos níveis tanto de citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8) como

Introdução e Síntese Bibliográfica 10

anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β), em relação a monócitos de indivíduos saudáveis.

Sendo assim, o predomínio de uma ou outra citocina no sítio da infecção pode determinar a instalação e a evolução da doença.

Adicionalmente, tem sido demonstrado que animais geneticamente deficientes de IFN-γ (GOK), infectados pelo Pb, apresentam baixa expressão das quimiocinas IP-10, Mig e RANTES, responsáveis pelo recrutamento de linfócitos Th1

e macrófagos122. Assim, o padrão de resposta Th1/Th2 ou a

resistência/susceptibilidade ao Pb podem estar associados à modulação de quimiocinas no sítio inflamatório das lesões122.

Na Paracoccidioidomicose, em humanos, tem sido confirmada esta importante relação entre supressão da resposta imune celular e a presença de lesões da Paracoccidioidomicose16, 61, 95. Alguns autores observaram o predomínio da resposta imune Th2 sobre a resposta Th117, 78, 101, com produção de IL-4, IL-10 e IL-5

e elevados níveis de IgG4, IgA e IgE em pacientes com Paracoccidioidomicose17, 78, 101. Estes mediadores associados a baixos níveis de IFN-γ foram correlacionados com a mais severa forma da doença101. Tem sido demonstrado que, na Paracoccidioidomicose, os pacientes não apresentam deficiência na produção de anticorpos, observando-se alta produção destes principalmente nas formas mais severa da doença78, 95. Em contraste, indivíduos saudáveis que vivem em áreas endêmicas, com positividade para o teste cutâneo da paracoccidiodina, demonstram típico padrão Th1, com altos níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-2, e baixos níveis de IL-4, IL-5 e IL-10101. Provavelmente, estes indivíduos desenvolveram uma resposta imunológica eficiente capaz de prevenir o início e a disseminação da doença.

Em adição, tem sido evidenciada a presença de alta expressão de citocinas immunossupressoras (IL-10 e TGF-β) pelas células de linfonodos de pacientes portadores da forma mais severa, ou seja, Paracoccidioidomicose juvenil99,

Introdução e Síntese Bibliográfica 11

bem como por células mononucleares do sangue periférico de pacientes com a forma juvenil e crônica17, 38, 101, 107. Ainda, foram relatados altos níveis de IL-10 no soro de pacientes com a forma crônica/adulta da doença51. Adicionalmente, tem sido descrita a produção de expressivos níveis de IL-10 e TGF-β, por linfócitos e macrófagos respectivamente, de camundongos susceptíveis ao Pb35.

1.5 O óxido nítrico na resposta imune das doenças infecciosas Uma efetiva resposta mediada por células T e conseqüente eliminação do fungo Paracoccidioides brasiliensis depende do macrófago e de sua adequada ativação17, 29, 30, 57, 58, 61, 74. Recentes publicações têm sugerido que IFN-γ e TNF-α

controlam a infecção e replicação do Pb por estimular a formação de granuloma e produção de óxido nítrico (NO) pelos macrófagos22, 57, 98, 121. O NO constitui um radical livre sintetizado na presença de O2 a partir do aminoácido L-arginina, que é convertido em L-citrulina e NO por um grupo de isoenzimas, coletivamente chamadas de NO

sintases (NOS). As NOS existem como três isoformas diferentes, denominadas NOS

endotelial (eNOS), NOS neuronal (bNOS) e NOS induzível (iNOS)92. O NO é produzido, por células inflamatórias, em resposta a estímulos como os Lipopolissacarídeos (LPS), fragmentos antigênicos de fungos como o Pb e citocinas inflamatórias e/ou imunorreguladoras como IL-1, TNF-α, TNF-β, IFN-γ43, 47, 57-59, 74, 91. O

NO pode reagir com moléculas de oxigênio ou com outras biomoléculas, originando compostos citotóxicos como o peroxinitrito (ONOO-), o qual tem sido considerado mais tóxico do que seu precursor NO66.

A síntese de NO tem sido observada em macrófagos72, 74 e células gigantes multinucleadas99 bem como em outras células como neutrófilos11, 50, 128, linfócitos T helper 129, fibroblastos63, células epiteliais7, osteoclastos, osteoblastos52, condrócitos19, células de Langerhans114, células endoteliais70, 113, eosinófilos100 e em

Introdução e Síntese Bibliográfica 12

mastócitos65, podendo ter vários efeitos dependendo do tipo de célula que produz, do sítio de liberação e da concentração produzida91, 92. Até o presente momento, frente à indução por componentes antigênicos do Pb, foi observada a expressão de iNOS/NO

em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com a doença47, 83, em macrófagos murinos57, 98 e em macrófagos humanos99. Adicionalmente, tem sido evidenciada intensa expressão de iNOS em células epitelióides e células gigantes multinucleadas de granulomas causados por Mycobacterium tuberculosis, Cryptococcus neoformans e Leishmania 49.

O NO apresenta importante função na resposta de defesa, podendo atuar como molécula citotóxica frente a fungos, bactérias, protozoários, bem como células tumorais e células próximas do sítio de produção91. Na Paracoccidioidomicose humana e experimental, o NO parece inibir a transformação do Pb na forma de conídios para levedura, todavia uma imunossupressão secundária tem sido descrita22, 57, 98. A iNOS, responsável pela síntese de NO, é expressa durante ativação de macrófagos por TNF-α e IFN-γ55-57, 74, 76, 90, 97, 103. Em contrapartida, as citocinas IL-10, IL-4 e TGF-β inibem a expressão de iNOS e conseqüente produção de NO por macrófagos in vitro 44, 55, 56, 90, 97, 103.

Estudos in vitro têm demonstrado uma direta correlação entre produção de NO e a atividade microbicida dos macrófagos na presença de microorganismos intracelulares tais como Leishmania major, Mycobacterium bovis e Trypanosoma cruzi 9, 56, 58. Na Paracoccidioidomicose, a função do NO ainda não está esclarecida, podendo estar envolvida tanto em fenômenos benéficos como com a morte do fungo23, 57 e ainda em fenômenos de supressão da resposta imune celular22, 98, 121.

O NO apresenta importante papel imunorregulador, sendo produzido pelas e atuando sobre as principais células do sistema imune como macrófagos e linfócitos T121, 129, 133. A produção de NO por células T helper e sua participação na

Introdução e Síntese Bibliográfica 13

modulação da resposta imune celular permanecem controvertidas. Estudo in vitro demonstrou produção de NO por células Th1, mas não por células Th2; além disso, o NO inibiu a secreção de IL-2 e IFN-γ por células Th1 e não causou nenhum efeito na produção de IL-4 por células Th2129. De acordo com TAYLOR-ROBINSON et al.129

(1994), o NO produzido por células Th1 participa de um mecanismo de feed-back negativo inibindo a produção de IL-2 e IFN-γ, prevenindo, assim, a proliferação de células Th1, de células CD8+ e de macrófagos; adicionalmente, as células Th2

proliferam na presença da citocina IL-4, cuja produção não foi afetada por NO. De acordo com estes achados, as células Th1 e Th2 podem ser distinguidas por diferentes padrões de citocinas produzidas e diferente susceptibilidade ao NO.

O NO também contribui para a supressão da resposta imune graças à inibição da expressão pelos macrófagos de molécula classe II do complexo maior de histocompatibilidade (MHC), prejudicando a apresentação antigênica23, 118.

1.6 Fenômenos imunopatológicos na Paracoccidioidomicose Bucal Poucos trabalhos publicados têm avaliado os sítios inflamatórios das lesões disseminadas da Paracoccidioidomicose, tal como a mucosa bucal. Em 1989, MOSCARDI-BACCHI et al.93 avaliaram os subtipos de linfócitos T em seis lesões bucais da Paracoccidioidomicose, demonstrando que a maioria dos linfócitos T

expressa o fenótipo auxiliar com poucas células supressoras/citotóxicas. Em contrapartida, estes autores demonstraram um alto número de células supressoras e um baixo número de células T helper no sangue destes pacientes com Paracoccidioidomicose bucal. Sendo assim, discutiu-se neste estudo que o infiltrado inflamatório da lesão pode não refletir o subtipo celular sangüíneo ou periférico.

Introdução e Síntese Bibliográfica 14

Recentemente, NEWORAL et al.99, 2003, avaliaram a presença e

localização de TNF-α, TGF-β, IL-10 e iNOS em oito amostras da forma crônica da Paracoccidiodomicose bucal, e em linfonodos de pacientes com a forma aguda da doença. Neste estudo, os autores observaram uma pequena expressão de TNF-α e iNOS em ambos os grupos estudados, e uma alta expressão de TGF-β e IL-10 nas amostras de linfonodos. Neste contexto, os autores sugerem que a alta expressão de citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β, pode contribuir para a mais severa forma da doença. Adicionalmente, a baixa expressão de iNOS, importante fungicida, pode ter contribuído para a replicação e disseminação do fungo em ambas as formas da doença.

Em função dos escassos trabalhos, parece-nos de extrema importância uma caracterização mais precisa dos tipos e subtipos celulares que predominam nas lesões disseminadas bucais de Paracoccidioidomicose, priorizando uma análise quantitativa e comparativa com o tecido bucal normal. No presente estudo, analisamos vinte amostras, enfocando a marcação macrofágica, de mastócitos, de subtipos linfocíticos, ativados ou não, bem como a expressão de iNOS e a relação com a quantidade de fungos nas amostras, ainda não demonstrado na literatura tratando-se especificamente de lesões bucais.

Proposição 15

2 PROPOSIÇÃO

No presente estudo, objetivamos identificar e quantificar a presença de linfócitos T (CD3+), de linfócitos T citotóxicos (CD8+), de linfócitos T auxiliares/ helper (CD4+), de linfócitos T ativados (CD45RO+), de linfócitos B (CD20+), de macrófagos (CD68+), de mastócitos (células positivas à triptase de mastócito), e de células iNOS+

em lesões bucais da Paracoccidioidomicose, por meio de imuno-histoquímica. Em adição, objetivamos correlacionar a quantidade de fungos, com a expressão da iNOS

e o número dos tipos e subtipos celulares descritos acima.

Material e Métodos 16

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Obtenção, seleção e caracterização da amostragem

O material utilizado para este estudo foi selecionado dos arquivos do laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Estomatologia -Área de Patologia- da Faculdade de Odontologia de Bauru, da Universidade de São Paulo e dos arquivos do Instituto de Anatomia Patológica de Bauru (ANATOM), correspondente aos serviços de anatomia-patológica dos Hospitais de Base, Beneficência Portuguesa e Unimed. Foi selecionado o maior número possível de amostras de Paracoccidioidomicose bucal; desta seleção foram considerados apenas os casos com o diagnóstico clínico da forma crônica/adulta da doença. Utilizaram-se como controle amostras de mucosa bucal clinicamente saudável, as quais foram também selecionadas dos arquivos dos Serviços descritos acima e eram geralmente provenientes de plastia gengival após exodontia de terceiros molares ou pré-molares por indicação ortodôntica ou ainda de mucosa bucal livre de uma patologia associada (margens cirúrgicas). Os espécimes correspondentes estão incluídos em blocos de parafina. Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Faculdade de Odontologia de Bauru-USP (Anexo 1).

Apenas foram consideradas as amostras referentes a biópsias iniciais, realizadas para fins diagnósticos e, desta forma, antes do início de qualquer tratamento. Assim, foram excluídos os casos que já haviam iniciado algum tipo de tratamento e aqueles com história de imunossupressão.

Foram colhidas e/ou confirmadas, através dos prontuários ou a partir dos profissionais responsáveis, todas as informações necessárias para a caracterização clínica dos casos de Paracoccidioidomicose bucal selecionados, como idade, gênero, raça, tempo de evolução da doença, comprometimento pulmonar, presença de lesões em outros órgãos e localização das lesões bucais.

Material e Métodos 17

3.2 Técnicas Empregadas

3.2.1 Técnica de Rotina (Hematoxilina e Eosina) e Coloração pelo método de Grocott

O material selecionado incluído em parafina foi seccionado em

micrótomo (Leica RM2165), obtendo-se de cada bloco cortes consecutivos de 5µm, que foram colocados sobre lâminas histológicas e corados pelos métodos da Hematoxilina-Eosina (HE) e de Grocott.

3.2.2 Técnica Imuno-histoquímica

Ao obter os cortes seriados, descritos anteriormente, alguns foram seccionados em 3µm e estendidos sobre lâminas de vidro silanizadas (DAKO, S3003, Glostrup-Denmark) e submetidos à técnica imuno-histoquímica por meio de Imunoperoxidase (streptavidina) para a identificação das moléculas CD45RO, CD3, CD8, CD20, CD68, iNOS e triptase de mastócito-positivas. Inicialmente, os cortes sobre as lâminas foram desparafinizados e hidratados por meio de: 1- xilol, 3 vezes, 5

minutos cada vez; 2- álcool absoluto, 3 vezes, 5 minutos cada vez; 3- álcool etílico 95% 1 vez, 2 minutos; 4- solução salina tamponada (PBS), Ph=7.2- 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas em peróxido de hidrogênio (Merck) a 3% em PBS, por 40 minutos, para o bloqueio da peroxidase endógena. Após lavagens (no mínimo 3) com PBS, as lâminas foram mergulhadas em tampão citrato, pH=6.0

(SIGMA, P4809, Saint Louis – USA) aquecido a uma temperatura de 95oC, com auxílio de Steammer Cuisine 700 HL-SPEED (T-FAL), para exposição dos seguintes antígenos: CD45RO, CD3, CD8, CD68 e iNOS, por 20 minutos. A exposição antigênica da proteína CD20 foi realizada utilizando Tripsina a 5% em PBS.

Baseando-se em experiência prévia, não foi realizada exposição antigênica da triptase de mastócito.

Material e Métodos 18

Após serem lavadas com PBS, as lâminas foram incubadas com soro de leite a 3% em água destilada (leite desnatado Molico) por 20 minutos, a fim de se obter o bloqueio das ligações protéicas inespecíficas. Em seguida, as lâminas foram secas e incubadas com os anticorpos primários, por 18 horas e mantidas na temperatura de 4oC. Os anticorpos que foram utilizados e suas respectivas diluições estão especificados na Tabela 1. Todas as diluições foram realizadas utilizando PBS

associado a soro albumina bovina (PBS-BSA) a 1%. Após o período de 18 horas, realizaram-se as lavagens consecutivas e posteriormente a incubação com os anticorpos biotinilados anti-IgG de coelho/camundongo/cabra por 30 minutos, à temperatura de 22 a 25 0C, seguido pela incubação da streptoavidina marcada com peroxidase por 30 minutos, à temperatura ambiente (kit DAKO LSAB+, Peroxidase-Universal- K0690).

Posteriormente às lavagens consecutivas com PBS-BSA a 1%,

procedeu-se à revelação da reação utilizando o substrato filtrado 3.3’-

Diaminobenzidina (DAB) (SIGMA-Fast-4293), apresentado na forma de pastilhas de DAB e de peróxido de hidrogênio, que, diluídas em 5 ml de PBS, resultaram em 0,7

mg/ml de DAB e 0,2 mg/ml de H2O2. A revelação foi feita, por 20 a 30 minutos, à temperatura ambiente e protegida da luz. A reação foi interrompida com água destilada e as lâminas contra-coradas com hematoxilina de Mayer, por 5 minutos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas com água destilada por duas vezes, as lâminas foram desidratadas com álcoois (95 e 100 GL), passadas em xilol (3 vezes) e montadas com solução de resina não aquosa (Entellan-Mikroskopie-Merck).

Os controles negativos das reações foram realizados através da substituição dos anticorpos primários por PBS-BSA 1%, bem como por soro normal de coelho (DAKO, X0903-1, Glostrup-Denmark) ou de camundongo (DAKO, X0910-1, Glostrup-Denmark), descartando assim possíveis falsos positivos.

Material e Métodos 19

A eficácia dos anticorpos foi comprovada em amostras de doença granulomatosa periapical.

TABELA 1: Anticorpos primários, e seus respectivos diluições, clones, códigos e fabricantes utilizados nas amostras de Paracoccidioidomicose bucal e de mucosa bucal clinicamente saudável

Anticorpos Diluição

Clone

Código

Fabricante

Policlonais de coelho anticélula T

1:60 U0026 A0452 DAKO

humana, CD3

(Glostrup-

Denmark)

Monoclonais de camundongo

1:500 C8/144B M7103

DAKO

anticélula T humana, CD8

(Glostrup-

Denmark)

Monoclonais de camundongo 1:500 UCHL1 M0742 DAKO

anticélula T humana, CD45RO

(Glostrup-

Denmark)

Monoclonais de camundongo

1:80 L26 M0755 DAKO

anticélula B humana, CD20

(Glostrup-

Denmark)

Monoclonais de camundongo anti-

1:200 PG-M1 M0876 DAKO

macrófago humano, CD68

(Glostrup-

Denmark)

Monoclonais de camundongo anti-

1:2000 AA1 M7052 DAKO

triptase de mastócito humano

(Glostrup-

Denmark)

Policlonais de coelho anti-iNOS 1:500 G099 SC-651

Santa

Cruz

humano

Biotechnology,

(Califórnia-

USA)

3.3 Análise dos Resultados

3.3.1 Análise subjetiva geral

Material e Métodos 20

As lâminas submetidas à coloração de rotina (HE) foram avaliadas, com auxílio de um microscópico (CARL ZEISS-AXIOLAB, Germany), quanto a alterações do epitélio da mucosa de revestimento, a presença de microabscesso, a morfologia (organização) e distribuição dos granulomas e as características gerais do infiltrado inflamatório.

3.3.2 Análise subjetiva e quantitativa do fungo Paracoccidioides brasiliensis

Nos cortes corados pelo método de Grocott, foi realizada uma

avaliação da viabilidade das leveduras (caracterizada pela manutenção da estrutura morfológica), da distribuição e localização dos fungos, bem como foi realizada a contagem dos fungos viáveis em todas as amostras selecionadas.

Para esta contagem, utilizamos um microscópico binocular AXIOLAB-ZEISS associado a ocular com retículo de integração quadrado em forma de rede (CARL ZEISS-4740680000000-Netzmikrometer 12,5x). Foram selecionados 20

campos consecutivos no sítio inflamatório das lesões bucais, envolvendo principalmente os granulomas. Todas as amostras foram examinadas sob o aumento de 100X (objetiva) utilizando óleo de imersão: a área ocupada pelo retículo neste aumento correspondia a 0,015625mm2. Assim, foi realizada a contagem total de fungos em uma área de 0,3125mm2 em cada amostra. Os valores obtidos foram demonstrados como média de número de fungos.

3.3.3 Análise quantitativa das células inflamatórias e das células CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e triptase de mastócito-positivas

O material e métodos empregados para a análise quantitativa das células inflamatórias e dos diferentes tipos e subtipos celulares imunomarcados por mm2 são os mesmos descritos no segundo parágrafo do item 3.3.2. O número de

Material e Métodos 21

células CD4+ foi obtido subtraindo as células CD8+ das células CD3+ em todas as amostras. As médias e desvios padrão foram determinados e, finalmente, os dados obtidos foram submetidos a testes bioestatísticos (Teste “T” -Student- e ANOVA seguido pelo Teste de Tukey). Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0.05.

A proporção de cada tipo e subtipo celulares imunomarcados foi obtida a partir dos valores do número total de células inflamatórias e do número total de células imunomarcadas. Foram obtidos as médias e desvios padrão e estes dados foram submetidos a testes bioestatísticos (Mann Whitney e Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunn). Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0.05.

Em adição, foi verificada a possível correlação entre o número (média) de células imunomarcadas e o número (média) de fungos viáveis por mm2, nas amostras de Paracoccidioidomicose bucal. Para isto, foi utilizado o teste de correlação de Pearson, sendo confirmada a correlação quando p< 0.05.

3.3.4 Análise quantitativa e qualitativa da expressão de iNOS

A avaliação das células iNOS+ consistiu de análise quantitativa proporcional, bem como descrição detalhada do padrão de marcação das células, localização e os tipos celulares imunomarcados. Para a determinação da porcentagem de células iNOS+, no sítio inflamatório das lesões, utilizamos um microscópico binocular ao qual foi adaptado uma ocular Kpl (8x), contendo um retículo de integração circular de 25 pontos (CARL ZEISS). Foram selecionados 20 campos consecutivos no infiltrado inflamatório das lesões bucais. Em cada campo, quantificava-se todas as células imunomarcadas ou não que coincidiam com os 25

pontos do retículo e deste total quantificavam-se as células iNOS+. A porcentagem de

Material e Métodos 22

células iNOS+ foi calculada em relação as demais células do infiltrado inflamatório.

Considerando apenas as células iNOS+ verificava-se o tipo celular, se MN, CGMN ou PMN e avaliava-se ainda o padrão de imunomarcação (intensidade de coloração), de acordo com os seguintes parâmetros: (+) leve, (++) moderada e (+++) intensa. Assim, estes diferentes padrões de imunomarcação foram também quantificados. Todas as amostras foram examinadas sob o aumento de 100X (objetiva) utilizando óleo de imersão: a área ocupada pelo retículo neste aumento correspondia a 0,0176625mm2.

Foram obtidas as médias e desvios padrão. Finalmente, os dados obtidos foram submetidos a testes bioestatísticos (Mann Whitney e Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunn). Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0.05.

Nas amostras de tecido clinicamente saudável (Controle), as

populações celulares imunomarcadas foram quantificadas em 20 campos consecutivos presentes no tecido conjuntivo.

Em adição, foi verificada a possível correlação entre o número percentual de células iNOS+ (média) e o número absoluto (média) de fungos viáveis por mm2 em cada amostra de Paracoccidioidomicose bucal. Para isto, foi utilizado o teste de correlação de Pearson, sendo confirmada a correlação quando p< 0.05.

Resultados 23

4 RESULTADOS

Os resultados serão demonstrados de forma descritiva, bem como por meio de Quadros em Anexos, Tabelas, Figuras e Gráficos.

4.1 Caracterização clínica da amostragem

Para este estudo, foram selecionadas 20 amostras de

Paracoccidioidomicose bucal provenientes de biópsias incisionais de indivíduos residentes em Bauru e região e 8 amostras de tecido bucal clinicamente saudável. No momento das contagens das células imunomarcadas foram excluídas 2 amostras.

Com base nas informações clínicas, verificou-se que a maioria das amostras de Paracoccidioidomicose (85%) referia-se a pacientes do sexo masculino.

Quanto à raça, houve prevalência da raça branca sobre as demais raças e, no que diz respeito à idade dos pacientes, observou-se que esta variou de 32 a 79 anos de idade, com média de aproximadamente 52 anos.

Segundo relato do clínico, doze pacientes (60%) eram portadores da forma crônica multifocal da doença de localização oro-pulmonar, enquanto dois pacientes (10%) apresentaram localização oro-gânglio-pulmonar. Quanto ao restante da amostra não havia relato na ficha clínica quanto ao comprometimento pulmonar.

Em 45% dos casos, o tempo de evolução da doença foi relatado, o qual variou de 3 a 6 meses.

As localizações das lesões bucais da Paracoccidioidomicose foram variáveis e, em alguns casos, a doença afetou múltiplas regiões da boca. A região afetada mais freqüentemente foi a mucosa alveolar e gengival (10 casos), seguido pela borda lateral da língua (5 casos), palato duro e mole (5 casos), soalho da boca (4

casos), lábio inferior (3 casos) e mucosa jugal (3 casos).

Todos os dados anteriormente descritos estão detalhados no Anexo 2.

Resultados 24

4.2 Caracterização microscópica dos espécimes selecionados

A análise microscópica dos cortes corados em H.E. demonstrou lesões granulomatosas apresentando revestimento epitelial paraqueratinizado hiperplásico e freqüentemente exibindo aspecto pseudo-epiteliomatoso. Em 20% das amostras, observou-se área de ulceração. Outras alterações como a presença de microabcessos e exocitose foram freqüentemente visualizadas (Anexo 3).

No tecido conjuntivo subjacente, observaram-se granulomas

constituídos por aglomerados de macrófagos, células epitelióides e células gigantes multinucleadas (CGMN). Os aglomerados apresentavam-se circundados por inúmeras células mononucleares com morfologia de linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Em menor número, também se observaram neutrófilos e eosinófilos. Os granulomas visualizados em nossas amostras apresentavam, no mesmo espécime, ora arranjo frouxo e desorganizado, ora compacto e organizado, e localizavam-se mais superficialmente embora, algumas vezes, estendiam-se até os planos profundos (Anexos 3 e 4).

Adicionalmente, subdividimos as amostras de Paracoccidioidomicose bucal de acordo com a organização dos granulomas em: Paracoccidioidomicose com predomínio de granulomas organizados e Paracoccidioidomicose com predomínio de granulomas desorganizados (Figuras 1A e 1B). A limitação deste critério esteve na subjetividade e dificuldade desta avaliação, pois geralmente em uma mesma amostra observaram-se ambos padrões morfológicos de organização dos granulomas.

Todavia, consideramos predomínio de granulomas organizados quando pelo menos três granulomas bem formados eram visualizados em um aumento de 10x por no mínimo 5 campos.

Os fungos apresentaram-se, em uma mesma amostra, ora livres no ambiente extracelular, ora também no interior de células gigantes multinucleadas ou

Resultados 25

de células mononucleares(Anexo 3). A morfologia dos fungos estava inteiramente preservada (viáveis) em algumas amostras, e em outras não. Fungos em processo de esporulação ou no interior dos microabcessos foram achados freqüentes.

4.3 Caracterização numérica dos fungos

A quantidade de fungos, com morfologia preservada ou viáveis, variou de 9.60 a 800 fungos por mm2 (Anexo 4 e Figuras 1C e 1D). Considerando a grande variação na quantidade de fungos, as amostras de Paracoccidioidomicose bucal foram divididas em subgrupos obedecendo a uma escala geométrica: grupo 1 (1-50

fungos por mm2), grupo 2 (51-100 fungos por mm2), grupo 3 (101-200 fungos por mm2), grupo 4 (201-400 fungos por mm2) e grupo 5 (401-800 fungos por mm2) (Anexos 4 e 5 e Tabela 2).

TABELA 2: Distribuição das amostras de Paracoccidioidomicose bucal em relação à quantidade de fungos por mm2

Número de fungos por mm2

Número de amostras

(média)

1-50 4

51-100 3

101-200 3

201-400 4

400-800 6

Correlacionando os diferentes grupos referentes a

Paracoccidioidomicose e a organização dos granulomas, observou-se que, no grupo 1, houve predomínio de granulomas desorganizados em relação a amostra total (3:4),

Resultados 26

no grupo 2 esta relação foi de 1:3, no grupo 3 de 1:3, no grupo 4 de 2:4 e no grupo 5

de 4:6 (Anexo 4).

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Resultados 27

A

B

C

D

FIGURA 1: Fotomicrografias de amostras de Paracoccidioidomicose bucal apresentando: (A) granulomas desorganizados, com numerosas CGMN permeadas por células MN, (B) granulomas organizados constituídos por aglomerados de células epitelióides e CGMN, com halo periférico de células MN, (C) grande quantidade de fungos e (D) pequena quantidade de fungos (A e B- HE, aumento original de 25x; C e D-Grocott, aumento original de 100x).

Resultados 28

4.4 Estudo quantitativo das células inflamatórias e das células CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e triptase de mastócito-positivas

Os referidos resultados quantitativos serão descritos inicialmente comparando-se todas as amostras de Paracoccidioidomicose (grupo Paracoccidioidomicose) e o grupo Controle, considerando valores absolutos e proporcionais. Em seguida, os valores absolutos serão demonstrados considerando as amostras de Paracoccidioidomicose bucal com predomínio ou não de granulomas organizados. Posteriormente, o número de fungos por mm2 será considerado para a descrição quantitativa absoluta e proporcional das células, incluindo a correlação de Pearson.

As células presentes, bem como as células CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e triptase de mastócito-positivas, foram identificadas e quantificadas no sítio inflamatório de todas as amostras de Paracoccidioidomicose bucal e em amostras de tecido bucal clinicamente saudável (Controle). Em ambos os grupos, observou-se uma intensa imunomarcação em todos os tipos e subtipos celulares identificados. Na Paracoccidioidomicose bucal, tanto macrófagos quanto CGMN

demonstraram positividade para o anticorpo CD68. Os resultados foram expressos como média do número de células por mm2 (Anexos 5 e 6). As células triptase de mastócito-positivas foram consideradas mastócitos e assim serão referidas no texto.

Considerando o número de células inflamatórias totais por mm2, verificamos um aumento significativo com a instalação das lesões bucais de Paracoccidioidomicose (5468.67 ± 2222.43 - média ± d.p. por mm2), quando se comparava com o grupo Controle (251.20 ± 110.12 - p=0.00003). O número de células inflamatórias MN (5155.91 ± 2155.14) e de PMN (177.19 ± 151.05) também

Resultados 29

aumentaram significativamente (p=0.00045 e p=0.02068, respectivamente) com a doença, quando comparados com o grupo Controle (246.59 ± 109.00 e 6.61 ± 3.66, respectivamente) (Anexos 5 e 6, Figura 2).

A análise imuno-histoquímica revelou um significativo aumento no número de células CD68+ (2726.69 ± 1248.50), CD3+ (1572.21 ± 584.95), CD4+

(1047.47 ± 597.80) e CD8+ (524.74 ± 308.83) quando comparado àquele do grupo Controle (8.71 ± 6.87, 165.76 ± 84.61, 129.77 ± 73.94 e 33.99 ± 19.32, respectivamente - p<0.05). Por outro lado, o número das células CD45RO+, CD20+ e mastócitos (565.01 ± 773.90, 820.61 ± 887.93 e 50.01 ± 23.88, respectivamente) não aumentou significativamente na Paracoccidioidomicose bucal quando comparado com o grupo Controle (4.00 ± 1.84, 0.41 ± 0.56 e 34.26 ± 13.74, com p=0.1243, p=0.0537 e p=0.1740, respectivamente) (Anexos 5 e 6, e Figura 2).

Resultados 30

8000

*

*

Paracoccidioidomicose

7000

Controle

2

6000

m m

5000

por

élulas 4000

*

3000

ero de c

*

Núm 2000

*

1000

*

*

0

Total

MN

PMN

CD68+

CD3+

CD4+

CD8+ CD45RO+ CD20+ Mastócitos

FIGURA 2: Número (média ± d.p.) total de células inflamatórias, de células mononucleares (MN) e polimorfonucleares (PMN), de células CD68+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e de mastócitos por mm2 em lesões bucais de

Paracoccidioidomicose e no tecido clinicamente saudável (Controle). Teste “T” -

Student (*representa diferença estatisticamente significativa quando comparado com o respectivo Controle, p<0.05).

As imunomarcações para CD68, CD3, CD8, CD20, CD45RO e triptase de mastócitos na Paracoccidioidomicose bucal estão demonstradas nas Figuras 3 e 4.

A fotomicrografia 4D demonstra a imunomarcação para CD3 no tecido bucal clinicamente saudável (Controle).

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Resultados 31

A

B

C

D

FIGURA 3: Granulomas paracoccidióidicos constituídos por células epitelióides, CGMN e macrófagos CD68+ (A). No halo periférico dos granulomas, notam-se linfócitos T

CD3+ (B), linfócitos T CD8+ (C) e linfócitos CD20+ (D) (A, B, C e D- Imuno-histoquímica, imunoperoxidade, aumentos originais de 100x).

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Resultados 32

A

B

C

D

FIGURA 4: Células CD45RO+ de permeio ao granuloma paracoccidióico e na periferia deste (A). B ilustra, em detalhes, células CD45RO+ em íntimo contato com as células epitelióides e, em C, a presença de mastócitos no sítio inflamatório da Paracoccidioidomicose bucal. D ilustra células CD3+ difusamente distribuídas em amostra de tecido bucal clinicamente saudável (Controle) (A, B, C e D- Imuno-histoquímica, imunoperoxidade, aumentos originais de 100x, 250x, 100x e 100x, respectivamente).

Resultados 33

A avaliação da proporção dos diferentes tipos e subtipos celulares imunomarcados com relação ao total de células do infiltrado inflamatório na Paracoccidioidomicose bucal revelou os seguintes percentuais médios: CD68+

(49.15%), CD3+ (29.64%), CD4+ (20.05%), CD8+ (9.58%), CD45RO+ (7.74%), CD20+

(14.62%) e mastócitos (1.02%). Na Paracoccidioidomicose bucal, observou-se uma significativa diminuição na proporção de células CD3+, CD4+ e de mastócitos, e um significativo aumento na proporção de células CD68+, CD45RO+ e CD20+, quando comparava-se com o grupo Controle (Figuras 5 e 6).

80

Paracoccidioidomicose

70

Controle

60

*

ulas (%) 50

cél

de 40

*

30

tagem

*

*

20

orcenP

*

10

*

0

CD68+

CD3+

CD4+

CD8+

CD45RO+ CD20+ Mastócitos

FIGURA 5: Porcentagens de células CD68+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e mastócitos (média ± d.p.), em amostras de Paracoccidioidomicose bucal e Controle, com relação ao total de células do infiltrado inflamatório. Mann Whitney (*representa diferença estatisticamente significativa quando comparado com o respectivo Controle, p<0.05).

Resultados 34

Paracoccidioidomicose

Controle

CD68+

CD4+

CD8+

CD68+

CD4+

CD8+

CD45RO+

CD20+

Mastócitos

CD45RO+

CD20+

Mastócitos

FIGURA 6: Porcentagens de células CD68+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e mastócitos (média), em amostras de Paracoccidioidomicose bucal e Controle, com relação ao total de células do infiltrado inflamatório.

Resultados 35

A avaliação quantitativa das células inflamatórias e dos diferentes tipos e subtipos celulares imunomarcados, em relação ao padrão morfológico de organização granulomatosa predominante, não demonstrou diferença significativa no número de células entre as amostras de Paracoccidioidomicose bucal (Anexo 7 e Tabela 3).

TABELA 3: Distribuição do número total (Total) de células inflamatórias, de células mononucleares (MN) e polimorfonucleares (PMN), de células CD68+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e mastócitos por mm2, em

amostras de Paracoccidioidomicose bucal, subdivididas de acordo com a organização morfológica dos granulomas. Não houve diferenças

significativas entre as duas subdivisões da Paracoccidioidomicose bucal quando se analisaram as células totais do infiltrado inflamatório e seus diferentes tipos e subtipos (Teste “T”- Student).

Granulomas Organizados

Granulomas Desorganizados

População celular

(média ± d.p. por mm2)

(média ± d.p. por mm2)

Total

5861.21 ± 2459.23

5149.32 ± 2072.53

MN

5602.25 ± 2498.65

4790.72 ± 1871.94

PMN

202.11 ± 149.19

156.80 ± 156.62

CD68+

2992.66 ± 1323.11

2509.08 ± 1202.25

CD3+

1563.98 ± 534.78

1578.94 ± 649.01

CD4+

1027.04 ± 551.20

1064.13 ± 659.69

CD8+

536.79 ± 405.20

514.80 ± 222.81

CD45RO+

409.87 ± 422.95

419.26 ± 436.77

CD20+

1000.35 ± 1293.09

673.54 ± 327.81

Mastócitos

45.57 ± 17.35

53.64 ± 28.48

Resultados 36

Avaliando o total de células e de tipos e subtipos celulares em relação com a quantidade de fungos por mm2 nas amostras de Paracoccidioidomicose bucal, verificou-se que o número total de células presentes no infiltrado inflamatório, bem como de células MN e PMN, não se alterou significativamente com o aumento da quantidade de fungos (Tabela 4). De maneira similar, os tipos e subtipos celulares CD68+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e mastócitos também não se alteraram numericamente com o aumento da quantidade de fungos (Anexo 5, Tabela 4 e Figura 7). Todavia, quando comparados os grupos 1 a 5, individualmente com o grupo Controle, apenas observou-se um aumento significativo quanto ao total de células do infiltrado inflamatório, às células mononucleares e às células CD68+ e CD3+ de todos os grupos com doença (Tabela 4 e Figura 7). Na análise estatística do número de células CD4+ por mm2, verificou-se aumento significativo apenas quando se comparava o grupo 1 ou 2 ou 3 (980.26 ± 222.62, 1117.95 ± 189.98, 1428.81 ±

671.26, respectivamente) com o grupo Controle (129.77 ± 73.94 - p=0.038). Os grupos referentes à Paracoccidioidomicose bucal com maior número de fungos apresentaram números de células CD4+ comparáveis àqueles do grupo Controle. Em adição, houve aumento significativo no número de células CD8+ apenas comparando-se os grupos 4 (695.61 ± 579.16) e Controle (33.99 ± 19.32 - p=0.038). Em relação as demais células, CD45RO+, CD20+, mastócitos e células PMN, não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes grupos com doença e o grupo Controle (Tabela 4 e Figura 7).

Resultados 37

A análise das porcentagens das células imunomarcadas nos diferentes grupos com doença, subdivididos de acordo com a quantidade de fungos por mm2, revelou uma discreta diminuição, porém não significativa, da porcentagem de células CD68+ e CD4+ nas amostras com maior número de fungos por mm2, ou seja, grupos 4

e 5, quando comparados com os grupos 1 e 2 (Figura 8). De forma contrária, notamos um discreto aumento da porcentagem de células CD45RO+ nos grupos 3, 4 ou 5

quando comparados com os grupos 1 e 2, embora não revelando significância do ponto de vista estatístico (Figura 8).

Resultados 38

TABELA 4: Distribuição do número total de células inflamatórias, de células mononucleares (MN), de polimorfonucleares (PMN), de células CD68+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, CD20+ e mastócitos por mm2 em

amostras de Paracoccidioidomicose bucal, as quais estão subdivididas de acordo com a quantidade fungos (média do número de fungos/mm2), e nas amostras de tecido clinicamente saudável (Controle). Grupos com letras diferentes possuem diferença estatisticamente significativa entre si, p<0.05, ANOVA seguido por teste de Tukey.

Grupo 2 (51-

Grupo 3 (101-

Grupo 4 (201-

Grupo 5 (401-

Grupo 1 (1-50

100

200

400

800

Controle

População

fungos/mm2)

fungos/mm2)

fungos/mm2)

fungos/mm2)

fungos/mm2)

(média±d.p.

celular

(média±d.p.

(média±d.p.

(média±d.p.

(média±d.p.

(média±d.p.

por mm2)