Estudo ultra-estrutural e imunocitoquímico da dentina reacional e da dentina reparativa formadas... por Márcio Cajazeira Aguiar - Versão HTML

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MÁRCIO CAJAZEIRA AGUIAR

Estudo ultra-estrutural e imunocitoquímico

da dentina reacional e da dentina

reparativa formadas após luxação

extrusiva em incisivos de ratos

MÁRCIO CAJAZEIRA AGUIAR

ESTUDO ULTRA-ESTRUTURAL E

IMUNOCITOQUÍMICO DA DENTINA REACIONAL

E DA DENTINA REPARATIVA FORMADAS APÓS

LUXAÇÃO EXTRUSIVA EM INCISIVOS DE RATOS

Tese apresentada ao Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo,

para obtenção do Título de Doutor em

Ciências (Biologia Celular e Tecidual).

São Paulo

2007

MÁRCIO CAJAZEIRA AGUIAR

ESTUDO ULTRA-ESTRUTURAL E

IMUNOCITOQUÍMICO DA DENTINA REACIONAL

E DA DENTINA REPARATIVA FORMADAS APÓS

LUXAÇÃO EXTRUSIVA EM INCISIVOS DE RATOS

Tese de Doutorado apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, para obtenção

do Título de Doutor em Ciências.

Área de concentração:

Biologia Celular e Tecidual

Orientador:

Prof. Dr. Victor E. Arana-Chavez

São Paulo

2007

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

Candidato(a):

Márcio Cajazeira Aguiar

Título da Tese:

Estudo ultra-estrutural e imunocitoquímico da dentina

reacional e da dentina reparativa formadas após

luxação extrusiva em incisivos de ratos

Orientador (a):

Victor Elias Arana-Chavez

A Comissão Julgadora dos Trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................/................./................. considerou, ( ) Aprovado ( ) Reprovado (a)

Examinador(a):

Assinatura:..............................................................................

Nome:.....................................................................................

Instituição: ..............................................................................

Examinador(a):

Assinatura:.............................................................................

Nome:....................................................................................

Instituição: .............................................................................

Examinador(a):

Assinatura: .............................................................................

Nome: .....................................................................................

Instituição: ..............................................................................

Examinador(a):

Assinatura: .............................................................................

Nome: ....................................................................................

Instituição: .............................................................................

Presidente:

Assinatura: ............................................................................

Nome: ....................................................................................

Instituição: ..............................................................................

ESPAÇO DESTINADO AO CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA EM

EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL

DEDICATÓRIA

Aos meus pais

Vera e Gil Graça de Aguiar, fontes de

admiração e carinho, por acreditarem no

meu sonho e por me ensinarem que a

dignidade não tem preço.

Aos meus irmãos

Verena e Vinicius Cajazeira Aguiar que,

mesmo longe, apoiaram-me nos momentos

mais difíceis.

Aos meus avôs

Maria José Cajazeira ( in memorian) e

Carlos Rocha Cajazeira ( in memorian),

pelo amor incondicional e pelas doces

lembranças de criança.

À minha namorada

Cléo Anjos, seu carinho, sua

perseverança, sua vontade de vencer, me

contagia sempre.

Ao Senhor de todas as coisas e homens,

Deus, por me dar força divina para persistir

na caminhada e fé para não desistir nunca.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Victor Elias Arana-Chavez, sua parcimônia, seu rigor, me fizeram enxergar que a boa pesquisa é produto de muita dedicação e determinação.

Aos colegas do Laboratório de Biologia dos Tecidos Mineralizados Daniela Janones, Newton Maciel Oliveira, meus companheiros desde o início dessa jornada, Cristina Jimenez-Pellegrin, Natasha D’Andrea, Jaqueline, Diene Tenório, Maurício de Alencar Casa, Vivian Bradaschia-Correa, Sílvia Maria João, Denise Forster, Flávia Bortolotto, Isabela Tomazelli, Taís Oliveira, a “japa falsa” Tatiani Donato, Betinha, Grazielle Berrocozo, Sras. Luciana Massa e Luciene Bonafé, pela amizade e compreensão nos momentos mais difíceis.

À minha amiga Fernanda Barrence, sempre disposta a colocar sua

experiência no cotidiano da nossa prática laboratorial. Sem você, “as pedras em meu caminho” seriam maiores.

Ao Gaspar e Edson, pelas conversas vespertinas, pelo café nas horas críticas e pelo inestimável auxílio no trabalho laboratorial e na busca incessante das imagens perfeitas.

Ao Gerson ( in memorian), que partiu sem saber o quão foi valioso na minha formação como microscopista.

Aos professores Émer Suavinho Ferro, Marinilce Silva, Dânia Hamassaki-Britto, Anselmo Moriscot, por me fazerem entender que a ciência está no desejo de conhecer as causas e a origem das coisas da vida.

Ao professor Jarbas Arruda Bauer, por nossas conversas filosóficas.

À Celiana, Ana Lúcia, Eloísa e Cleusa, sempre dispostas a ajudar os alunos do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual.

Ao Fernando, Cláudio, Leornado, Nanci e Santa, pelo auxílio no manuseio dos animais de experimentação. Sem vocês, a realização desse trabalho seria impossível.

Aos funcionários da biblioteca, pelo auxílio no levantamento bibliográfico e enquadramento desse trabalho nos preceitos da normatização bibliográfica.

À minha sogra Marta Anjos, pela ajuda na correção gramatical do meu trabalho.

Aos meus amigos Marcelo Lamers, José Antônio, José “piranha”, Rodrigo, Zero, irmãos Tomazinho, Mara Rúbia, Sheila, Fausto e Marcio “astrinho”, porque acima de tudo, temos necessidade de alguém que nos incentive a realizar aquilo que somos capazes.

Aos meus amigos Gustavo Góes, Marco Antônio Romeu, Jorge Ribeiro e Atson Fernandes, por me fazerem acreditar que uma das coisas mais belas da amizade é saber quando o amigo precisa de alguém, antes mesmo que ele saiba.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.

“Alguns poucos são bem sucedidos por

estarem predestinados, a maioria por

estarem determinados”

Autor desconhecido

RESUMO

AGUIAR, M.C. Estudo ultra-estrutural e imunocitoquímico da dentina reacional e da dentina reparativa formadas após luxação extrusiva em incisivos de ratos.

Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

O complexo dentina-polpa responde frequentemente a uma agressão pela produção de dentina reacional e/ou dentina reparativa. A dentina reacional é secretada por odontoblastos originais, enquanto a dentina reparativa é formada por células

“odontoblast-like”. A osteopontina (OPN), proteína abundante no osso, e a proteína da matriz dentinária 1 (DMP1), encontrada na dentina fisiológica, podem estar presentes na matriz dentinária formada após injúria pulpar, porém nenhum estudo visando a sua detecção na dentina reacional e reparativa foi realizado. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi examinar as características ultra-estruturais e a presença e a distribuição das proteínas não colágenas OPN e DMP1 nas matrizes da dentina reacional e reparativa por meio da extrusão controlada de incisivos de rato. Os incisivos superiores direitos de ratos machos de 3 meses foram extruídos 3

mm e depois reposicionados em seus respectivos alvéolos. Decorridos 3, 7, 10, 15, 20, 30 e 60 dias da extrusão, as maxilas foram removidas e fixadas em formaldeído a 2,5% + 2% glutaraldeído ou em formaldeído a 4% + 0,1% glutaraldeído, ambas tamponadas em cacodilato de cálcio 0,1M, pH 7,2, sob irradiação por microondas, e descalcificadas em EDTA 4,13%. Como controle, um animal de cada período não teve seu dente movimentado. Depois as maxilas foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão e de varredura e imunocitoquímica para OPN

e DMP1. Após extrusão, a interface dentina-polpa mostrou a presença de dentina reacional e reparativa, as quais variaram em aspecto, espessura e células secretoras. A OPN não foi detectada na dentina fisiológica e reacional, mas foi observada na forma de acúmulos na matriz de dentina reparativa que continha células inclusas e seus prolongamentos, um aspecto comumente encontrado no osso. Em adição, os odontoblastos originais adjacentes à dentina fisiológica continham imunomarcação para OPN na região de Golgi. A DMP1 foi

imunodetectada na matriz em mineralização das dentinas fisiológica, reacional e reparativa, mas raras partículas de ouro-coloidal para esta proteína estavam presentes nas suas pré-dentinas, o que confirmou o seu papel na mineralização dentinária demonstrado por estudos em outros modelos. Os presentes achados mostraram que a dentina reparativa e o osso primário são também similares com relação às suas composições, além de semelhanças morfológicas apontadas anteriormente na literatura.

Palavras-Chave: Polpa dentária; imunocitoquímica; odontoblasto; osteopontina; proteína da matriz dentinária 1; dentina reacional; dentina reparativa; dentina terciária.

ABSTRACT

AGUIAR, M.C. Ultrastructural and immunocytochemical study of the reactionary dentine and reparative formed after extrusive luxation in rat incisors. Thesis - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

Reactionary dentine and reparative dentine are two strategies used by the dentine–

pulp complex to respond to injury. The reactionary dentine is secreted by original odontoblasts, while the reparative dentine is formed by odontoblast-like cells.

Osteopontin (OPN) and dentine matrix protein 1 (DMP1), protein present in the physiological dentine, may be present in the matrix secreted after tissue injury, but there are no studies attempting to detect it in reactionary and reparative dentine. The aim of the present study was to examine the ultrastructural characteristics, as well as the presence and distribution of OPN and DMP1 in reactionary and reparative dentine by provoking extrusion of the rat incisor. The right upper incisors of 3-month-old male rats were extruded 3 mm and then repositioned into their original sockets. At 3, 7, 10, 15, 20, 30 and 60 days after surgery, the maxillae were fixed in 2%

glutaraldehyde + 2,5% formaldehyde or in 0,1% glutaraldehyde + 4% formaldehyde, both buffered with 0.1M sodium cacodylate, pH 7.2, under microwave irradiation, and then decalcified in 4.13% EDTA. As control, an animal of each group was not operated. They were then processed for scanning and transmission electron microscopy and for immunocytochemistry for OPN and DMP1. After extrusive trauma, the dentine-pulp interface showed the presence of reactionary and reparative dentine, which varied in aspect, thickness and related cells. OPN was not detected in the physiological and reactionary dentine, while it was strongly immunoreactive in the matrix that surrounded the entrapped cells of reparative dentine, an aspect usually found in bone. In addition, original odontoblasts subjacent to the physiological dentine contained OPN in their Golgi region. DMP1 was immunodetected in the physiological, reactionary and reparative dentine matrix, but rare colloidal gold particles for this protein were observed in predentin, what confirmed its role in the dentine mineralization demonstrated by studies in other models. The present findings showed that reparative dentine shares some compositional characteristics with primary bone, especially in relation to its OPN content.

Key words: Dental pulp; immunocytochemistry; odontoblast; osteopontin; dentin matrix protein 1; reactionary dentine; reparative dentine; tertiary dentine.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1.

Fotografia mostrando a técnica cirúrgica de extrusão

dentária empregada no estudo............................................... 37

Figura 2.

Eletromicrografia demonstrando a especificidade dos

anticorpos OPN e DMP1......................................................... 41

Figura 3.

Fotografia da estrutura do incisivo superior do rato................ 45

Figura 4.

Fotomicrografias mostrando áreas de epitélio odontogênico

e de ligamento periodontal observadas após realização da

extrusão dentária.................................................................... 46

Figura 5.

Eletromicrografia mostrando o ligamento peridontal

relacionado com a face vestibular após realização do

trauma extrusivo, 60 dias após indução da extrusão

dentária................................................................................... 48

Figura 6.

Fotomicrografia mostrando a interface dentina-polpa, 3 dias

após a indução da extrusão.................................................... 49

Figura 7.

Eletromicrografias mostrando a interface polpa-dentina nos

períodos iniciais após injúria pulpar........................................ 51

Figura 8.

Eletromicrografias mostrando algumas superfícies

dentinárias expostas pela destruição dos odontoblastos

primários, 3 dias após indução da força extrusiva.................. 53

Figura 9.

Eletromicrografia mostrando início da deposição de matriz

sobre a dentina exposta, 3 dias após realização da injúria

pulpar...................................................................................... 57

Figura 10. Fotomicrografia mostrando a interface dentina-polpa, 7 dias após a indução da extrusão.................................................... 58

Figura 11. Eletromicrografias mostrando interface polpa-dentina, 7 dias após indução da extrusão dentária......................................... 59

Figura 12. Eletromicrografias mostrando inúmeras junções celulares entre odontoblastos originais remanescentes, 7 dias após

realização da extrusão dentária.............................................. 60

Figura 13. Eletromicrografia da interface dentina-polpa, 7 dias após indução da injúria pulpar......................................................... 62

Figura 14. Eletromicrografias da interface entre a matriz de dentina reparativa e as células “odontoblast-like”, 7 dias após

realização da injúria pulpar..................................................... 63

Figura 15. Fotomicrografias mostrando a interface dentina-polpa, 7

dias após indução da extrusão dentária................................. 65

Figura 16. Eletromicrografia da interface entre a matriz de dentina reparativa e uma célula “odontoblast-like”, 7 dias após

realização da injúria pulpar..................................................... 66

Figura 17. Fotomicrografia mostrando a deposição de dentina reacional e reparativa, 10 dias após a extrusão dentária....... 67

Figura 18. Eletromicrografias da matriz de dentina reparativa observadas 10 dias após injúria pulpar................................... 68

Figura 19. Fotomicrografia da matriz de dentina reparativa observada 20 dias após trauma dentário ................................................. 71

Figura 20. Eletromicrografias (de varredura) das matrizes de dentina produzidas, 30 dias após indução de injúria pulpar................ 72

Figura 21. Fotografia do conduto pulpar do incisivo obliterado, 60 dias após realização da extrusão dentária..................................... 73

Figura 22. Imunocitoquímica para OPN, 3 dias após indução da extrusão dentária.................................................................... 74

Figura 23. Imunocitoquímica para OPN, 7 dias após realização da extrusão dentária.................................................................... 77

Figura 24. Imunocitoquímica para OPN, 10 dias após realização da extrusão dentária.................................................................... 79

Figura 25. Imunocitoquímica para DMP1, 7 dias após indução da extrusão dentária.................................................................... 80

Figura 26. Imunocitoquímica para DMP1 na matriz de dentina reparativa com inclusão celular, 7 dias após indução da

injúria pulpar............................................................................ 82

Figura 27. Imunocitoquímica para DMP1 na matriz das dentinas fisiológica, reacional e dentina reparativa, 7 dias após

realização da extrusão dentária.............................................. 83

Figura 28. Imunocitoquímica para DMP1 na célula “odontoblast-like”

situada na interface dentina-polpa, 7 dias após indução da

extrusão dentária.................................................................... 85

Figura 29. Imunocitoquímica para OPN e DMP1 na matriz de dentina reparativa, 7 dias após realização da injúria pulpar................ 86

LISTA DE TABELAS

Tabela 1-

Anticorpos empregados na reação imunocitoquímica para

OPN e DMP1.......................................................................... 39

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO …………………………………………………………………………. 16

1.1 Esmalte ………………………………………………………………………………..17

1.2 Dentina …………………………………………………………………………...……18

1.2.1 Tipos de dentina ………………………………………………………………..…. 19

1.3 Proteínas não colágenas ………………………………………………………..…22

1.3.1 Osteopontina …………………………………………………………………….… 23

1.3.2 Proteína da matriz dentinária 1 ……………………………………………….…. 27

2 PROPOSIÇÃO ……………………………………………………………………….… 32

3 MATERIAL E MÉTODOS ………………………………………………………….…. 34

3.1 Animais ……………………………………………………………………………..…35

3.2 Procedimento cirúrgico ……………………………………………………..…….. 35

3.3 Obtenção da amostra …………………………………………………………....… 36

3.4 Processamento para microscopia eletrônica de varredura ......................... 38

3.5 Processamento para microscopia eletrônica de transmissão ..................... 38

3.6 Imunocitoquímica pós-inclusão com ouro coloidal ...................................... 39

4 RESULTADOS …………………………………………………………………………. 42

4.1 Morfologia ......................................................................................................... 43

4.1.1 Esmalte ............................................................................................................ 43

4.1.2 Dentina ............................................................................................................ 44

4.2 Imunocitoquímica ............................................................................................. 70

4.2.1 Osteopontina ................................................................................................... 70

4.2.2 Proteína da matriz dentinária 1 ....................................................................... 76

5 DISCUSSÃO ………………………………………………………………………….... 87

6 CONCLUSÕES ……………………………………………………………………...... 100

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 102

ANEXOS ……………………………………………………………………………….....109

1 INTRODUÇÃO