Estudo ultra-estrutural e imunocitoquímico da dentina reacional e da dentina reparativa formadas... por Márcio Cajazeira Aguiar - Versão HTML

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Os tecidos dentários e suas estruturas de suporte são formados como resultado da interação entre o epitélio oral e o ectomesênquima, durante a odontogênese. Na odontogênese, cada tecido em particular é formado por um processo específico. Assim sendo, amelogênese e dentinogênese referem-se, respectivamente, à formação do esmalte e da dentina, dois tecidos dentários mineralizados.

1.1 Esmalte

O esmalte que reveste a coroa dentária difere dos demais tecidos

mineralizados por ser de origem ectodérmica, desprovido de células e incapaz de reparar-se ou remodelar-se. É composto essencialmente por cristais de fosfato de cálcio sob a forma de hidroxiapatita (97%), por material orgânico (1%) e por água (2%). Os ameloblastos são as células responsáveis pela formação desse tecido, estando envolvidas na síntese e secreção das proteínas da matriz e na mineralização do esmalte.

As proteínas da matriz do esmalte são abundantes no início da amelogênese e parecem influenciar a organização estrutural e a mineralização do esmalte (PAINE

et al., 2000). A matriz não mineralizada do esmalte é formada por diversas proteínas incluindo a amelogenina e as não amelogeninas, bem como as proteinases (SMITH, 1998; HU et al., 2001). As amelogeninas são as proteínas mais abundantes da matriz do esmalte. Na fase secretora e no estágio inicial de maturação da amelogênese, distintas isoformas da amelogenina estão distribuídas heterogeneamente sobre a matriz de esmalte e parecem desempenhar papéis específicos na sua formação (NANCI et al.,1998; SMITH, 1998, FINCHAM et al., 1999; SIMMER e HU, 2001). As proteínas do grupo das não amelogeninas compreendem a ameloblastina, enamelina (FINCHAM et al., 1999; SIMMER e HU, 2001), tufelina e proteínas sulfatadas (FINCHAM et al., 1999). As proteinases, proteínas responsáveis pela degradação da matriz orgânica extracelular relacionada com o crescimento dos cristais de hidroxiapatita, incluem enamelisina (MMP-20) e a serina protease (SMITH, 1998; FINCHAM et al., 1999).

1.2. Dentina

A dentinogênese compreende a formação de um tecido mineralizado de natureza conjuntiva, avascular e acelular, a dentina, a qual está revestida na sua porção coronária e na sua porção radicular pelo esmalte e pelo cemento, respectivamente. A dentina aloja no seu interior um tecido conjuntivo frouxo, a polpa dentária, com a qual compartilha características comuns referentes à origem e função (KATCHBURIAN e ARANA, 2004).

A dentina é caracterizada pela presença de inúmeros túbulos dentinários que atravessam toda a sua espessura. Os túbulos dentinários estão preenchidos por extensões citoplasmáticas dos odontoblastos, diferenciados a partir de células ectomesênquimais da papila dentária, por um processo de indução recíproca com as células do epitélio interno do órgão do esmalte (TEN CATE, 1998).

Os odontoblastos, organizados em uma camada simples, são células pós-mitóticas oriundas da crista neural, que se diferenciam no estágio de sino tardio da odontogênese. Durante a dentinogênese, o odontoblasto sintetiza e secreta os componentes da matriz extracelular da dentina primária e secundária e controla sua subseqüente mineralização (SMITH et al., 1995; D’SOUZA et al., 1995; MAGLOIRE

et al., 2001; ARANA-CHAVEZ e MASSA, 2004).

A diferenciação dos odontoblastos é marcada pela expressão de vários genes que codificam para proteínas colágenas e não colágenas e por modificações morfológicas. A expressão de alguns desses genes é específica e pode confirmar o fenótipo de odontoblasto completamente diferenciado (RUCH et al., 1995). Tais células, por exemplo, expressam a sialofosfoproteína dentinária (DSPP), um produto de um gene que não é transcrito por outras células como osteoblastos (GAIKWAD et al., 2001). As modificações morfológicas que refletem diferenciação incluem formação de processos citoplasmáticos apicais e polarização celular (RUCH et al., 1995).

A dentina, em relação ao seu peso, é composta por 70% de material

inorgânico, 18% de material orgânico e 12% de água. Seu componente inorgânico é constituído por cristais de hidroxiapatita, enquanto a porção orgânica contém principalmente colágeno tipo I, frações de colágeno tipo III e tipo V, glicoproteínas, proteoglicanos e proteínas não colágenas (TEN CATE, 1998; KATCHBURIAN e ARANA, 2004). Outra categoria inclui proteínas não sintetizadas por odontoblastos e encontradas na circulação sangüínea, mas com grande afinidade pela matriz dentinária. Finalmente, a dentina contém inúmeros fatores de crescimento como proteína morfogenética óssea (BMP), fator de crescimento insulina-like e fator de crescimento transformante (TGFβ), cuja célula secretora não foi devidamente identificada (BUTLER e RITCHIE, 1995).

Na odontogênese, muitos eventos são ainda desconhecidos, particularmente na fase em que ocorre a indução recíproca entre as células do epitélio interno do órgão do esmalte e as células ectomesênquimais da papila dentária, fenômeno que leva à diferenciação dos odontoblastos e ameloblastos e ao início da deposição de dentina e esmalte. Uma estratégia empregada no estudo da formação dos tecidos dentários, particularmente a síntese e secreção de proteínas não colágenas pelas suas células formadoras, é a introdução de alterações no processo de odontogênese. Com esse objetivo, vários modelos têm sido empregados, dentre os quais, a administração de drogas (NANCI et al., 1998; YAMADA et al., 2000) e a aplicação de trauma mecânico sobre dentes em formação (TANIGUCHI et al., 1999; SPAHR et al., 2002). Nos ratos, a segunda das estratégias mencionadas pode ser utilizada mesmo em animais adultos, porque seu incisivo apresenta um epitélio odontogênico na região apical por sua face vestibular em permanente proliferação e diferenciação que simula a maioria dos eventos observados na odontogênese.

1.2.1 Tipos de dentina

Nos dentes humanos, pode-se observar a presença de três tipos de dentina: primária, secundária e terciária. A dentina primária refere-se àquele tecido secretado antes do término da formação radicular. A dentina secundária é aquela produzida durante toda vida num ritmo mais lento após a formação radicular. O aspecto mais característico e comum entre ambas é a presença de uma estrutura tubular e regular (SMITH et al., 1995). Nesse contexto, é válido ressaltar que, no incisivo do rato, a dentina primária não pode ser distinguida da dentina secundária, visto que tal dente erupciona continuamente e não há término da formação radicular. Assim, além das dentinas formadas após injúria pulpar, tem-se apenas a dentina fisiológica no incisivo do rato.

A dentina terciária, matriz dentinária depositada em um local específico da interface polpa-dentina em resposta a um estímulo (SMITH et al., 1995; MURRAY et al., 2003), pode ser classificada como reacional ou reparativa, dependendo da severidade da agressão e das condições do tecido pulpar (MURRAY et al., 2003).

Havendo um estímulo de pequena intensidade, haverá aumento da secreção de uma matriz pelos odontoblastos pré-existentes expostos à injúria. Estímulos mais intensos podem destruir os odontoblastos primários, havendo, se as condições pulpares forem favoráveis, a formação de uma nova geração de células secretoras de dentina denominadas de células “odontoblast-like” (SMITH et al., 1995).

A matriz de dentina terciária secretada por um grupo de odontoblastos pós-mitóticos sobreviventes à injúria pulpar (cárie, preparo cavitário ou agressão de outra natureza) é denominada de dentina reacional (SMITH et al., 1995; MAGLOIRE et al., 2001; SMITH et al., 2001; MURRAY et al., 2003). A matriz de dentina secretada por células “odontoblast-like” formadas após destruição dos odontoblastos primários é chamada de dentina reparativa (SMITH et al., 1995; SMITH et al., 2001; MURRAY et al., 2003). A sugestão de que as células “odontoblast-like” substituem os odontoblastos primários na secreção da matriz de dentina advém do fato de se observar imunomarcação de proteínas dentinárias específicas na matriz produzida por aquelas células (D’SOUZA et al., 1995), além de algumas semelhanças morfológicas (TZIAFAS, 1995). Entretanto, tais informações devem ser analisadas com reservas, pois muitas proteínas consideradas originalmente da dentina têm sido recentemente encontradas na matriz óssea (QIN et al., 2003; PRIAM et al., 2005).

Estruturalmente a dentina terciária pode variar de uma matriz mais organizada semelhante ao da dentina primária para uma matriz atubular, distrófica, com inclusões celulares e aspecto osteóide (SMITH et al., 1995). Essa diversidade de aspecto parece estar associada com o tipo ou estágio de diferenciação da célula responsável pela formação do novo tecido (TEN CATE, 1998). Matrizes atípicas e atubulares são realizadas por células cuboídes ou cilíndricas e diferentes dos odontoblastos primários denominadas de células “odontoblast-like” (TZIAFAS, 1995).

Diferente da dentinogênese primária que é mediada por interações entre o epitélio odontogênico e as células mesênquimais da papila dentária, a diferenciação das células “odontoblast-like” acontece na ausência do epitélio odontogênico (TZIAFAS, 1994; TZIAFAS, 1995), o que pode explicar diferenças de composição observadas entre a dentina reparativa e a dentina fisiológica como mostrado por Foreman e Soames (1989).

A questão com relação à origem da célula “odontoblast-like” envolvidas na produção da matriz durante a dentinogênese reparativa não está esclarecida, embora tenha sido exaustivamente investigada (TZIAFAS, 1994; D’SOUZA et al., 1995). Muitos estudos sugerem que diferentes grupos de células estão envolvidos na formação da dentina reparativa e incluem as células residentes da zona rica em células da camada sub-odontoblástica, fibroblastos, pericitos, células endoteliais, células progenitoras e células-tronco (TZIAFAS, 1994; TZIAFAS, 1995; SPAHR et al., 2002; GOLDBERG et al., 2003; SLOAN e SMITH, 2007). Um desses grupos reside na camada odontoblástica e seriam pré-odontoblastos que interromperam sua diferenciação terminal. Havendo uma injúria pulpar com destruição dos odontoblastos primários, tais células reiniciariam sua diferenciação transformando-se numa nova geração de odontoblastos (TZIAFAS, 1995; SPAHR et al., 2002).

É possível que as células “odontoblast-like” possam derivar das células-tronco ou das células progenitoras da região perivascular (SLOAN e SMITH, 2007). Téclés et al., (2005) demonstraram que a injúria pulpar estimulou a proliferação e migração de células progenitoras/tronco para o local da injúria pulpar a partir da região perivascular.

Independente do grupo específico celular responsável pela resposta pulpar há evidências de que apenas as populações celulares da polpa têm potencial para se diferenciar em células “odontoblast-like”, competência adquirida nos eventos iniciais da formação dentária, durante interações entre o ectoderma oral e as células ectomesênquimais (TZIAFAS, 1994, 1995).

Os mecanismos celulares e moleculares que regulam a seqüência de eventos observadas na dentinogênese reparativa têm sido estudados por uma variedade de modelos in vitro e in vivo (COUBLE et al., 2000; GOLDBERG et al., 2001; SPAHR et al., 2002; MATHIEU et al., 2005). Ainda que alguns estudos tenham contribuído significativamente para o entendimento da formação da dentina reparativa, existe pouca informação sobre os passos iniciais desse processo, particularmente a origem, proliferação e migração das células responsáveis pela formação da dentina reparativa (TZIAFAS, 1994; D’SOUZA et al., 1995; MATHIEU et al., 2005; TÉCLÉS

et al., 2005).

Além disso, o processo de mineralização da matriz dentinária, em especial a da dentina terciária reparativa, ainda não foi compreendido. Os mecanismos que controlam a mineralização dos tecidos duros têm sido objeto de muita discussão, especialmente com relação aos componentes e macromoléculas que participam ativamente no processo. A hidroxiapatita, principal componente inorgânico da matriz mineralizada, não se deposita sobre uma matriz orgânica na ausência de moléculas nucleadoras específicas com afinidade pelo cálcio (HE et al., 2003b).

1.3 Proteínas não colágenas

Atualmente as proteínas não colágenas têm sido implicadas na regulação da deposição dos cristais inorgânicos sobre a matriz do osso, dentina e esmalte. Em particular, tais proteínas parecem estar envolvidas no controle da nucleação, inibição, tamanho, forma e orientação dos cristais formados (GEORGE et al., 1993; GOLDBERG et al., 1995).

A mineralização mediada pelas proteínas da matriz obedeceria a uma estratégia básica, na qual células especializadas inicialmente formam componentes estruturais da matriz extracelular e depois liberam pequena quantidade de macromoléculas específicas que modificam as propriedades da matriz, induzindo a deposição de minerais (GEORGE et al., 1993). Na dentina, por exemplo, os odontoblastos secretam um arcabouço não mineralizado, formado por fibrilas colágenas, chamado de pré-dentina, que, a certa distância do corpo celular do odontoblasto, é transformada em dentina. Essa célula, ao se deslocar para o centro da polpa, produz mais pré-dentina que é gradualmente mineralizada, mantendo sua conexão com tecido por meio dos seus processos odontoblásticos. A transformação da pré-dentina em dentina envolve muitos fenômenos que iniciam a deposição e crescimento de cristais de apatita entre e sobre as fibrilas colágenas. Os mecanismos envolvidos na mineralização da dentina não estão completamente entendidos, mas existem diversas evidências sugerindo a participação de proteínas não colágenas neste processo (BUTLER e RITCHIE, 1995; MASSA et al., 2005).

A matriz não colágena da dentina é constituída por várias proteínas, muitas delas altamente fosforiladas, com propriedades de ligação ao cálcio e função variando entre promoção e inibição da deposição de minerais em experimentos in vitro (HUNTER et al., 1996). Algumas delas são produtos derivados da clivagem de uma proteína de alto peso molecular chamada sialofosfoproteína dentinária (DSPP) como sialoproteína dentinária (DSP) e fosfoproteína dentinária (DPP), proteína da matriz dentinária 1, 2 e 3 (DMP1, DMP2 e DMP3, respectivamente), osteopontina (OPN), sialoproteína óssea, osteonectina e osteocalcina (BUTLER e RITCHIE, 1995; HE et al., 2003a,b).

Entre as proteínas não colágenas possivelmente envolvidas na

dentinogênese reparativa, está a osteopontina, uma glicoproteína fosforilada envolvida em alguns eventos fisiológicos e patológicos em muitos tecidos mineralizados (DENHARDT et al. 2001; MAZZALI et al. 2002; QIN et al. 2004), mas que não é imunodetectada na dentina primária e secundária. Outra proteína não colágena potencialmente relacionada com a dentinogênese é a DMP1 (MASSA et al., 2005), uma fosfoproteína encontrada particularmente na dentina e no osso (GEORGE et al. 1993; MACDOUGALL et al. 1998). Ainda que a OPN e a DMP1

estejam implicadas na formação dos tecidos mineralizados, não existem estudos indicando a presença destas proteínas na dentina reparativa e sua relação com o aparecimento das células “odontoblast-like”.

1.3.1 Osteopontina

A OPN tem sido caracterizada por diferentes ferramentas de estudo em muitos campos de pesquisa. O termo OPN foi adotado para refletir o potencial desta proteína óssea em servir como ponte de ligação entre as células e a hidroxiapatita (BUTLER, 1989; SODEK et al., 2000; QIN et al., 2004).

A OPN está presente em muitos tecidos mineralizados e moles incluindo rim, cérebro, zona de cartilagem hipertrófica (SODEK et al., 2000), cálculos pulpares (NINOMIYA et al., 2001), osso, cemento, dentina (McKEE e NANCI, 1996c), músculo, tumores e fluidos corporais (BUTLER, 1989; GIACHELLI e STEIZ, 2000; SODEK et al., 2000; DENHARDT et al., 2001). A ampla distribuição tecidual da OPN e sua expressão em células de variadas linhagens indicam uma multiplicidade de funções em diversos eventos biológicos, estando particularmente aumentada sob condições de inflamação e remodelação óssea (GIACHELLI e STEITZ, 2000; SODEK et al., 2000).

A produção de OPN parece ser um evento regulado, visto que a sua

expressão pode ser modificada por hormônios, citocinas e fatores de crescimento (BUTLER, 1989; SODEK et al., 2000). Estudos demonstraram variação da expressão da OPN pelo fator de crescimento epidêmico (EGF), pelo fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), pelo TGF β, por BMP (DENHARDT e NODA, 1998), por hipóxia (SODHI et al., 2001) e por alguns hormônios (SODEK et al., 2000).

Ao contrário de muitos tecidos, o osso contém grande quantidade da proteína OPN, reforçando a possibilidade desta proteína estar envolvida na interação entre os minerais e as células ósseas (GIACHELLI e STEITZ, 2000). O conceito de que a OPN estaria envolvida na formação da matriz óssea foi realizada com base na sua distribuição tecidual, sua afinidade pelo cálcio e sua imunolocalização nas regiões de mineralização (GERICKE et al., 2005). No tecido ósseo, a OPN é sintetizada por preosteoblastos, osteblastos e osteócitos (BUTLER, 1989, McKEE e NANCI, 1996c) e talvez pelos osteoclastos (SODEK et al., 2000), porque existem controvérsias quanto a sua capacidade de secretar OPN (McKEE e NANCI, 1996b).

Em geral, acúmulos de OPN são detectados em regiões específicas do tecido mineralizado. A OPN, por exemplo, é observada em regiões amorfas e elétron-opacas situadas nos amplos espaços interfibrilares da matriz óssea (McKEE e NANCI, 1996c). Diferenças na sua imunodetecção estão também relacionadas com o estágio de desenvolvimento (fetal ou adulto) e tipo de organização estrutural do osso (osso primário ou secundário). No osso primário, por exemplo, OPN está presente em grande quantidade e se acumula nos espaços interfibrilares de sua matriz, enquanto que no osso secundário, um tecido com espaços interfibrilares menores, a OPN está presente em menor concentração (SODEK et al., 2000). A preferência da OPN pelos espaços interfibrilares pode indicar um papel na mineralização uniforme de toda a matriz garantindo coesão tecidual (NANCI, 1999).

No tecido ósseo, acúmulos de OPN também são observados em muitas

interfaces teciduais incluindo linhas cimentantes e laminae limitans (McKEE e NANCI, 1996a,c). Laminae limitans é uma estrutura delgada, elétron-opaca em microscopia eletrônica, encontrada na periferia do osso e do cemento, estando relacionadas com as células ósseas e cementárias, respectivamente. Tais regiões compreendem a periferia da lacuna do osteócito (ou cementócito), dos canalículos e superfícies ósseas adjacentes às células de revestimento ósseo (McKEE e NANCI, 1996a,c; SODEK et al., 2000).

A linha cimentante corresponde a uma interface, também elétron-opaca quando analisada no microscópio eletrônico de transmissão, entre duas matrizes mineralizadas. É formada sobre áreas previamente reabsorvidas (linhas reversas) ou em áreas onde aposição óssea foi interrompida (linhas incrementais). A afinidade da OPN por essa estrutura pode indicar um papel na interação entre as células osteoblásticas e a matriz e na regulação da deposição do novo tecido mineralizado sobre outro pré-existente (McKEE e NANCI, 1996a,c; SODEK et al., 2000).

A OPN também está presente em grande quantidade na matriz do cemento, particularmente no cemento celular. Tal proteína acumula-se preferencialmente entre as fibrilas colágenas na junção cemento-dentinária contribuindo possivelmente para reforçar a união entre os dois tecidos (McKEE e NANCI, 1996a,c; BOSSHARDT et al., 2005) e na região de laminae limitans em torno dos cementócitos e do seus processos citoplasmáticos (McKEE e NANCI, 1996c).

Sua imunolocalização específica em alguns tecidos pode estar relacionada com as características estruturais da OPN. A OPN é uma proteína ácida, pois contém seqüências consecutivas de ácido aspártico, além de resíduos de serina ou treonina com potencial de fosforilação (BUTLER, 1989; GIACHELLI e STEITZ, 2000, SODEK et al., 2000). O potencial de fosforilação da OPN é um importante fator na determinação do papel desta proteína em alguns tecidos (DENHARDT et al., 2001; QIN et al., 2004; GERICKE et al., 2005) e pode explicar diferenças no grau de fosforilação e função desempenhada pela OPN em diferentes regiões e animais. É

sabido que formas desfosforiladas da OPN não têm efeito sobre a nucleação de cristais, enquanto formas muitos fosforiladas promovem formação e crescimento da hidroxiapatita. Formas parcialmente fosforiladas como a OPN óssea inibem o crescimento dos cristais de hidroxiapatita (GERICKE et al., 2005). Tal variação pode depender de alterações conformacionais produzidas pela interação entre os grupos fosfato da OPN e a superfície catiônica dos cristais de hidroxiapatita, visto que, a OPN do leite, uma proteína muito fosforilada, sofre um discreto aumento no conteúdo de “β-sheet” após interação com a hidroxiapatita (GERICKE et al., 2005).

Tais características combinadas com a presença de outros domínios com afinidade para o cálcio podem explicar sua interação com os cristais de hidroxiapatita (GIACHELLI e STEITZ, 2000).

Além de sítios de glicosilação (SODEK et al., 2000; QIN et al., 2004; MAZZALI et al., 2002), a OPN contém inúmeros domínios de adesão celular incluindo uma seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD), uma região com afinidade para alguns receptores de superfície celular, que incluem as integrinas αvβ3, αvβ1 e αvβ5

(RUOSLAHTI e PIERSCHBACHER, 1987; SODEK et al., 2000). Além de adesão celular, a interação entre a OPN e a integrina pode gerar diferentes respostas celulares como migração e quimiotaxia. As diferentes respostas geradas podem ser explicadas pela existência de múltiplas combinações heterodiméricas das cadeias da integrina e de muitas isoformas da proteína OPN (SODEK et al., 2000).

Adicionalmente, outras seqüências dentro da OPN parecem mediar adesão celular.

Por exemplo, clivagem da OPN por trombina expõe a seqüência serina-valina-valina-tirosina-ácido glutâmico-leucina-arginina (SVVYGLR) promovendo interação com algumas isoformas da integrina (YOKOSAKI et al., 1999; GRAVALLESE, 2003).

Os domínios relacionados com adesão celular observados na OPN podem ser importantes para sinalização e migração celular, inclusive no tecido mineralizado, no qual tal proteína pode regular sua formação e remodelação (BUTLER e RITCHIE, 1995). Seu papel na sinalização celular é reforçado pelo fato desta proteína modificar a concentração intracelular do íon cálcio em células cultivadas e alterar o grau de fosforilação de proteínas intracelulares (DENHARDT et al., 2001). Muitas vias de sinalização são ativadas por processos alternados de fosforilação e desfosforilação de proteínas intracelulares.

O papel da OPN na remodelação do tecido ósseo inclui o controle da diferenciação, recrutamento, adesão (YOSHITAKE et al., 1999; SODEK et al., 2000) e função dos osteoclastos (McKEE e NANCI, 1996c; GIACHELLI e STEITZ, 2000) e provavelmente ocorre pela interação desta proteína com a integrina αvβ3, um receptor envolvido na sinalização intracelular (REINHOLT et al., 1990; ROSS et al., 1993).

Contudo, o efeito da OPN sobre as células clásticas dos demais tecidos mineralizados é discutível. Trabalhos estudando a reabsorção dentinária observaram acúmulos de OPN em lacunas reabsortivas na matriz de dentina após adesão dos odontoclastos (SHIMAZU et al., 2002; BOSSHARDT et al., 2005). Tais resultados indicam que o principal mecanismo para adesão odontoclástica sobre a dentina pode não ser mediado pela proteína OPN.

A OPN também pode estar envolvida na regulação da adesão das demais células ósseas (McKEE e NANCI, 1996c; GIACHELLI e STEITZ, 2000), pois acúmulos de OPN têm sido observados na linha cementária e laminae limitans, estruturas relacionadas com a interação da matriz óssea com as células ósseas (McKEE e NANCI, 1996a). Além do seu papel na adesão celular, a OPN pode estar regulando a deposição dos cristais de fosfato de cálcio na matriz óssea, visto que a OPN é encontrada em focos de mineralização no osteóide e na matriz do cemento (MCKEE e NANCI, 1996c). Estudos in vitro mostraram que a OPN é um potente inibidor da formação e crescimento dos cristais de hidroxiapatita (HUNTER et al., 1996; BOSKEY et al., 2002). Alguns elementos estruturais requeridos para interação com cálcio estão presentes na OPN e incluem domínios contendo ácido poli aspártico e resíduos de aminoácidos fosforilados (GIACHELLI e STEITZ, 2000; SODEK et al., 2000).

Na dentina primária, o papel da OPN é menos óbvio e parece estar associado com alguns eventos, como no início da mineralização da dentina do manto da raiz em desenvolvimento. Talvez porque outros constituintes da matriz dentinária substituem a OPN na formação e mineralização da dentina (SODEK et al., 2000).

O papel da OPN na formação de cristais de hidroxiapatita não se limita aos tecidos mineralizados. A presença da OPN nos fluidos biológicos com elevadas concentrações de sais de cálcio e no trato urinário reforçam as evidências de que esta proteína pode prevenir ou limitar a precipitação espontânea dos sais de cálcio, impedindo a formação de cálculos renais (SODEK et al., 2000; MAZZALI et al., 2002).

A OPN parece também estar envolvida na resposta celular a uma injúria. Na presença de OPN, culturas de células epiteliais renais e células tumorais tornaram-se resistentes a hipóxia e a substâncias produzidas por macrófagos ativados, respectivamente (DENHARDT et al., 2001).

A resistência à agressão requer a adesão da OPN às células agredidas e pode estar relacionada com a inibição da apoptose (SCATENA et al., 1998). O

mecanismo pelo qual a OPN inibiria a apoptose não está claro, mas pode envolver a regulação do fator Kappa B nuclear (NF-κB), um fator que regula muitos genes envolvidos na resposta inflamatória e imune. Em células não estimuladas, fator NF-

κB está localizado no citoplasma formando um complexo com uma proteína inibitória, IκB (BALDWIN, 1996). Havendo remoção dessa proteína, ocorre o translocamento do fator NF-κB para o núcleo e ativação da transcrição de genes que inibem a apoptose (SCATENA et al., 1998).

1.3.2 Proteína da matriz dentinária 1

Outra proteína não colágena relacionada com a formação dos tecidos mineralizados é a DMP1. A DMP1 foi descoberta a partir de um banco de RNAm de odontoblastos de ratos (GEORGE et al., 1993), sendo sua existência confirmada por hibridização in situ (GEORGE et al., 1994).

A DMP1 foi originalmente considerada uma proteína específica da dentina, porém, mais tarde, seu transcrito primário foi também expresso em osteoblastos e cementoblastos, células específicas do osso e do cemento, respectivamente (MACDOUGALL et al., 1998).

Na dentina, a DMP1 é encontrada nas células e matriz relacionadas com a mineralização. Nos odontoblastos, por exemplo, estudos imunocitoquímicos mostraram sua presença na região de Golgi, nos núcleos dos odontoblastos primários em diferenciação, nas vesículas da matriz e na matriz dentinária completamente mineralizada. Contudo tal proteína não foi imunodetectada na pré-

dentina da dentina do manto (MASSA et al., 2005).

Analisando sua estrutura e composição, observa-se que a DMP1 possui um alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e resíduos de serina (GEORGE et al., 1993; SRINIVASAN et al., 1999), além de uma região RGD, sítios para N-glicosilação e para O-glicosilação (GEORGE et al., 1993; BUTLER e RITCHIE, 1995; MACDOUGALL et al., 1998; SRINIVASAN et al., 1999). A região RGD, uma seqüência conservada em muitas espécies, é essencial para a interação entre DMP1

e as células, visto que a modificação do domínio RGD da DMP1 bloqueia sua adesão com células pulpares e osteogênicas (KULKARNI et al., 2000).

A DMP1 é uma proteína carregada negativamente em virtude do grande número de serinas fosforiladas (GEORGE et al., 1993; BUTLER e RITCHIE, 1995; SRINIVASAN et al., 1999; MACDOUGALL et al., 1998). A presença das serinas fosforiladas na estrutura da DMP1 permite interação desta proteína com alguns cátions, em especial o cálcio (SRINIVASAN et al., 1999; NARAYANAN et al., 2003).

Sua possível interação com o cálcio e fosfato permite relacioná-la com o processo de mineralização nos tecidos duros, onde tal proteína poderia iniciar o processo de nucleação e regular o crescimento dos cristais de hidroxiapatita (SRINIVASAN et al., 1999; NARAYANAN et al., 2001; HE et al., 2003a,b). He et al.

(2003 a,b) observaram deposição de partículas de mineral, inicialmente amorfas, que evoluíram para a formação de cristais de hidroxiapatita organizados na presença de DMP1.

Além disso, na dentina, a DMP1 é expressa no início da mineralização indicando um possível papel regulador neste processo (HE et al., 2003a; MASSA et al., 2005). Camundongos com deleção do gene para DMP1 desenvolveram dentes com câmaras pulpares ampliadas, camada anormalmente espessa de pré-dentina com redução e hipomineralização da camada de dentina. Nesses camundongos, a DSPP e seu RNA mensageiro correspondente estavam reduzidos, sugerindo seu controle pela DMP1 durante a dentinogênese (YE et al., 2004). Alguns desses efeitos podem estar relacionados com o fato da DMP1 poder regular a diferenciação terminal dos odontoblastos, visto que a transfecção de um cDNA para DMP1 de rato para as células mesenquimais C3H10T1/2 e MC3T3-E1 induziu sua diferenciação em células “odontoblast-like”, estimulou a formação de uma matriz competente para formar nódulos mineralizados e aumentou a transcrição dos genes DMP2 e DSP, dois marcadores relacionados com fenótipo odontoblástico. Um aspecto interessante foi a alta especificidade de ação da DMP1, pois outras linhagens celulares não expressaram os genes específicos DMP2 e DSP na sua presença (NARAYANAN et al., 2001).

O papel da DMP1 na transcrição de genes pode estar relacionado com a sua localização eventual no núcleo e é dependente de sua fosforilação. Alguns estudos sugerem que osteoblastos e células precursoras podem sintetizar DMP1 e transportá-lo para o núcleo. No núcleo, DMP1 seria responsável pela transcrição dos genes da matriz envolvidos na formação do tecido mineralizado. Posteriormente, quando os osteoblastos tornam-se polarizados, DMP1 seria fosforilada (NARAYANAN et al., 2003), sendo exportada para a matriz extracelular, onde DMP1

iniciaria a nucleação da hidroxiapatita e regularia a formação do tecido mineralizado (NARAYANAN et al., 2003; HE e GEORGE, 2004).

Além de induzir a transcrição de genes específicos da dentina, a DMP1 pode regular a expressão de proteínas relacionadas com a mineralização. Narayanan et al.

(2001) mostraram que o bloqueio da expressão da DMP1 reduziu a expressão da fosfatase alcalina e da osteocalcina, duas proteínas envolvidas na mineralização de muitos tecidos.

Em algumas situações, a DMP1 requer uma interação com colágeno tipo I a fim de influenciar o processo de mineralização. Experimentos de mineralização in vitro demonstraram acúmulo preferencial de mineral sobre a superfície do colágeno associado à DMP1. Além disso, tal interação parece regular a velocidade de formação e a estrutura das fibrilas colágenas. Ensaios in vitro mostraram um aumento gradual da fibrinogênese com aumento do diâmetro das fibrilas colágenas na presença de DMP1 (HE e GEORGE, 2004).

Embora o processo de mineralização envolva a participação das fibrilas colágenas (HE e GEORGE, 2004), seu papel no processo é passivo, pois foi demonstrado que a deposição de hidroxiapatita sobre o colágeno só ocorre na presença de nucleadores (SAITO et al., 1997). O colágeno tipo I é o principal componente orgânico da matriz mineralizada do osso e da dentina sendo expressa por células osteoblásticas e odontoblásticas. Sendo o colágeno uma estrutura aparentemente passiva na mineralização, toda atenção tem sido destinada às proteínas não colágenas que interagem com as fibrilas de colágeno nos tecidos mineralizados, dentre as quais, a DMP1.

A interação entre a DMP1 e a fibrila colágena é específica e contribui para a imobilização desta proteína na matriz extracelular após sua secreção, com a ligação acontecendo provavelmente entre a região “gap” das fibrilas colágenas e duas seqüências peptídicas, 349DSESSEEDR357 e 424SEENRDSDSQDSSR437, situadas na extremidade carboxila da DMP1 (HE e GEORGE, 2004).

Sendo assim, em virtude de seu potencial papel na mineralização dos tecidos baseados em colágeno, seria importante estudar a presença da DMP1 na dentina formada após injúria pulpar, um tecido cuja matriz orgânica é também colágena, elemento pelo qual a DMP1 possui grande afinidade. O estudo da OPN, outra proteína não colágena, nesse tecido também é justificável, pelo fato desta proteína ser detectada nas áreas relacionadas com a coesão e integridade tecidual e estar presente na forma de acúmulos nas interfaces célula-matriz em diferentes tecidos mineralizados. Ainda que a DMP1 e a OPN estejam implicadas na formação dos tecidos mineralizados, não existem estudos indicando a presença destas proteínas na dentina reparativa e sua relação com o aparecimento das células “odontoblast-like”. Ilações sobre o papel das proteínas não colágenas na formação do tecido mineralizado podem ser feitas por inúmeras ferramentas de estudo.

Neste sentido, a imunocitoquímica representa uma técnica de imagem poderosa para correlacionar estrutura com composição. Sua aplicação na análise histológica permite identificar e mapear a distribuição de moléculas específicas em várias matrizes e células. Entre os diferentes métodos disponíveis, a imunocitoquímica pós-inclusão com ouro-coloidal, técnica que permite localizar em alta resolução um elemento marcado em um tecido, tem sido utilizada para caracterizar a presença e distribuição de moléculas nos tecidos mineralizados de muitos modelos animais (NANCI, 1999).

A imunocitoquímica pós-inclusão com ouro-coloidal é a ferramenta ideal para o estudo do arranjo da matriz extracelular e da organização dos tecidos mineralizados, locais onde moléculas interagem entre si e com elementos inorgânicos e onde proteínas acumulam-se e minerais se depositam para definir o padrão espacial e temporal da formação dos tecidos mineralizados (McKEE e NANCI, 1996c).

De fato, no presente trabalho, a imunocitoquímica pode estabelecer não somente a distribuição das proteínas OPN e DMP1, mas examinar em detalhes sua relação física com as estruturas teciduais características das dentinas formadas após uma injúria pulpar. A compreensão do significado funcional da presença dessas proteínas em regiões específicas da dentina reacional e reparativa pode contribuir para o entendimento dos mecanismos que regulam a mineralização dentinária e o reparo pulpar, sendo importante para geração de estratégias para o tratamento clínico das lesões pulpares.

Com base no exposto, percebe-se que os dados disponíveis sobre a

formação dos tecidos dentários e as proteínas colágenas envolvidas não são conclusivos, assim como o comportamento das células do epitélio odontogênico e do complexo dentina-polpa a um trauma não é compreendido. O estudo ultra-estrutural associado a técnicas imunocitoquímicas desses tecidos pode indicar uma possível correlação entre o aspecto morfológico e a composição dos diferentes tipos de dentina formada após trauma dentário, relacionando-a com uma célula secretora específica, além de mostrar o papel das proteínas não colágenas como OPN e DMP1 na formação desses tecidos.

2 PROPOSIÇÃO

A literatura disponível sobre o efeito de estímulos externos na amelogênese e na dentinogênese reacional e reparativa é incompleta e não conclusiva. Além disso, o processo pelo qual o epitélio odontogênico e o complexo dentina-polpa são reparados após um trauma dentário não está completamente entendido. O estudo de tais fenômenos e da participação de componentes da matriz na formação desses tecidos é importante e pode trazer subsídios para a compreensão da formação das células “odontoblast-like” e para a caracterização da dentina reacional e da dentina reparativa, esta com muitas características morfológicas similares ao osso primário, formadas após trauma dentário. Além disso, o estudo da localização das proteínas não colágenas como OPN e DMP1 nessas matrizes dentinárias, pode trazer informações adicionais sobre o papel destas proteínas na formação dos tecidos mineralizados.

Assim, com o propósito de avaliar a dinâmica de deposição das proteínas não colágenas sobre a matriz dos tecidos dentários na odontogênese após um trauma dentário e sua relação com as alterações estruturais observadas nestes tecidos, pretende-se avaliar, através de microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão, a estrutura da matriz dentinária formada após injúria pulpar, e por imunocitoquímica, a presença e a distribuição das proteínas OPN e DMP1 nas dentinas fisiológica, reacional e reparativa formadas após indução de um movimento extrusivo sobre incisivos superiores de ratos, em períodos de tempo determinados, bem como o seu efeito sobre o epitélio odontogênico e o esmalte em formação.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios de cuidado aos animais de laboratório (Publicação NIH 85-23, 1985) e autorizados pelo comitê de ética em experimentação animal do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da Universidade de São Paulo, Brasil (Protocolo no 008/03).

Trinta e cinco ratos Ratus norvegicus, Albinus, Wistar, machos, de dois a três meses de idade e com massa corpórea entre 180 a 250 gramas, oriundos do Biotério do ICB, foram escolhidos por seleção aleatória simples. Os ratos foram nutridos com ração sólida moída (Ração peletizada 20 Kg- Nuvital Agropecuária Ltda), excetuando-se as primeiras vinte e quatro horas após o reimplante, e hidratados ad libitum..

Os animais foram divididos em dois grupos. O primeiro (experimental) compreendeu os animais cujo incisivo superior direito foi submetido a um movimento extrusivo de 3 mm, sendo em seguida tais dentes colocados em sua posição original (28 animais). O segundo grupo (controle) foi constituído por dentes cujos incisivos não foram luxados (7 animais).

3.2 Procedimento cirúrgico

Em condições ambientais de temperatura, umidade e luminosidade, os animais foram anestesiados com solução aquosa a 2% de Cloridrato de 2-(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4-H-1,3- tiazina (Rompun®) diluído em Quetamina (Francotar®), via intramuscular, na dosagem de 0,1 ml para cada 100 gramas de massa corpórea.

Após assepsia com polivinilpirrolidona- iodo (Povidine®), a extremidade incisal do incisivo superior direito de cada animal foi desgastada por meio de uma ponta diamantada cilíndrica acoplada a um contra-ângulo (Fig. 1A). A seguir, este dente foi submetido a uma sindesmotomia por meio de um sindesmótomo modificado (Fig. 1B). Em seguida, foi realizada uma extrusão de três milímetros no incisivo superior direito, empregando-se um fórceps no 151 (Colgram Indústria e Comércio Ltda), previamente adaptado para este fim (Fig. 1C,D). Depois, tal dente foi reposicionado, obedecendo à sua posição original, momento no qual foi realizada uma compressão bidigital do rebordo alveolar.

Após o procedimento cirúrgico, em relação à dieta, os animais receberam apenas água ad libitum nas primeiras vinte e quatro horas, sendo, em seguida, adicionalmente alimentados com ração sólida moída por mais sete dias. Depois, esses animais foram nutridos com água e ração sólida peletizada até o seu sacrifício.

3.3 Obtenção da amostra

Os animais foram eutanasiados por “overdose” anestésica após 3, 7, 10, 15, 20, 30 e 60 (quatro animais do grupo experimental e um do grupo controle por período). Depois da eutanásia, a peça foi obtida mediante uma incisão com lâmina de bisturi no 11 na altura da linha média da maxila a partir de um corte com tesoura cirúrgica de ponta romba, tangenciando a face distal dos molares de forma a permitir a separação da maxila direita da esquerda e a obtenção da peça contendo o incisivo superior direito, a qual foi fixada sob irradiação em microondas em uma solução contendo 2% de glutaraldeído e 2,5% de formaldeído (estudo morfológico) ou em solução de 0,1% de glutaraldeído e 4% de formaldeído (estudo imunocitoquímico), ambas tamponadas em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,4. As soluções de formaldeído foram preparadas a partir do paraformaldeído.

A solução fixadora contendo as amostras foi irradiada em um forno de microondas PELCO 3440 a uma temperatura máxima de 37oC. O recipiente com os espécimes foi colocado no centro de uma cuba preenchida com gelo situada na região fria do forno de microondas, enquanto um béquer contendo 300 ml de água e conectado a um recirculador PELCO 3420 LOAD COOLER foi posicionado na região quente (MASSA e ARANA-CHAVEZ, 2000). Estando o microondas calibrado para a potência máxima, a irradiação foi realizada em três ciclos de cinco minutos. A seguir, o material permaneceu na mesma solução fixadora "overnight" a 4oC. Em seguida, com exceção das peças destinadas ao estudo por microscopia eletrônica de varredura (MEV), os demais espécimes foram desmineralizados em uma solução de ácido etileno diamino tetraacético (EDTA) a 4,13%, também sob irradiação com microondas (ARANA-CHAVEZ e NANCI, 2001).

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Figura 1 -

A técnica de extrusão dentária compreende: (A) desgaste da

extremidade incisal, (B) sindesmotomia, (C) extrusão com fórceps

no 151 modificado e (D) confirmação do deslocamento de 3 mm.

3.4 Processamento para microscopia eletrônica de varredura

Depois da adequada dissecação dos incisivos a partir do osso alveolar, o incisivo direito não desmineralizado de cada grupo foi fraturado de forma paralela ao seu longo eixo. Cada fragmento foi imerso em solução de hipoclorito de sódio 2%

colocada em um aparelho de ultra-som (Branson 1210, Danbury, CT, USA) por 30

minutos a fim de remover todo o tecido mole remanescente. As secções foram depois lavadas com água destilada, transferidas para uma solução de etanol 30% e depois desidratadas em concentrações crescentes de etanol. Visando evitar a fratura do material durante a secagem, todas as amostras foram imersas em

hexametildisizilano (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA, USA) por 10 minutos e depois colocadas em uma capela de exaustão para sua evaporação completa. A seguir, os espécimes foram montados sobre um “stub” de alumínio sendo sua superfície pulverizada com ouro em um aparelho Bal-Tec SCD 050 (Bal-Tec SCD 050, Liechtenstein). Os espécimes foram examinados em um microscópio eletrônico de varredura JEOL 6100 (Jeol Ltd, Tokyo, Japan), operado em 10–15 kV.

3.5 Processamento para microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Após descalcificação, os espécimes destinados ao estudo morfológico foram pós-fixados com tetróxido de ósmio a 1% durante duas horas. A desidratação foi realizada a partir da imersão das peças em soluções de concentração crescente de etanol até chegar-se ao etanol absoluto, enquanto a infiltração das amostras foi feita com concentrações crescentes de resina Spurr (morfologia), diluídas em acetona ou com concentrações crescentes de resina L.R. White (imunocitoquímica), diluídas em etanol, a uma temperatura de 4oC. A seguir, cada amostra foi incluída e colocada em estufa por três dias a uma temperatura de 65oC. Após sua polimerização, os blocos foram trimados e cortados em um micrótomo Micron HM 360 (Zeiss®). Assim, foram obtidos cortes semi-finos que foram corados com solução alcoólica de azul de toluidina a 1% e observados ao microscópio de luz, com o intuito de selecionar a área a ser cortada no ultramicrótomo. Os cortes ultrafinos de 80 nm de espessura foram montados em telas de níquel de 200 "meshes". As secções destinadas ao estudo imunocitoquímico foram adicionalmente incubadas com os anticorpos a serem descritos posteriormente.

Depois de montados em uma tela e contrastados por dez minutos em uma solução alcoólica de acetato de uranila a 2% e em outra de citrato de chumbo a 0,5% por mais cinco minutos, as secções foram examinadas e fotografadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 100 CX II ou JEOL 1010.

3.6 Imunocitoquímica pós-inclusão com ouro coloidal

Tabela 1- Anticorpos empregados na imunocitoquímica para OPN e DMP1.

Diluição Tempo

de Referências

Anticorpo Abreviação

Incubação

Anti-osteopontina de rato (Hosp.: galinha) OPNy

1:150 5 hr

NANCI

et al.,

1996

Anti-proteína da matriz dentinária-1 de DMP-1 1:10 3 hr

MASSA

rato (Hosp.: coelho)

et al.,

2005

Os cortes ultrafinos não osmicados foram processados para imunocitoquímica para as proteínas OPN e DMP-1, ambas usando anticorpos e condições resumidas na tabela 1. As telas incubadas com anticorpo obtido na galinha (OPNy) foram incubadas adicionalmente com anticorpo secundário de coelho para IgG de galinha diluído de 1:2000 por uma hora. Independente do anticorpo utilizado, os sítios com reação antígeno-anticorpo foram revelados pela incubação com proteína A-ouro coloidal por trinta minutos. Entre as incubações, as telas foram lavadas e bloqueadas com PBS 0,01M pH 7,2 e solução de ovalbumina a 1% em PBS 0,01M

pH 7,2 por 15 minutos, respectivamente. Após incubação com proteína A-ouro coloidal, os espécimes foram irrigados com PBS e água destilada. Como controle das imunomarcações, alguns espécimes do grupo experimental e do grupo controle foram incubados somente com o complexo proteína A-ouro coloidal sem terem sido expostos aos anticorpos primário e secundário. Além disso, os achados foram confirmados pelo fato das incubações das secções ultrafinas com algumas regiões sabidamente imunoreativas para a proteína OPN não exibirem partículas de ouro no esmalte, na dentina fisiológica e nas mitocôndrias (Fig. 2A) e das secções ultrafinas incubadas com a proteína DMP-1 não mostrarem partículas de ouro no esmalte ou nas mitocôndrias (Fig. 2B).

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Figura 2 -

Em A, eletromicrografia mostrando matriz de esmalte sem

partículas de ouro-coloidal para OPN. 41.670X. Em B,

eletromicrografia evidenciando área de junção amelodentinária

com imunomarcação positiva para DMP1 apenas na matriz

dentinária. Notar que as partículas de ouro-coloidal (setas) estão presentes apenas na matriz de dentina fisiológica. 28.000X. Me,

matriz de esmalte; D, dentina fisiológica.

4 RESULTADOS

Os resultados descrevem as características encontradas em duas áreas distintas dos incisivos luxados em períodos determinados. A primeira região a ser estudada foi a interface dentina-polpa localizada entre 4 e 7 mm a partir da extremidade apical, com especial atenção para a observação ultra-estrutural dos odontoblastos originais remanescentes e das células “odontoblast-like”, bem como suas matrizes correspondentes. O epitélio odontogênico da extremidade mais apical, particularmente a matriz de esmalte e os ameloblastos relacionados, também foram examinados (Fig. 3).

Ainda que alguns vasos sangüíneos dilatados ou pequenas áreas de

hemorragias tenham sido observados na polpa dentária, nenhuma área de necrose ou infecção foi detectada neste tecido.

4.1 Morfologia

4.1.1 Esmalte

A resposta do epitélio odontogênico ao trauma extrusivo foi muito variável. Em algumas amostras, o epitélio odontogênico mais apical se degenerou permitindo contato da matriz de esmalte com o ligamento periodontal. Tal matriz foi menos basófila quando comparada com aquela revestida por ameloblastos e situada cervicalmente (Fig. 4A). Enquanto alguns espécimes mostraram uma camada íntegra de ameloblastos com aparente preservação de sua função secretora, em outras amostras, a camada de ameloblastos estava danificada e mostrava alguns ameloblastos degenerados (Fig. 4B). Em outros espécimes, foi observada desorganização do epitélio odontogênico com diminuição do comprimento e perda do alinhamento dos ameloblastos, aumento dos espaços intercelulares e desaparecimento prematuro do estrato intermediário. A observação de acúmulos de matriz basófila semelhante ao esmalte entre a camada de ameloblastos e a camada papilar foi freqüente (Fig. 4C). Mesmo alterados, muitos dos ameloblastos preservaram o processo de Tomes e secretaram uma matriz de espessura irregular e com áreas de maior ou menor basofila (Fig. 4D).

Um achado comum nos cortes semi-finos foi a presença de grupos de células com aspecto granuloso no ligamento periodontal relacionado com epitélio odontogênico nos últimos períodos experimentais. Especialmente nas amostras de 10 ou 20 dias, onde parte do epitélio odontogênico havia sido perdida, áreas similares apresentavam cordões de células epiteliais, algumas delas intensamente basófilas (Fig. 4E). Aos 60 dias, o exame das mesmas regiões mostrou a presença de inúmeros grupos celulares menores, porém com um aspecto granuloso (Fig. 4F).

Nesse último período, tais estruturas estavam sempre relacionadas com áreas de esmalte maduro que não estavam revestidas por ameloblastos.

O exame ultra-estrutural desses grupos celulares no período de 60 dias revelou a presença de células com aparência de macrófagos contendo muitas estruturas esféricas de variada elétron-opacidade preenchendo todo o seu citoplasma (Fig.5).

4.1.2 Dentina

Por serem dentes que erupcionam continuamente, onde sua porção apical apresenta células que proliferam e se diferenciam por toda a vida do animal, no incisivo do rato não existe dentina primária ou secundária, mas apenas a dentina fisiológica. Assim, como conseqüência, o termo dentina fisiológica é empregado para designar a dentina formada antes do trauma, enquanto os termos dentina reacional e dentina reparativa são utilizados para as matrizes formadas por odontoblastos primários ou por outras células da polpa como resposta ao trauma mecânico, respectivamente. As características da matriz dentinária e das células relacionadas com a interface dentina-polpa são descritas a seguir em função dos períodos experimentais.

No primeiro período examinado, 3 dias após a extrusão, a maioria das áreas mostravam a interface dentina-polpa com aspecto normal. Em algumas regiões, entretanto, a camada de odontoblastos mostrou sinais de desorganização e degeneração, enquanto outras zonas mostraram redução do número de células ou desaparecimento da camada odontoblástica (Fig. 6A). Muitas vezes, os odontoblastos em degeneração estavam superpostos a células conjuntivas fusiformes intensamente coradas por azul de toluidina nos cortes semi-finos (Fig. 6B).

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Figura 3 -

Secção de um incisivo superior do grupo controle evidenciando as

áreas avaliadas pelo estudo. Notar a matriz de esmalte e o epitélio odontogênico (Eo) na extremidade mais apical e a matriz de

dentina (D) e as células associadas localizadas entre 4 e 7 mm

acima da extremidade apical. P, polpa dentária.

Figura 4 -

Em A, fotomicrografia mostrando uma região de matriz de esmalte

mais apical (asterisco) exposta ao ligamento periodontal. Notar que sua matriz é menos básofila quando comparada com àquela situada

cervicalmente e revestida por ameloblastos. 265X. Em B,

fotomicrografia evidenciando área de epitélio odontogênico com

preservação de sua função secretora e degeneração focal (setas) de alguns ameloblastos. 100X. Em C, fotomicrografia mostrando região

de epitélio odontogênico apresentando modificação da morfologia e

do arranjo dos ameloblastos. Observar acúmulos basófilos (cabeça de seta) entre a camada de ameloblastos e a camada papilar. 530X. Em

D, fotomicrografia mostrando áreas de matriz de esmalte com

espessura irregular, com zonas de maior ou menor basofilia,

distribuídas por toda a matriz. 530X. Em E, fotomicrografia

evidenciando agrupamentos celulares oriundos do epitélio

odontogênico e separados do epitélio que reveste o esmalte maduro.

Notar uma célula intensamente basófila (seta) do epitélio

odontogênico assumindo um aspecto granuloso. 530X. Em F,

fotomicrografia mostrando pequenos grupos ou células isoladas

(setas) exibindo aspecto granuloso no ligamento periodontal de um

espécime, após 60 dias do trauma extrusivo. 265X. Lp, ligamento

periodontal; Amel, ameloblastos; Me, matriz de esmalte; E, esmalte mineralizado; D, dentina fisiológica; P, polpa dentária. Azul de

toluidina.

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Figura 5 -

Eletromicrografia mostrando macrófago (Mac) com muitas

estruturas esféricas (setas) de variada elétron-opacidade em

seu citoplasma, 60 dias após realização do trauma extrusivo.

Lp, ligamento periodontal. 4.800X.

Figura 6 -

Em A, fotomicrografia mostrando região sem odontoblastos (asterisco) com exposição da superfície dentinária ao tecido pulpar ao lado de uma interface dentina-polpa revestida por odontoblastos originais

exibindo aspecto morfológico normal, 3 dias após a indução da

extrusão. 265X. Em B, fotomicrografia evidenciando uma zona onde

os odontoblastos em degeneração (seta) estavam superpostos a

células conjuntivas fusiformes (cabeça de seta) intensamente coradas por azul de toluidina, 3 dias após a injúria pulpar. 350X. D, dentina fisiológica; O, odontoblastos originais; P, polpa dentária. Azul de toluidina.

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O exame ultra-estrutural dessas áreas mostrou células arredondadas de citoplasma elétron-opaco com retículo endoplasmático bem desenvolvido que se relacionavam com células fusiformes, talvez odontoblastos originais (Fig. 7A). Essas áreas quando examinadas tardiamente, apresentavam células semelhantes a macrófagos contendo estruturas de variada elétron-opacidade em seu citoplasma, compatível com corpos apoptóticos fagocitados (Fig. 7B).

Nas áreas de dentina exposta, ou seja, nas regiões em que os odontoblastos originais foram destruídos, foi observado o aparecimento de células conjuntivas de morfologia variada sobre a dentina fisiológica, algumas delas com organelas de síntese desenvolvidas e associadas a uma camada semelhante a uma pré-dentina (Fig. 8A). Outras células eram imaturas, possuíam retículo endoplasmático pouco desenvolvido e não estavam associadas a uma camada de pré-dentina (Fig. 8B). Em outras áreas, foi observada uma camada de células semelhantes aos osteoblastos, dotadas de delgados prolongamentos citoplasmáticos, os quais se insinuavam para uma matriz bastante irregular de pré-dentina (Fig. 8C). A análise em detalhes de sua estrutura permitiu observar a presença de um citoplasma escasso com poucas organelas de síntese, mas junções celulares bem definidas (Fig. 8D).

Em algumas regiões, os odontoblastos originais não se degeneraram e iniciaram deposição abrupta de matriz de pré-dentina que envolveu hemácias, possivelmente liberadas de vasos sangüíneos rompidos durante o movimento extrusivo (Fig. 9).

Decorridos 7 dias do trauma extrusivo, as superfícies dentinárias estavam revestidas por células colunares altas que se alternavam com células de morfologia variável (Fig. 10). A análise ultra-estrutural das células colunares altas mostrou retículo endoplasmático rugoso desenvolvido, além de prolongamentos desprovidos de organelas que se insinuavam para a matriz. Apesar do amplo espaço intercelular, tais células estavam relacionadas entre si por meio de inúmeras junções celulares (Fig. 11A) do tipo “gap” (Fig. 11B e Fig 12A) e de adesão (Fig. 12B), as quais estavam também presentes entre o pólo basal dessas células e as células da região perivascular (Fig. 12C).

Algumas células de morfologia variável eram cúbicas, com cisternas bem dilatadas do retículo endoplasmático rugoso e relacionavam-se com as células vizinhas por meio de junções celulares. A matriz de pré-dentina associada com essas células tinha uma estrutura irregular com fibrilas colágenas dispostas em diversas direções (Fig. 13). Em algumas áreas dessa pré-dentina, grupos de fibrilas colágenas paralelas foram depositados em torno de áreas contendo vários prolongamentos celulares (Fig. 14A). Esse arranjo proporcionou a formação de grandes espaços interfibrilares (Fig. 14B). Na interface desse tecido com a polpa dentária, foram observadas células com vários prolongamentos celulares que se insinuavam para a dentina se ramificando profusamente no interior da matriz (Fig.

14C).

Muitas células colunares baixas exibiram deslocamento do núcleo do pólo basal para o apical. Algumas dessas células perderam o contato com a camada de células adjacentes (Fig. 15A) e tornaram-se completamente envolvidas pela matriz, com o avanço da secreção. Em outros casos, células tornaram-se inclusas na interface entre dentina reacional e dentina reparativa que estavam sendo formadas simultaneamente (Fig. 15B). O estudo ultra-estrutural das células com inversão de polaridade mostrou que o retículo endoplasmático rugoso e a maior parte das mitocôndrias estavam localizados no pólo basal, região destinada originalmente ao núcleo (Fig. 16).

Decorridos 10 dias depois da extrusão, em algumas áreas, houve deposição de uma matriz de dentina atubular de espessura suficiente para ser identificada nos cortes semi-finos corados por azul de toluidina. Tal matriz esteve revestida por uma camada única de células cubóides ou colunares baixas, correspondendo, portanto, a uma dentina reparativa. Ao seu lado, existiam áreas adjacentes de dentina mais organizada, com acentuado desvio dos túbulos dentinários e revestidas por uma camada pseudo-estratificada de odontoblastos originais, correspondendo à dentina reacional. Em geral, a espessura da dentina reacional foi sempre maior àquela observada na dentina reparativa em uma mesma secção (Fig. 17). No estudo ultra-estrutural, a interface entre as dentinas fisiológica e reparativa não foi muito nítida.

Sua identificação foi possível em virtude da ausência dos túbulos dentinários e do arranjo aleatório dos grupos de fibrilas colágenas na matriz de dentina reparativa (Fig. 18A), além da presença de inclusões celulares e de células cubóides em sua interface com a polpa dentária (Fig. 18B). Em geral, as células inclusas apresentavam um citoplasma escasso com reduzido número de organelas citoplasmáticas, sendo muitos semelhantes aos osteócitos (Fig. 18C).