'Expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e do retinoblastoma e pesquisa do HPV em carcinomas... por Arlindo Tadeu Teixeira Aburad - Versão HTML

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ARLINDO TADEU TEIXEIRA ABURAD

EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS CICLINA D1, C-JUN E DO

RETINOBLASTOMA E PESQUISA DO HPV EM CARCINOMAS

EPIDERMÓIDES BUCAIS

São Paulo

2006

Arlindo Tadeu Teixeira Aburad

Expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e do retinoblastoma e pesquisa do HPV em carcinomas epidermóides bucais

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da

Universidade de São Paulo, para obter o título de

Doutor pelo Programa de Pós Graduação em

Odontologia.

Área de Concentração: Patologia Bucal

Orientadora: Prof. Dra. Suzana Cantanhede Orsini

Machado De Sousa

São Paulo

2006

Catalogação-na-Publicação

Serviço de Documentação Odontológica

Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo

Aburad, Arlindo Tadeu Teixeira

Expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e do retinoblastoma e pesquisa do HPV em carcinomas epidermóides bucais / Arlindo Tadeu Teixeira Aburad; orientadora Suzana Cantanhede Orsini Machado De Sousa. --

São Paulo, 2006.

p.: fig., tab.; 30 cm.

Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

Área de Concentração: Patologia Bucal) -- Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo.

1. Carcinoma epidermóide bucal 2. ciclina D1 3. c-jun 4. proteína do retinoblastoma 5. imunoistoquímica 6. HPV

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE E COMUNICADO AO AUTOR A REFERÊNCIA DA CITAÇÃO.

São Paulo, ____/____/____

Assinatura:

E-mail: aburad@usp.br

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aburad A. Expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e do retinoblastoma e pesquisa do HPV em carcinomas epidermóides bucais [Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2006.

São Paulo, ___/___/___

Banca examinadora

1) Prof(a). Dr(a).: ________________________________________________________

Titulação: _____________________________________________________________

Julgamento: _________________ Assinatura: ________________________________

2) Prof(a). Dr(a).: ________________________________________________________

Titulação: _____________________________________________________________

Julgamento: _________________ Assinatura: ________________________________

3) Prof(a). Dr(a).: ________________________________________________________

Titulação: _____________________________________________________________

Julgamento: _________________ Assinatura: ________________________________

4) Prof(a). Dr(a).: ________________________________________________________

Titulação: _____________________________________________________________

Julgamento: _________________ Assinatura: ________________________________

5) Prof(a). Dr(a).: ________________________________________________________

Titulação: _____________________________________________________________

Julgamento: _________________ Assinatura: ________________________________

DEDICO ESTE TRABALHO

A Deus.

À minha alma gêmea, Débora Pinho, pois sem ela, simplesmente, eu não teria conseguido.

Especialmente à minha filha Aline, pois todo colorido que eu busco na vida ela, juntamente com a mãe, trouxe.

Aos meus pais, Carlos e Rosa, pelo amor, carinho e, principalmente, tempo que dedicaram e dedicam a mim.

Aos meus irmãos Quirino, Carlinhos e Adib. Graças a eles pude ter uma infância extremamente feliz e sei verdadeiramente o que é uma amizade.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À Edna Toddai, “in memorian”, que se eternizou passando seus conhecimentos aos alunos da Patologia Bucal, que futuramente repassarão esses mesmos ensinamentos aos seus estudantes. Agradeço também pela ajuda fundamental neste trabalho.

À minha orientadora, Profa. Dra. Suzana Cantanhede Orsini Machado de Sousa, pela orientação neste trabalho.

Aos professores Ney Soares de Araújo e Vera Cavalcante de Araújo.

A Ailton Segura, amigo querido e maior expoente intelectual que já conheci.

A Artur Aburad, primo e amigo que desde de criança eu admirava.

Aos professores da disciplina de Patologia Bucal, Andréa Mantesso; Décio dos Santos Pinto Jr; Fábio D. Nunes; Karen L. Ortega; Marina H.C.G. Magalhães e Marília T. Martins; pelos conhecimentos passados.

Ao professor Moacir Domingos Novelli pelas agradáveis conversas, pelo memorial por ele escrito que permite reflexões sobre a vida acadêmica e pelos recursos tecnológicos indispensáveis fornecidos à confecção desta tese.

Às atenciosas Bia, Gleice, Nair, Graça, Néia, Patrícia e Zilda, pela boa vontade e atenção que sempre tiveram comigo.

Às funcionárias da Comissão de Pós-Graduação da FOUSP: Cátia, Nair e Alessandra.

À Elisa pela amizade e carinho que sempre teve comigo.

Aos amigos Alexandre Borba e Fábio Lima, amigos de graduação, irmãos de vida e companheiros de luta na grande São Paulo.

A Filipe Modolo Siqueira e Sérgio Melo Alves Jr. pela amizade e ajuda.

A todos meus prezados colegas de turma na pós-graduação e valiosos amigos: Adriano Pires, Alexander Salvoni, Alexandre Fraige, Adriana Neves, Aymman Nassif, Cristane Furuse, Elena Riet, Eveline Turatti, Flávia, Helder, Hu, Cury, Camila, Carolina Capuano, Katiucha, Marcelo Zamunaro, Márcia Gorish, Regina Dorta, Renata Tucci, Rogério Castilho, Vanessa Veltrini, Adriana Etges, Fabrício Bitu, Daniela Bueno, Fabrício Passador, Cláudia Cazal, Felipe Salles, Luciana Matizonkas, Nathalie Rezende, Cristiane Squarize, Juliana, Tatina, Karen, Kivia, Lineu, Marina, Michelly, Vanessa, Yonara, Carlos Barboza, Paulo, Paulo Braz, Patrícia, Rhoner, Thaís. Aos que aqui não estão, o sentimento é o mesmo.

Aos alunos de graduação Livia Lamunier de Abreu Camargo e Marco Aurélio Alves Feitosa Filho, que se tornaram amigos, pela agradável companhia e convivência.

Aos Professores Ricardo Mesquita e Adriana Etges pelos conselhos que sempre me motivaram.

À CAPES pela concessão da minha bolsa e à FAPESP pelo financiamento do projeto 04-06555-5 da disciplina de patologia bucal da FOUSP.

Aburad A. Expressão das proteína ciclina D1, c-jun, retinoblastoma e pesquisa do HPV

em carcinoma epidermóide bucal [Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2006.

RESUMO

No Brasil, como no mundo, o carcinoma epidermóide bucal está entre os dez tipos mais comum de câncer e acomete mais de 13 mil pessoas por ano. Apesar de ser um sério problema devido a sua morbidade e mortalidade, alguns casos desta doença têm um comportamento biológico menos agressivo. A proteína ciclina D1, depois que forma complexos com as proteínas CDK4 e CDK6, tem como principal função fosforilar a proteína Retinoblastoma. Após sua fosforilação, a proteína libera um fator de transcrição, o E2F, que leva a célula à progressão da fase G1 para fase S do ciclo celular. A proteína c-jun, que faz parte do fator de transcrição AP-1, tem participação ativa no ciclo celular, principalmente durante a transcrição da fase G0 a G1. O gene retinoblastoma é um supressor de tumor. Este gene codifica uma fosfoproteína nuclear, que recebe o mesmo nome. Essa proteína regula o ciclo celular através de múltiplas funções. Também regula outros processos que afetam a proliferação celular, a diferenciação terminal e a apoptose. O HPV é um vírus de DNA que é encontrado em vários tipos de câncer e é o principal agente etiológico do carcinoma de colo uterino.

Este trabalho comparou a expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e do retinoblastoma em carcinomas epidermóides de baixo e alto grau de malignidade e tentou analisar se o HPV é um fator etiológico desta neoplasia. Apesar das lesões de baixo grau de malignidade expressarem as proteínas num maior número de células que as lesões de alto grau, só houve diferença estatística, entre os dois grupos estudados, para a proteína do retinoblastoma. Não foi encontrado o DNA do HPV em nenhum dos casos estudados. De acordo com este trabalho e com a literatura, a proteína do retinoblastoma é expressa em um número menor de células em carcinomas epidermóides bucais mais agressivos e o HPV não é um agente etiológico de todos os casos desta doença.

Palavras-chaves: Carcinoma epidermóide bucal – ciclina D1 – c-jun – proteína do retinoblastoma – HPV – imunoistoquímica – PCR.

Aburad A. Expression of cyclin D1, c-jun, retinoblastoma protein and research of HPV in oral scamous cell carcinoma [Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2006.

ABSTRACT

In Brazil, as in the world, the oral squamous cell carcinoma is among the ten more common types of cancer e affects more than 13 thousand of people by year. Even though it is a serious problem due to its morbidity and mortality, some cases of this disease have a less aggressive biological behavior. The cyclin D1 protein after it forms complexes with the CDK4 and CDK6 proteins has as main function phosphorylate the Retinoblastoma protein. After its prosphorylation, the protein releases a transcription factor, the E2F, that leads the cell to the progression from the phase G1 to the phase S

of the cell cycle. The c-jun protein, that is part of the transcription factor AP-1, has active participation in the cell cycle, mainly during the transcription from the phase G0 to G1.

The retinoblastoma gene is a tumour suppressor. This gene codifies a nuclear phosphoprotein that receives the same name. This protein regulates the cell cycle through multiple functions. It also regulates other processes that affect the cell proliferation, the terminal differentiation and apoptosis. The HPV is a DNA virus that is found in many types of cancer and is the main etiological agent of the cervical cancer.

This study compared the protein expression of the cilin D1, c-jun and retinoblastoma in low and high grade squamous cell carcinoma and tried to analyze if the HPV is a etiological factor for this neoplasm. In spite of the low grade of malignancy lesions express the protein in a greater number of cells than in the high grade lesion, there only was statistical difference, among the two studied groups, for the retinoblastoma protein.

It was not found DNA of the HPV in any of the studied cases. According with this study and with the literature the retinoblastoma protein is expressed in a lower number of cells in the more aggressive oral squamous cell carcinomas and the HPV is not the etiological agent in all of the cases of this disease.

Key-words: Oral squamous cell carcinoma – cyclin D1 – c-jun – retinoblastoma protein –

HPV – Immunohistochemistry – PCR.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 5.1 – Aspectos histológicos do carcinoma epidermóide bucal de alto grau de malignidade............................................................................................63

Figura 5.2 – Aspectos histológicos do carcinoma epidermóide bucal de baixo grau de malignidade............................................................................................63

Figura 5.3 – Expressão da ciclina D1.............................................................................64

Figura 5.4 – Expressão da c-jun.....................................................................................64

Figura 5.5 – Expressão da pRb......................................................................................65

Figura 5.6 – Gel de Agarose mostrando a ausência de amplificação para o HPV nos casos de carcinoma epidermóide estudados, exceto para controle

positivo.................................................................................................65

Figura 5.7 – Gel de Agarose mostrando a amplificação do gene constitutivo D2S119................................................................................................65

Gráfico 5.1 – Número médio de células positivas para cada proteína estudada...........62

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1 – Dados epidemiológicos dos pacientes estudados.....................................43

Tabela 4.2 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com o sexo.................45

Tabela 4.3 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com a cor da pele.......45

Tabela 4.4 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com a localização anatômica das lesões............................................................................45

Tabela 4.5 – Sistema de gradação histológica...............................................................47

Tabela 5.1 – Lesões de baixo grau de malignidade. Número e percentual de células marcadas e grau histológico de malignidade (GHM)...............................60

Tabela 5.2 – Lesões de alto grau de malignidade. Número e percentual de células marcadas e grau histológico de malignidade (GHM)..............................61

Tabela 5.3 – Mostrando o número médio de células marcadas para cada proteína estudada dividido pelos grupos analisados............................................62

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AP-1

Ativador da proteína 1

BSA

Sigla em inglês para albumina de soro bovino

C-

Controle negativo

C+

Controle positivo

CDK

Sigla em Inglês para quinases dependentes de ciclina

CD1

Proteína ciclina D1

DAB

Diaminobenzidina

DNA

Sigla em inglês para ácido desoxirribonucléico

dNTP

Solução de 2’-desorribonuleotídeo 5’-trifosfatado: dATP, dTTP,

dCTP e dGTP

E

Sigla em Inglês para early

EDTA

Etileno-diaminotetracético

FOUSP

Faculdade de Oodntologia da Universidade de São Paulo

HCL

Ácido clorídrico

HPV

Papiloma Vírus Humano

INCA

Instituto Nacional do Câncer

KCl

Ácido clorídrico

L

Sigla em Inglês para late

LM

Marcador de pares de base (Low Mass)

Lido

Laboratório de Informática Dedicado a Odontologia

MgCl2

Cloreto de Magnésio

pb

Pares de bases

PCR

Sigla em Inglês para reação em cadeia da polimerase

PRb

Proteína do retinoblastoma

Rpm

Rotação por minuto

SDS

Sigla em Inglês para dodecil sulfato de sódio

TAE

Solução de Tris, ácido acético glacial e EDTA

TBST

Solução salina tamponada TRIS-HCl acrescida de tween

Tris

Tris-hidroxi-metil-aminometano

Tri-HCl

Tris-hidroxi-metil-aminometano/Ácido clorídrico

USP

Universidade de São Paulo

UV

Ultra violeta

LISTA DE SÍMBOLOS

%

Valores percentuais

ºC

Graus Celsius

g

Gravidade

G0

“Gap”/ intervalo de latência celular

G1

“Gap”/ Intervalo após a mitose e antes da síntese celular

µl

Microlitro

ml

Mililitro

mM

Milimolar

pH

Medida do potencial hidrogeniônico

M

Medida de molaridade

x

vezes

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................20

2 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................22

2.1 Carcinoma epidermóide bucal..............................................................................22

2.2 Ciclina D1................................................................................................................23

2.3 c-Jun........................................................................................................................28

2.4 Retinoblastoma.......................................................................................................32

2.5 HPV..........................................................................................................................35

3 PROPOSIÇÃO........................................................................................................41

4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................42

4.1 Seleção dos casos e análise morfológica............................................................42

4.1.1 Dados epidemiológicos dos pacientes estudados.................................................43

4.2 Gradação histológica de malignidade..................................................................46

4.3 Técnica de imunoistoquímica...............................................................................47

4.3.1 Imunoistoquímica da proteína ciclina D1...............................................................48

4.3.2 Imunoistoquímica da proteína c-jun.......................................................................49

4.3.3 Imunoistoquímica da proteína do retinoblastoma..................................................50

4.4 Detecção de DNA de HPV por PCR.......................................................................50

4.4.1 Preparo dos cortes para os casos emblocados em parafina e digestão enzimática

........................................................................................................................................50

4.4.2 Extração do DNA...................................................................................................52

4.4.3 PCR.......................................................................................................................52

4.5 Análise quantitativa da expressão das proteínas ciclina D1, c-jun e proteína do retinoblastoma...............................................................................................................54

4.6 Análise estatística...................................................................................................55

5 RESULTADOS........................................................................................................56

5.1 Aspectos histológicos do carcinoma epidermóide bucal...................................56

5.2 Expressão imunoistoquímica da ciclina D1..........................................................56

5.3 Expressão imunoistoquímica da c-jun..................................................................57

5.4 Expressão imunoistoquímica da pRb...................................................................58

5.5 Análise de variância................................................................................................59

5.6 Amplificação para o HPV........................................................................................59

6 DISCUSSÃO............................................................................................................66

7 CONCLUSÕES.......................................................................................................77

REFERÊNCIAS..........................................................................................................78

ANEXO A.....................................................................................................................88

20

1 INTRODUÇÃO

O câncer atualmente é a segunda causa de morte mais comum no Brasil e no mundo. As doenças cardiovasculares, que matam cerca de 17,5 milhões de pessoas no mundo por ano, ficam em primeiro lugar. O Instituto Nacional do Câncer (BRASIL

2006) estima que, neste ano, ocorram 467.440 novos casos de câncer no Brasil. Do total, 13.470 serão especificamente de boca: 10.060 em homens e 3.410 em mulheres. Aproximadamente 90% dos casos devem ser de carcinoma epidermóide.

O carcinoma epidermóide é o câncer de boca mais comum. Além dos fatores etiológicos reconhecidos e amplamente estudados, como o fumo e o álcool, acredita-se que outros agentes possam ajudar no desenvolvimento dessa doença.

Afinal, muitas pessoas que fumam e ingerem bebida alcoólica com freqüência não desenvolvem esse câncer. Há estudos que comparam a presença dos fatores etiológicos com a imunoexpressão de algumas proteínas sintetizadas durante o ciclo celular. As proteínas ciclina D1 (cD1), c-jun e a proteína do retinoblastoma (pRb) são expressas quando a célula está em divisão. Essas proteínas têm a expressão alterada quando há transformação maligna. Alterações na expressão dessas proteínas podem indicar que o tumor está em estágio avançado e suscitar um pior prognóstico.

No início da década de 80, pesquisadores começaram a investigar se o Papiloma Vírus Humano (HPV), a exemplo do que ocorre nos carcinomas cervicais e anogenitais, desempenharia algum papel no aparecimento do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (SYRJANEN et al., 1983). Porém, apesar dos avanços tecnológicos nas últimas décadas, principalmente nas técnicas de biologia 21

molecular, ainda não está comprovado que o HPV é um fator etiológico do câncer de boca.

Neste trabalho, pesquisou-se a expressão das proteínas cD1, c-jun e pRb.

Também foi investigada a presença do HPV em carcinoma epidermóide bucal pela técnica de PCR.

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Carcinoma epidermóide bucal

O câncer de boca gera um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Ele é, juntamente com o carcinoma de laringe, a sexta neoplasia maligna mais freqüente nos seres humanos. Representa 4% de todos os tipos de câncer e 2% das mortes por essa doença (ARAÚJO-FILHO et al., 1998; PARKIN; PISANI; FERLAY, 1993; PARKIN et al., 1993). Os hábitos de fumar, de mascar betel e de consumir excessivamente bebidas alcoólicas destiladas são os principais agentes etiológicos dessa patologia (CASIGLIA; WOO, 2001). Em países em

desenvolvimento, como a Índia e o Sri Lanka, onde é hábito mascar betel, o carcinoma epidermóide de boca é o tipo mais comum de câncer e significa mais de 40% de todas as neoplasias malignas (JOHNSON, 1991). No entanto, na França, na Europa central e no Japão também há altas taxas de incidência (FRANCESCHI et al., 2000; JOHNSON, 1991).

Há dados que sugerem que outros fatores têm importante participação no aparecimento da neoplasia, já que apenas um grupo de pessoas com esses vícios a desenvolvem (MILLER et al., 2001). Por outro lado, está comprovado que 80% das pessoas que têm o carcinoma epidermóide bucal fumam e/ou ingerem bebidas alcoólicas destiladas habitualmente.

Estima-se que, no mundo inteiro, mais de 400.000 casos de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço ocorram anualmente (FERLAY; PIZZANI; 23

PARKIN, 2001). No Brasil, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer, o câncer de boca é a oitava neoplasia mais comum em homens e a nona em mulheres (BRASIL, 2006). Entre as neoplasias malignas de boca, o carcinoma epidermóide representa mais de 90% das lesões malignas que se desenvolvem nessa região (ARAÚJO-FILHO et al., 1998). O carcinoma epidermóide pode ocorrer em qualquer parte da boca. Mas há maior freqüência na língua e no assoalho bucal. Essas regiões são grandes facilitadoras da disseminação dos carcinomas em linfonodos regionais e órgãos distantes (MILLON; CASSISI; MANCUSO, 1994).

A transformação maligna da célula ocorre em várias etapas, numa seqüência de acontecimentos genéticos importantes. Acumulam-se aproximadamente na célula de seis a oito mutações. Essas alterações genéticas se dão em oncogenes dominantes ou em genes supressores de tumor. As transformações em genes, que mantêm a estabilidade genética celular, colaboram para a alteração maligna da célula (HANAHAN; WEINBERG, 2000; LOEB, 2001).

O diagnóstico do câncer bucal deve ser precoce, pois sua evolução natural é rápida. Em um estágio avançado, o paciente pode ficar com seqüela estética ou funcional no aparelho estomatognático ou até morrer (KOWALSKI; CARVALHO, 2001). A radioterapia, a quimioterapia e a reconstrução cirúrgica tiveram significantes avanços nas últimas décadas, mas o prognóstico não se alterou e a sobrevida dos pacientes é de, no máximo, cinco anos em aproximadamente 50%

dos casos (HOFFMANN et al., 2005) – porcentagem ainda pequena, principalmente se comparada a outros tipos de neoplasia, como os carcinomas de mama, cólon, reto, rim e melanomas (TODD; DONOFF; WONG, 1997).

24

2.2 Ciclina D1

As ciclinas são proteínas do ciclo celular das células eucarióticas. Sabe-se que essas proteínas têm grande participação no desenvolvimento de várias neoplasias humanas (MOTOKURA; ARNOLD, 1993; MURRAY; KIRCHNER, 1989).

Essas proteínas são chamadas de ciclinas por apresentar concentrações variadas durante o ciclo celular. São conhecidos oito tipos de ciclinas humanas: A, B, C, D, E, F, G e H. A ciclina D tem três subtipos – D1, D2 e D3 –, possui uma meia-vida de aproximadamente 38 minutos e é extremamente instável (GOODER et al., 1997). A ciclina D1 forma complexos com a CDK4 e a CDK6. A função principal desses complexos é fosforilar a proteína retinoblastoma. Após sua fosforilação, a proteína libera um fator de transcrição, o E2F, que leva a célula à progressão da fase G1

para a fase S do ciclo celular (CHEN et al., 1999; GOODER et al., 1997). Estudos experimentais demonstram que a ciclina D1 pode funcionar como oncogene, cooperando com outros genes na transformação celular (KUO et al., 1999).

Na tentativa de classificá-la como um marcador biológico indicador de prognóstico, a ciclina D1 já foi objeto de estudo em carcinomas de vários sítios corporais. Sua presença está associada a um pior prognóstico, pois os tumores que a sintetizam em excesso são mais agressivos e invasivos (MASUDA et al., 1996; MATE et al., 1996; SHIN et al., 1997).

Bianchi et al. (1993) notaram, em modelos experimentais realizados em ratos, que a ciclina D1 estava superexpressa em carcinoma epidermóide de pele. Eles perceberam que, em estágios pré-malignos, os níveis de ciclina D1 eram normais.

Porém, em estágios avançados, a ciclina D1 exibia superexpressão. Os autores 25

sugeriram que a alteração na expressão da ciclina D1 poderia ter um papel crítico no desenvolvimento de carcinomas epidermóides de pele de rato.

A ciclina D1, muitas vezes, é superexpressa em casos de carcinoma de grandes células de pulmão. Mate et al. (1996) estudaram sua ocorrência em 56

casos dessas lesões e observaram que 24 (42,8%) apresentavam expressão aumentada. Eles compararam a expressão da ciclina D1 com o Ki-67 para observar a taxa de proliferação celular. Os autores notaram que a taxa de proliferação celular estava associada à expressão da ciclina D1. Outro aspecto do trabalho é que a expressão da ciclina D1 foi totalmente ausente nas áreas de formação de pérolas córneas celular, enquanto nas áreas indiferenciadas essa proteína ficou mais expressa.

Em carcinomas de cabeça e pescoço, a superexpressão da ciclina D1 pode indicar um pobre prognóstico. Michalides et al. (1995) constataram que nessas lesões o prognóstico é mais pobre em tumores com superexpressão dessa proteína.

Os autores avaliaram 47 casos e encontraram superexpressão em 30. Nesses casos com superexpressão, eles observaram que o número de recorrência foi maior em um intervalo menor de tempo. Também notaram que 47% não apresentaram recorrência em cinco anos, enquanto nos casos negativos essa taxa foi de 80%. A sobrevida de cinco anos foi de 60% nos casos de superexpressão e de 83% nos casos negativos.

Akerval et al. (1997) também estudaram a expressão da ciclina D1 em casos de carcinomas de cabeça e pescoço. Os autores encontraram superexpressão em menos de 50% dos casos estudados. Porém, eles também conseguiram associar a superexpressão dessa proteína a um pior prognóstico. Eles observaram que, 26

especificamente nesse trabalho, a superexpressão não está relacionada com o tamanho nem com metástases em linfonodos regionais.

Masuda et al. (1996) analisaram a superexpressão da ciclina D1 em carcinomas epidermóides primários de laringe. Essas lesões estão associadas, geralmente, a um pobre prognóstico. No total, de 42 casos dessas neoplasias eles observaram que 23 (54,8%) exibiam mais de 20% das células marcadas, o que consideraram superexpressão. Eles conseguiram verificar que a superexpressão da ciclina D1 estava relacionada a casos que apresentavam metástases em linfonodos cervicais. Os autores também notaram melhor prognóstico nos casos em que essa proteína foi negativa ou em que a expressão foi inferior a 20% e o paciente submetido a mais de um tratamento.

A análise imunoistoquímica mostra que, em alguns estudos, essa proteína pode ser positiva na maioria dos casos de carcinoma epidermóide de boca. Também sua imunopositividade é mais intensa em lesões classificadas de alto grau de malignidade (NEVES, 2000). Vários outros estudos mencionam a superexpressão da ciclina D1 como um marcador de prognóstico desfavorável em pacientes com carcinoma epidermóide de boca (AKERVALL et al., 1997; MICHALIDES et al., 1997; MINETA et al., 2000). A superexpressão da ciclina D1 nessas lesões também é relacionada a baixa taxa de sobrevida e a presença de metástases em linfonodos cervicais (MINETA et al., 2000; RODOLICO et al., 2005). Isso indica que a expressão da ciclina D1 pode ser um útil marcador biológico na determinação do prognóstico dessa neoplasia.

Miyamoto et al. (2003) avaliaram, juntamente com a superexpressão da ciclina D1, a amplificação do gene dessa proteína. Em 41 casos de carcinoma epidermóide de boca, 13 (31,7%) exibiram amplificação do gene e 27 (65,9%) 27

superexpressão da proteína. Os autores comprovaram, estatisticamente, que a amplificação do gene da ciclina D1 foi um indicador de prognóstico mais eficiente do que a superexpressão dessa proteína. Ficaram livres da doença três (23,1%) dos 13

casos com amplificação de gene e 18 (64,3%) dos 28 casos que não amplificou.

Esse índice de pacientes livres da doença foi maior nos que mostraram superexpressão da proteína – 10 (37,05%) dos 27 com superexpressão e 11

(78,6%) dos 14 que não exibiram superexpressão.

Entretanto, Koontongkaew et al. (2000) notaram que 21 (39,62%) casos de um total de 53 apresentaram superexpressão da ciclina D1. Nesse trabalho, os autores avaliaram a superexpressão das proteínas p53, pRb, ciclina D1 e CDK4.

Essa avaliação foi feita de acordo com o percentual de núcleos marcados para cada proteína. Os autores não encontraram nenhuma associação significativa entre as proteínas estudadas, o que indica que a alteração de apenas uma importante proteína reguladora do ciclo celular é suficiente para favorecer a carcinogênese.

Eles acreditam que a expressão inapropriada de alguma dessas proteínas contribui para o desenvolvimento do câncer de boca.

Rodolico et al. (2005) estudaram, em carcinoma epidermóide de lábio inferior, a relação entre a ciclina D1 e a presença de metástase em linfonodos. Eles analisaram 97 pacientes que sobreviveram mais de cinco anos. Nesse trabalho, os autores avaliaram cinco parâmetros clínicos e histológicos, como: idade do paciente, tamanho do tumor, gradação histológica, espessura máxima e invasão perineural.

Os pesquisadores relacionaram esses dados com a expressão imunoistoquímica da ciclina D1 e da proteína p27 e notaram que uma baixa expressão da p27 associada a tumores maiores e à alta expressão da ciclina D1 favorece a metástase em linfonodos. Esses dados foram diretamente proporcionais à ocorrência de metástase 28

em menor tempo. Assim, esses autores sugeriram que a imunoistoquímica da ciclina D1 pode ser usada rotineiramente para classificar os pacientes que devem receber um tratamento mais agressivo e também pode ajudar a identificar tumores com maior potencial de metástase.

Neves (2000), constatou que a ciclina D1 foi positiva em 24 dos 28 casos analisados de carcinoma epidermóide de boca, o que representa 85,71% de ocorrência dessa doença. Porém, foi considerado positivo o fato de os tumores apresentarem 1% ou mais de células marcadas para a ciclina D1. Talvez por isso o percentual tenha sido pouco maior do que a literatura geralmente descreve. A autora comparou ainda o grau histológico de malignidade com seus resultados e, apesar de não observar diferença estatisticamente significante, ela encontrou uma marcação média de 19,3% de células nos carcinomas de baixo grau de malignidade ante 26,03% nos de alto grau de malignidade.

2.3 c-Jun

O gene c-jun faz parte da família dos genes JUN. Esses protoncogenes são de resposta primária, induzidos por estímulos extracelulares, como fatores de crescimento, hormônios e outros mitógenos que, quando expressos, codificam para proteínas nucleares com atividade de fatores de transcrição (RYSECK et al., 1988).

A família JUN também é formada pelos genes junB e junD. Tais genes, juntamente com a família dos genes FOS – c-fos, fra1, fra2 e frab – codificam fosfoproteínas 29

nucleares, que se associam e formam o fator de transcrição AP-1 (ativador da proteína 1).

As respectivas proteínas da família FOS e JUN possuem domínio do tipo zíper de leucina (dímero formado por duas α-hélices unidas por interações de leucinas, que são interações hidrofóbicas), domínios de ligação ao DNA, domínios de transativação e domínios de ligação a proteínas do complexo de transcrição basal. Uma vez que fatores de transcrição possuem domínios de zíper de leucina, essas proteínas formam homo e heterodímeros jun-jun ou heterodímeros fos-jun onde qualquer proteína das respectivas famílias pode estar envolvida. O complexo AP-1 regula a transcrição de genes alvos, positivamente ou negativamente, dependendo da composição dos heterodímeros (ANGEL; KARIN, 1991; SASSONE-CORSI et al., 1988).

O fator de transcrição AP-1 é capaz de reconhecer e ligar-se a elementos da região promotora de muitos genes, promovendo sua transcrição (Chiu et al., 1988).

Entre esses elementos estão as seqüências FAP (fos-ap1 binding site) ou TER (TPA responsive elemente, no qual o TPA é o agente mitogênico 12-O-tetradecanoylphorbol – sítio de ligação do fator de transcrição ao DNA do gene –

ativador de PKC – via de transdução de sinal), encontradas nos promotores dos genes das famílias FOS, JUN e outros (CURRAN; FRANZA Jr, 1988).

A proteína c-jun tem participação ativa no ciclo celular, principalmente durante a transcrição da fase G0 para a G1. A inibição da excreção dessas proteínas impede a proliferação celular (CURRAN; FRANZA JR, 1988; KOVARY; BRAVO, 1991). E os genes da família JUN podem atuar ainda regulando negativamente os processos de diferenciação celular. Em níveis elevados, a proteína c-jun, juntamente com a 30

proteína c-fos, inibiu a diferenciação, em cultura celular, de células de osteossarcoma e pré-adipócitos em adipócitos (ANGEL; KARIN, 1991).

Volm et al. (1993) analisaram a expressão imunoistoquímica de algumas proteínas, entre elas a c-jun, e a relacionaram com o prognóstico de 121 pacientes com carcinoma de pulmão. Os autores constataram que os pacientes que exibiram a superexpressão da proteína c-jun tiveram uma sobrevida significativamente menor que aqueles que não apresentaram superexpressão dessa proteína. Nesse trabalho, as análises univariada (Kaplan-Meier-estimates) e multivariada (Cox-regression-model) revelaram que a expressão da proteína c-jun é um importante fator prognóstico dessa doença. Esses autores constataram, em outro trabalho – no qual foram estudados 217 pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas –, que tumores com superexpressão da proteína c-jun apresentaram um número significantemente maior de metástase.

Meggiato et al. (2003) estudaram a expressão da proteína c-jun em 23 casos de câncer de pâncreas. Os autores queriam relacionar a proliferação celular e a apoptose com a imunoexpressão da proteína c-jun. Essas lesões não tinham recebido nenhum tipo de tratamento. A expressão foi encontrada em 20 (87%) dos 23 casos analisados. Os autores constataram que a expressão dessa proteína não tinha relação com a apoptose. No entanto, as lesões que apresentaram altas taxas de proliferação celular exibiram forte marcação dessa proteína. Ferrara et al. (1999) verificaram a expressão da c-jun e do Ki-67 na mesma lesão. Eles trabalharam com 14 casos de câncer de pâncreas primário, oito metástases de fígado, cinco casos de pancreatites crônicas e cinco casos de tecido de pâncreas normal de pacientes doadores. Apesar desses autores encontrarem positividade para a c-jun em 11 dos 14 casos de carcinomas pancreáticos, a marcação foi mais intensa nos casos de 31

metástase. Ainda nos casos de sobrevida curta, a marcação foi mais forte se comparada com os casos de maior sobrevida. Os autores acreditam que, nessas lesões, a proteína c-jun pode ser um bom indicador de prognóstico.

Yokoyama et al. (1998) avaliaram a expressão da proteína c-jun em carcinomas endometriais. Em 63 pacientes, eles relacionaram a expressão da proteína com o prognóstico e com a presença de metástases. Foram considerados positivos apenas os casos que exibiram mais de 30% das células com os núcleos marcados; desses, 44% das lesões foram positivas para a c-jun. Os pacientes com superexpressão dessa proteína tiveram pior prognóstico se comparados com aqueles cujas lesões não exibiram a marcação. Os autores ainda observaram que os casos de superexpressão exibiram invasão profunda do miométrio e metástase em linfonodos de região retroperitoneal. Assim, os autores concluíram que os casos com superexpressão da proteína c-jun possuem maior capacidade de metástase.

Sousa et al. (2002) estudaram a proteína c-jun, comparando sua expressão imunoistoquímica, em 20 casos de carcinomas epidermóides de boca e em 15 de tecido normal de mucosa bucal. Os autores constataram que a c-jun está expressa tanto no câncer como no tecido normal. Porém, a diferença é que, nas mucosas, essa proteína é expressa no citoplasma das células das camadas superiores e, nos carcinomas, sua expressão é nuclear. Os autores consideraram essa diferença como um importante indicativo de participação dessa proteína nos casos de carcinoma epidermóide bucal.

Turatti et al. (2005) avaliaram a expressão da proteína c-jun, da c-fos e da ciclina D1 em 15 casos de mucosa bucal normal, em 18 de displasia discreta, em 23

de moderada a intensa e em 24 de carcinoma epidermóide de boca. Em todos os casos estava localizada na língua e os autores consideraram positivas apenas as 32

marcações nucleares. Nesse trabalho, não foi observada marcação nuclear da proteína c-jun nos casos de mucosa normal e, dos 18 casos de displasia discreta, oito (44,4%) foram positivos. Dos 23 casos de displasia moderada a intensa, 16

(69,5%) foram positivos. Dos 24 casos de carcinoma, 21 (87,5%) apresentaram imunopositividade à proteína c-jun. Os autores acreditam que esses resultados possam demonstrar que a marcação nuclear da c-jun representa um evento inicial nos carcinomas epidermóides de boca.

2.4 Retinoblastoma

O gene retinoblastoma é um supressor de tumor. Ele forma, juntamente com os genes p107 e RLB2, a família dos genes retinoblastoma. Esse gene foi primeiramente identificado em tumores malignos de retina associados a deleções na região cromossômica em que se localiza, em pacientes com história familiar desta doença (CLÁUDIO; TONINI; GIORDANO, 2002). O gene codifica uma fosfoproteína nuclear, chamada de proteína do retinoblastoma. Essa proteína exibe quantidade constante e abundante, apresentando apenas discreta variação, em todas as fases do ciclo celular. Porém, seu estado de fosforilação depende da fase em que o ciclo se encontra, e ela também é alvo da atividade enzimática dos complexos CDK/ciclina (CHEN et al., 1989).

A via do retinoblastoma responde em grande parte à presença ou à ausência de sinais mitogênicos. Assim, regula o ciclo celular por meio de múltiplas funções.

Ela também regula outros processos que afetam a proliferação celular, a 33

diferenciação terminal e a apoptose (ADAMS; KAELIN Jr, 1998). A proteína do retinoblastoma pode inibir o crescimento da célula, atuando no ciclo celular entre as fases G0 e S, ligando-se e inativando fatores de transcrição. Essa proteína tem importante papel na diferenciação de vários tecidos, como adopogêneses, miogêneses e hematopoiese. A forma hipofosforilada ativa da proteína do retinoblastoma inibe a função apoptótica do interferon gama (INF-δ), e o fator de crescimento transformante beta1 (TGF-β1) induz a apoptose suprimindo sua expressão. A proteína do retinoblastoma está presente em todas as células e tecidos, porém ela se encontra mutada em muitos tipos de câncer (CLÁUDIO; TONINI; GIORDANO, 2002).

Lingfei et al. (1998) notaram que, em 58 casos de carcinoma epidermóide de pulmão, 21 deles não exibiram expressão da proteína do retinoblastoma, 28

apresentaram expressão parcial e em apenas nove lesões a expressão foi normal. E

Akin et al. (2002) observaram que, em 65 casos de carcinoma epidermóide de pulmão, 80% das ocorrências foram positivas para a proteína. No entanto, somente 40% dos tumores apresentaram mais da metade das células positivas. Nesse trabalho, não foi encontrada nenhuma relação entre as características clínicas dos pacientes e a expressão da proteína do retinoblastoma.

Ceccarelli et al. (1998) avaliaram a expressão da proteína do retinoblastoma em 153 carcinomas de mama. Os autores não encontraram diferenças estatísticas da expressão dessa proteína entre os pacientes que apresentaram metástase em relação aos que não a exibiram. Mas todos os casos que foram negativos ou apresentaram pouca expressão dessa proteína mostraram menor potencial de metástase. Outro dado obtido foi que a maioria dos tumores indiferenciados e com diferenciação moderada foi negativa para essa proteína. E os tumores que exibiram 34

maior capacidade proliferativa foram negativos para a expressão da proteína do retinoblastoma.

Ikeguchi et al. (2000) avaliaram a expressão da proteína do retinoblastoma em 191 casos de carcinoma primário de esôfago. Desse total, 171 pacientes eram homens e apenas 20 mulheres. Os autores consideraram positivos os tumores que exibiram mais de 50% das células marcadas. Como controle positivo, eles usaram o epitélio onde não havia neoplasia. Assim, 109 (57%) foram positivos. Entretanto, os autores notaram que a maioria dos tumores agressivos e com metástases em linfonodos foi negativa para a marcação da proteína. Em relação à sobrevida de cinco anos, 38% dos pacientes positivos para essa proteína sobreviveram mais que esse tempo. Enquanto nos negativos a taxa de sobrevida de cinco anos foi de 17%.

Esses resultados indicam que a perda da expressão dessa proteína está diretamente relacionada com a progressão desses tumores.

Ambrosch et al. (2001) notaram que não houve diferença estatística quando comparada a expressão dessa proteína com o epitélio normal, leucoplasia com graus variados de atipia, carcinoma in situ e carcinoma epidermóide. Os autores avaliaram 57 casos de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, dos quais 13

eram de boca, 30 de orofaringe e 14 de hipofaringe. No total, 38 pacientes eram homens e 19 mulheres, com idade média de 57 anos. Enquanto todos os casos de mucosa normal foram positivos, apenas seis (11%) dos carcinomas epidermóides foram negativos. Os autores também acreditam que a perda da expressão da proteína do retinoblastoma independe da progressão do tumor em casos de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Nesse estudo, os autores não avaliaram o percentual de células marcadas.

35

Pavelic et al. (1996) estudaram a expressão da proteína do retinoblastoma em 182 carcinomas epidermóides de boca e compararam com 55 casos de tecidos, adjacentes à lesão, considerados normais. Dos 182 tumores, 75 foram considerados menores. Em todos os casos de tecido adjacente à lesão, a expressão foi normal.

Dos 75 casos de menor tamanho, nove (7%) não exibiram expressão da proteína estudada. Já nos 107 casos restantes, 40 (37%) apresentaram a mesma condição.

Segundo os autores, esses dados sugerem que a diminuição da expressão da proteína do retinoblastoma está associada à progressão desses tumores. Os autores também constataram neste artigo que a perda da expressão dessa proteína, em casos de câncer em estágio inicial, é um importante indicador de prognóstico.

Nakahara et al. (2000), ao trabalhar também com carcinoma epidermóide de boca, notaram que a proteína do retinoblastoma estava presente em 34 (43,6%) dos 78 casos estudados. Os autores compararam a expressão dessa proteína nos carcinomas e em lesões pré-malignas e concluíram que ela está relacionada com o desenvolvimento dessa lesão, mas não com sua progressão. Eles também constataram que as alterações na expressão dessa proteína, além de precoces, são freqüentes na tumorigênese dessas lesões.

2.5 HPV

Nas últimas décadas, devido aos avanços nas técnicas de biologia molecular, inúmeros trabalhos tentaram comprovar que o HPV também é um fator etiológico dos carcinomas de cabeça e pescoço (BRADFORD et al., 1991; CRUZ et al., 1996; 36

ELAMIN et al., 1998; LO MUZIO et al., 1997). O vírus do HPV está fortemente relacionado a vários tipos de câncer. Entretanto, não há comprovação de que ele participe da carcinogênese de lesões de boca. Estudos mais recentes mostram que apenas de 15% a 20% de todos os tipos de câncer estão vinculados a infecções pelo HPV (AZZIMONTI et al., 1999; HA et al., 2002; MERKELBACH-BRUSE et al., 1999).

Os HPVs pertencem a família papovavírus. São vírus de ácido

desoxirribonucléico (DNA), circular de dupla hélice e com aproximadamente 55

nanômetros de diâmetro. Seu genoma é formado por 7.200 a 8.000 pares de bases e o material genético é envolto em uma cápsula protéica icosaédrica denominada capsídeo, que contém 72 capsômeros (KIRNBAUER et al.,1993; ZUR HAUSEN, 2000). Os HPVs são epiteliotróficos capazes de infectar a pele e as mucosas em vários sítios corporais (ZUR HAUSEN, 2000).

Para replicar seu material genético, esses vírus dependem da maquinaria celular do hospedeiro e podem alterar a regulação do ciclo celular normal. Essa ação está vinculada à síntese de duas oncoproteínas, a E6 e a E7. Juntas, essas oncoproteínas podem imortalizar células epiteliais e estimular sua proliferação por ativar as ciclinas, que estão envolvidas na via do ciclo da proteína do retinoblastoma (pRb) e na proteína p53 (p53), com um papel importante no desenvolvimento de tumores (POLJAK; SEMEI; GALE, 1998).

O genoma viral apresenta três segmentos principais de tamanhos desiguais.

Cerca de 10% de seu material genético representa a Região Longa de Controle (LCR), cuja função é regular a expressão dos genes virais. Os outros segmentos são formados pelos genes Early (E) ou Late (L). Todos os genes virais são decodificados em uma fita de seu DNA. Os genes L1 e L2 codificam as proteínas capsídeas 37

principais e secundárias, que são expressas somente em células epiteliais diferenciadas (CHOW; BROKER, 1994). No gene L1, existe uma diferença muito pequena na seqüência básica de DNA nos diferentes tipos de HPV. No entanto, essa diferença permite identificar os vários tipos do vírus (SZENTIRMAY et al., 2005).

O gene HPV E1 codifica dois polipeptídios que se ligam a seqüências específicas dentro da LCR para iniciar a replicação do DNA viral. O gene HPV E2

expressa uma ou mais proteínas com comprimentos que vão de 370 a 430

animoácidos. Essas proteínas atuam como ativadoras ou repressoras na transcrição e, assim, regulam a transcrição e a replicação do DNA viral (MCBRIDGE; ROMNCZUK; HOWLEY, 1991; MCKAIG; BARIC; OLSAN, 1998). O gene HPV E4 é expresso relativamente tarde na replicação do vírus e está envolvido na maturação e na liberação de partículas do papilomavírus. O gene HPV E4 interage com as citoqueratinas. O resultado dessa interação é o colapso dos filamentos citoplasmáticos intermediários, o que leva a alterações citomorfológicas específicas do HPV, como coilocitose, por exemplo, nas células epiteliais infectadas (DOORBAR

et al., 1991; ROBERTS et al., 1993). O gene HPV E5, em circunstâncias experimentais, funciona como oncogene. Esse gene tem a capacidade de transformar, in vitro, algumas linhagens de células de roedores por inibir a degradação fisiológica de receptores de membrana celular para fatores de crescimento (CHEN; MOUNTS, 1990; PETTI; DIMAIO, 1994). Ainda não está clara a função exata da proteína E5 em câncer humano. Ela não é expressa na maioria dos tipos de câncer HPV positivos (SZENTIRMAY et al., 2005).

Os genes HPV E6 e E7 são os principais genes virais responsáveis pela transformação maligna celular. Esses oncogenes codificam duas proteínas com, 38

respectivamente, 151 e 98 aminoácidos. As proteínas E6 e E7, em conjunto, podem imortalizar queratinócitos de vários sítios do corpo humano (MUNGER et al., 1989; SCHEFFNER et al., 1994). A proteína E6 pode formar um complexo com a proteína p53 da célula do hospedeiro e degradar essa proteína (CROOK; TIDY; VOUSDEN, 1991; HUBBERT; SEDMAN; SCHILLER, 1992; WERNESS; LEVINE; HOWLEY,

1990). O gene TP53 tem funções fundamentais na célula – regula o crescimento celular, o reparo do DNA, a apoptose, a supressão tumoral, a angiogênese e a auto-regulação, entre outras. A perda da função do gene TP53 gera a desregulação do ciclo celular e promove mutação, instabilidade cromossômica e transformação maligna na célula do hospedeiro. A proteína E6 também pode ativar a proteína telomerase, o que é essencial para a célula tornar-se imortal (KLINGELHUTZ; FOSTER; MCDOUGAL,1996; VOUSDEN; LU, 2002).

A proteína E7 forma complexos com a família das proteínas do gene RB –

pRb1, p107 e p130 –, que regulam negativamente o ciclo celular. A pRb1 regula a progressão do ciclo celular inibindo fatores de transcrição, como E2F. Essa proteína é fosforilada pelas quinases dependentes de ciclinas, e a pRb hipofosforilada pode ajudar a bloquear a progressão do ciclo celular. As outras proteínas RB – 107 e 130

– regulam check points diferentes no ciclo celular, como a passagem de G0 para G1

e de G1 para S. O gene HPV E7 produz ligantes para as formas hipofosforiladas da pRb, p107 e p130 e libera, no interior da célula, o fator de transcrição E2F. Esse fator de transcrição livre no interior celular induz a expressão de muitos genes envolvidos na progressão do ciclo celular. Dessa forma, as proteínas E6 e E7

inativam as proteínas p53 e pRb e permitem que a célula escape dos check points normais, o que pode levar à perda de fidelidade na replicação do DNA (COBRINIK et al., 1992; MCKAIG; BARIC; OLSHAN, 1998). Os efeitos simultâneos de perda de 39

função do TP53 e da pRb podem levar células epiteliais a se malignizarem (SZENTIRMAY et al., 2005).

Ha et al. (2002) avaliaram, pela técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR), a presença do HPV em lesões de cabeça e pescoço.

Foram analisados 102 pacientes com lesões pré-malignas, das quais 85 eram em boca, com variados graus de atipia, e 34 pacientes com carcinoma epidermóide de boca. Em apenas duas lesões, nos dois grupos estudados, os autores encontraram material genético do HPV. Uma no grupo das leucoplasias, especificamente em uma leucoplasia com moderado grau de atipia, localizada em cavidade bucal – o que representa 0,98% das lesões estudadas –, e a outra no grupo de carcinoma epidermóide – 2,9% do total. Os autores acreditam que o baixo número de lesões positivas para o HPV se deve ao fato de as lesões analisadas localizarem-se na boca. Nessa região do corpo ainda é contraditória a função do HPV como fator etiológico. Outra possibilidade que eles apontam é que o DNA extraído de tecido parafinado não seja de boa qualidade. Entretanto, apenas 11 dos 34 casos por eles estudados estavam armazenados em parafina. Os autores acreditam que a ausência do HPV pode ser mais predominante em lesões de boca. E ainda: que o HPV pode ser um agente etiológico de tumores epiteliais em outras regiões do corpo.

Dahlgren et al. (2004) estudaram, pela técnica de PCR, a presença do HPV

em 110 carcinomas epidermóides de língua. Do total, 25 tumores localizavam-se na base da língua e os outros 85 na região móvel da língua (borda, ventre e ápice lingual). Eles encontraram o DNA do HPV em 12 (10,9%) lesões, das quais 10 (40%) positivas estavam localizadas na base da língua. Enquanto isso, das 85 lesões da parte móvel da língua, apenas duas (2,4%) foram positivas. Os autores constataram, ainda, que a presença do DNA do HPV foi mais freqüente em tumores 40

indiferenciados quando comparados com tumores moderadamente diferenciados e bem diferenciados. Também em lesões menores (T1 e T2) o material genético do vírus estava presente em um número maior delas quando comparadas com lesões maiores (T3 e T4). Outro dado interessante foi que o tempo de recorrência nos pacientes positivos para HPV foi maior. No grupo de pacientes com tumor na base da língua, o tempo de recorrência também foi diferente nas lesões com HPV positivo e negativo. Nos casos positivos, a média foi de 17 meses. Nos negativos, de oito meses. Eles notaram que a sobrevida foi significativamente maior nesse grupo de pacientes HPV positivos. Esses autores acreditam que a presença do HPV em lesões malignas de boca depende, significativamente, da localização.

41

3 PROPOSIÇÃO

A proposta deste trabalho foi estudar a expressão imunoistoquímica das proteínas ciclina D1, do fator de transcrição c-jun e da proteína do retinoblastoma.

Tentou-se ainda verificar, por meio de testes estatísticos, a relação dessas proteínas com os graus de malignidade do carcinoma epidermóide bucal. O objetivo era também verificar, pela técnica de PCR, se o HPV é um agente etiológico dessa neoplasia.

42

4 MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado, em 05/10/2004, pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo com o número do protocolo do parecer 162/04 (Anexo A).

A pesquisa corresponde a uma parte do projeto intitulado “DETECÇÃO DO

PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV) EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA E

LEUCOPLASIAS UTILIZANDO-SE HIBRIDIZAÇÃO in situ E PCR. RELAÇÃO COM

A EXPRESSÃO DA CICLINA D1, FATOR DE TRANSCRIÇÃO C-JUN E COM A

PROTEÍNA DO RETINOBLASTOMA”, de responsabilidade da professora Dra.

Suzana Cantanhede Orsini Machado de Sousa.

4.1 Seleção dos casos e análise morfológica

Para o estudo, foram selecionados 63 casos de carcinoma epidermóide bucal do Laboratório de Patologia Cirúrgica da disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da FOUSP. As lâminas referentes aos casos e coradas pela técnica da hematoxilina e eosina foram submetidas novamente a um estudo morfológico em microscopia de luz para confirmação do diagnóstico e classificação do grau de malignidade.

43

4.1.1 Dados epidemiológicos dos pacientes estudados

Dos 63 pacientes analisados, 46 eram do sexo masculino e 17 do sexo feminino. A idade variou de 17 a 85 anos, com média de 53,2 anos. Porém, entre os pacientes do sexo masculino a idade variou de 22 a 85 anos, com média de 52,6

anos. Entre pacientes do sexo feminino, a idade variou de 17 a 84 anos, com média de 54,8 anos. Em relação à cor da pele, 41 eram leucodermas, 13 melanodermas, um xantoderma e oito não tinham essa característica relatada na ficha. De acordo com a localização anatômica da lesão, 10 estavam situadas no assoalho da boca, uma na gengiva, duas no lábio inferior, uma no lábio superior, 24 na língua, uma na mandíbula, uma na mucosa jugal, oito no palato, nove no rebordo alveolar e seis em trígono-retromolar.

Tabela 4.1 – Dados epidemiológicos dos pacientes estudados

N.o

N.o do Exame

Sexo

Idade

Cor da pele

Localização

1

52748 M 51 Melanoderma

Trígono

2 52549 M 58

Leucoderma

Palato

3 52500 F 52

/

Palato

4 52481 M 59

Leucoderma

Assoalho

5 51955 M 52

Leucoderma

Palato

6 51933 M 65

Leucoderma

Palato

7 51911 M 47

Melanoderma

Assoalho

8 51904 M 77

Leucoderma

Trígono

9 51882 M 47

/

Língua

10 51541

M

50

Leucoderma

Língua

11 51496

F

54

Leucoderma Rebordo

alveolar

12

51439 M 48 Leucoderma

Língua

13 51437

M

59

Melanoderma

Língua

14 51415

F

/

/

Rebordo

alveolar

Continua

44

Continuação

15

51412

M

42

Leucoderma

Assoalho

16

51402

M

/

Leucoderma

Lábio superior

17

51397

M

55

Leucoderma

Rebordo alveolar

18

51341

M

69

Leucoderma

Rebordo alveolar

19

51176

M

/

Melanoderma

Trígono

20

51089

F

49

Melanoderma

Língua

21

51037

M

59

Xantoderma

Língua

22

51011

M

75

/

Língua

23

50844

M

47

Melanoderma

Língua

24

50831

M

54

Leucoderma

Língua

25

50813

M

22

Leucoderma

Língua

26

50807 M 58

/

Palato

27

50741 M 51 Leucoderma

Língua

28

50539 M 42 Leucoderma

Língua

29

50444 M 47

/

Rebordo

alveolar

30

50234 F 46 Leucoderma

Língua

31

49796 M 40 Leucoderma

Língua

32

49438 M 50 Leucoderma

Língua

33

49416 M 50 Leucoderma

Assoalho

34

49250

M

49 Leucoderma Mandíbula

35

48812 M 42 Leucoderma

Trígono

36

48377 F 62 Leucoderma

Língua

37

48163 F 56 Leucoderma Assoalho

38

47454 F 37 Leucoderma

Língua

39

47317 M 48

/

Assoalho

40

46728 F 84 Leucoderma

Palato

41

46724 M 49 Melanoderma

Trígono

42

46716 F 66 Leucoderma

Palato

43

46686 M 40 Leucoderma

Assoalho

44

46144 M 42 Leucoderma

Assoalho

45

45909 M 50 Melanoderma

Rebordo

alveolar

46

45908 F 35

/

Língua

47

45842 M 36 Melanoderma

Língua

48

45706 M 48 Leucoderma

Língua

49

45632 M 52 Leucoderma

Palato

50

45607 F 73 Melanoderma Assoalho

51

45546 M 85 Leucoderma

Assoalho

52

45100 M 74 Leucoderma Lábio

inferior

53

44925 M 48 Leucoderma

Rebordo

alveolar

Continua

45

Conclusão

54

44557 F 70 Leucoderma

Língua

55

42729 M 41 Leucoderma

Língua

56

41333 F 17 Leucoderma

Trígono

57

40458 M 40 Leucoderma

Gengiva

58

40145 M 63 Leucoderma

Língua

59

39210 F 48 Melanoderma Mucosa

jugal

60

38647 F 56 Melanoderma

Rebordo

alveolar

61

38217 F 72 Leucoderma

Língua

62

38063 M 67 Leucoderma Lábio

inferior

63

35338 M 67 Melanoderma

Rebordo

alveolar

Tabela 4.2 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com o sexo Sexo N.o (%)

Masculino 46

(73%)

Feminino 17

(27%)

Total 63

(100%)

Tabela 4.3 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com a cor da pele Cor da pele

N.o (%)

Leucoderma 41

(65%)

Melanoderma 13

(20,5%)

Xantoderma 01

(1,5%)

Ignorada 08

(13%)

Total 63

(100%)

Tabela 4.4 – Número e porcentagem dos pacientes de acordo com a localização anatômica das lesões

Localização anatômica

N.o (%)

Assoalho 10

(15,5%)

Gengiva 01

(1,5%)

Lábio inferior

02 (3%)

Lábio superior

01 (1,5%)

Língua 24

(38,5%)

Continua

46

Conclusão

Mandíbula 01

(1,5%)

Mucosa jugal

01 (1,5%)

Palato 08

(13%)

Rebordo alveolar

09 (14,5%)

Trígono 06

(9,5%)

Total 63

(100%)

4.2 Gradação histológica de malignidade

Os casos foram divididos em dois grupos: alto grau de malignidade e baixo grau de malignidade, de acordo com os critérios de Anneroth et al. (1987), modificados por Pinto Jr. (1991). Esses critérios consistem em avaliar seis características morfológicas das lesões: grau de queratinização, pleomorfismo nuclear, números de mitoses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário (ANNEROTH et al.,1987). Porém, por tratar-se de biópsias incisionais, o estágio de invasão não foi avaliado (PINTO Jr., 1991).

De acordo com esses critérios, cada estágio recebe nota de 1 a 4. A média é obtida pela somatória dos pontos de cada parâmetro, dividida pelo número de parâmetros usados. Assim, a pontuação média nunca pode ser maior que 4 nem menor que 1. As lesões são consideradas de baixo grau de malignidade quando recebem escores de 1 a 2,5, e de alto grau de malignidade, de 2,6 a 4.

47

Tabela 4.5 – Sistema de gradação histológica

POPULAÇÃO CELULAR TUMORAL

Pontos (escores)

Parâmetros

1 2 3 4

morfológicos

Itenso (mais de

Moderado (entre

Ausente (entre 0%

Grau de

Mínimo (entre 5% e

50% das células)

20% e 50% das

e 5% das células

queratinização

20% das células)

células)

maduras)

Discreto (mais de Moderado (entre

Abundante (entre

Intenso (entre 0%

Pleomorfismo

75% das células

50% e 75% das

25% e 50% das

e 2% das células

nuclear

maduras)

células maduras)

células maduras)

maduras)

Número de mitoses

0-1 2-3 3-4 Mais

de

5

RELAÇÃO TUMOR HOSPEDEIRO

Pontos (escores)

Parâmetros

1 2 3 4

morfológicos

Margens bem

Cordões sólidos

Pequenos grupos

Padrão de invasão

Invasão maciça

definidas

e/ou ilhas

celulares

Infiltrado

Marcante Moderado Discreto Ausente

linfoplasmocitário

4.3 Técnica de imunoistoquímica

A técnica de imunoistoquímica foi a mesma utilizada rotineiramente no Laboratório de Imunoistoquímica da disciplina de Patologia Bucal da FOUSP. Foram utilizados cortes de 3 micra de espessura no material emblocado em parafina e estendidos em lâminas de vidro previamente lavadas em álcool absoluto, secas e 48

mergulhadas durante 1 minuto em solução de 3-aminopropytriethoxy-silane (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO/USA) a 10% em álcool absoluto. Os primeiros passos foram iguais para os três anticorpos. Os cortes foram desparafinizados em dois banhos de xilol, um a 60º C durante 30 minutos e outro à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, foram reidratados em série descendente de etanol, com três passagens em etanol absoluto, seguidas por etanol 95% e 85% durante 5

minutos cada uma. Com a finalidade de remover o pigmento formólico, os cortes foram imersos em hidróxido de amônia a 10% em solução alcoólica a 95% durante 10 minutos. Posteriormente, foram lavados em água corrente por 10 minutos e submetidos a dois banhos em água destilada de 5 minutos cada uma.

4.3.1 Imunoistoquímica da proteína ciclina D1

Os cortes receberam tratamento para recuperação antigênica com tampão citrato a 10mM, pH 6.0 por 30 minutos em banho-maria. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com dois banhos de 15 minutos cada um em solução de peróxido de hidrogênio a 6% e metanol (1:1 v/v). Os cortes foram encubados por 60

minutos com o anticorpo primário anticiclina D1 (clone DCS-6, Dako Corporation, Glostrup, Denmark) em temperatura ambiente, na diluição de 1:50. As secções foram encubadas em um ciclo de kit EnVision Mouse (Dako Corporation) por 30

minutos para bloqueio da biotina endógena e lavadas com TBST pH 6.0. A reação de revelação foi o cromógeno diaminobenzidina 0,025% (DAB, 3,3-49

diaminobenzidina, Sigms Chemical Co., St. Louis, MO/USA). Após a lavagem, os cortes foram contra-corados com a hematoxilina de Mayer.

4.3.2 Imunoistoquímica da proteína c-jun

Os cortes receberam tratamento para recuperação antigênica com tampão citrato a 10 mM, pH 6.0 por 30 minutos em banho-maria. O bloqueio da peroxidase endógena foi com dois banhos de 5 minutos cada um em solução de peróxido de hidrogênio a 6% e metanol (1:1 v/v). Os cortes foram incubados com dois ciclos de 15 minutos cada um com o Avidin/Biotin Blocking Kit – SP 2001 (Vector Laboratories Inc., Burlinngame, CA) e por 75 minutos com BSA 0,1% (BSA-Bioset S/A, São Paulo, Brasil) antes da adição do anticorpo primário anti-c-jun (Clone 94, Santa Cruz, CA) em temperatura ambiente, na diluição de 1:50. As secções foram incubadas com quatro ciclos de kit CSA System Peroxidase (Calalyzed Signal Amplification, Dako Corporation, Carpinteria, CA) por 15 minutos cada um e lavadas com TBST pH 7.4. Os cortes foram lavados novamente com TBST pH 7.4 e a reação de revelação foi o cromógeno diaminobenzidina 0,025% (DAB, 3,3-diaminobenzidina, Sigms Chemical Co., St. Louis, MO/USA). Depois da lavagem, os cortes foram contra-corados com a hematoxilina de Mayer.