Expressão de quimiocinas regulatórias das células Natural Killer e T-reguladoras em pacientes com... por Patrick Bellelis - Versão HTML

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PATRICK BELLELIS

Expressão de quimiocinas regulatórias das células Natural Killer e T-

reguladoras em pacientes com endometriose profunda

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, para a obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de: Obstetrícia e Ginecologia

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Podgaec

SÃO PAULO

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Bellelis, Patrick

Expressão de quimiocinas regulatórias de células Natural Killer e T-reguladoras

em pacientes com endometriose prof

unda / Patrick Bellelis. -- São Paulo, 2013.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Obstetrícia e Ginecologia.

Orientador: Sérgio Podgaec.

Descritores: 1.Endometriose 2.Células matadoras naturais 3.Linfócitos T

reguladores 4.Quimiocinas 5.Endomét rio

USP/FM/DBD-407/13

Aos meus pais, Samy e Lourdes, meus exemplos, meu porto-seguro.

Ao meu irmão e melhor amigo, Michel.

À Vanessa, pelo companheirismo destes anos juntos.

A todos, obrigado por todo amor, apoio e compreensão!

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Doutor Sérgio Podgaec, obrigado pela dedicação, orientação e

amizade.

Ao Professor Doutor Maurício Simões Abrão, um exemplo de dedicação,

obrigado pelos conselhos e amizade.

À Doutora Denise Frediani Barbeiro, obrigado por toda ajuda e dedicação.

Ao Professor Doutor Edmund Chada Baracat, pela importante colaboração e

revisão deste trabalho.

Ao Professor Doutor Luiz Vicente Rizzo, pela disponibilidade de ensinar e

cultivar o estudo da imunologia.

Ao Doutor Luciano Gibran, pela amizade, sugestões e contribuições.

Ao Doutor João Antônio Dias Júnior, pela amizade, sugestões e

contribuições.

Ao Doutor Luiz Flávio Cordeiro Fernandes, pela amizade, sugestões e

contribuições.

Às Doutoras Paula Zulian Fagundes e Lídia Hyun Joo Myung, pela amizade,

carinho e ajuda.

Aos Doutores Luiz Fernando de Oliveira Henrique e Daniel Bier Caraça, pela

amizade e companheirismo.

Aos Doutores Luiz Fernando Pina de Carvalho, Marco Antônio Bassi, Nicolau

DÁmico Filho, Manoel Orlando Gonçalves, Leandro Accardo de Mattos,

Cláudio Severino Junior, Rogério Gomes e Flávia Fairbanks por toda

amizade e ajuda.

À bióloga Ana Carolina Poppe, pela amizade e ajuda.

À FAPESP, pelo apoio financeiro.

Às pacientes. Sem elas, nada seria possível.

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas

Lista de figuras e gráficos

Lista de tabelas

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1

2. OBJETIVOS ............................................................................................. 16

3. PACIENTES E MÉTODOS ....................................................................... 18

4. RESULTADOS ......................................................................................... 28

5. DISCUSSÃO.............................................................................................. 40

6. CONCLUSÕES ......................................................................................... 49

7. ANEXOS ................................................................................................... 51

8. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 72

9. ARTIGO PUBLICADO .............................................................................. 85

LISTA DE ABREVIATURAS

CAA – Células Apresentadoras de Antígeno

Células NK – Células Natural Killer

Células T-reg – Células T-reguladoras = Células T CD4+CD25high

CHP – Complexo de histocompatibilidade principal

DPC – Dor Pélvica Crônica

EUA – Estados Unidos da América

EVA – Escala Visual Analógica de dor

HC-FMUSP – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo

IL-10 – Interleucina 10

IL-15 – Interleucina 15

LGG – Linfócitos Granulares Grandes

LISTA DE FIGURAS, GRÁFICOS E QUADROS

Figura 1 – Estadiamento da endometriose proposto pela American Society

for Reproductive Medicine (1996).

Gráfico 1 – Expressão gênica relativa da quimiocina CX3CL1 em endométrio

tópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e

de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose

Gráfico 2 – Expressão gênica relativa da quimiocina CXCL12 em endométrio

tópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e

de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose

Gráfico 3 – Expressão gênica relativa da quimiocina CCL17 em endométrio

tópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e

de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose

Gráfico 4 – Expressão gênica relativa da quimiocina CCL21 em endométrio

tópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e

de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose.

Quadro 1 – Representação esquemática da dinâmica de estudo.

Quadro 2 – Representação esquemática da detecção das quimiocinas por

PCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões de endometriose.

Quadro 3 – Expressão gênica relativa da quimiocina CXCL9, CXCL10,

CXCL11 E XCL1 em endométrio tópico e lesão endometrióide de pacientes

com endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de

pacientes sem endometriose.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Quimiocinas humanas identificadas até o momento – modificado

e atualizado de Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel

das quimiocinas nas uveítes. 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370.

Tabela 2: Lista de Primers das quimiocinas CCL17, CCL21, CXCL9,

CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 utilizados no presente estudo.

Tabela 3 – Descrição das características referentes ao quadro clínico das

pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e mulheres

sem endometriose (grupo controle).

Tabela 4 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com e

sem endometriose segundo as fases do ciclo menstrual, folicular e lútea

Tabela 5 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com

endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de

dismenorréia.

Tabela 6 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com

endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de

dispareunia de profundidade.

Tabela 7 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com

endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de dor

pélvica crônica.

Tabela 8 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com

endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de

alterações intestinais.

Tabela 9 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1,

CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com

endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo estadiamento inicial

(1 e 2) e avançado (3 e 4) – ASRM 1996.

RESUMO

Introdução: A endometriose, condição inflamatória prevalente, associa-se a

alterações da reposta imune na cavidade peritoneal e no útero. Evidências

sugerem participação de mediadores inflamatórios, como as células Natural

Killer e T-reguladoras na patogênese desta doença. A resposta destas

células pode ser controlada pela atividade de algumas quimiocinas. O

objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica das quimiocinas

reguladoras das células Natural Killer e T-reguladoras em endométrio tópico

em lesões endometrióticas de pacientes com endometriose.

Pacientes e Métodos: A expressão gênica das quimiocinas reguladoras da

atividade das células Natural Killer (CXCL9, 10, 11, CXCL12, XCL1 e

CX3CL1) e T reguladoras (CCL17 e CCL21) foi avaliada por meio de RT-

PCR no endométrio tópico e lesão endometriótica de 22 pacientes com

endometriose de retossigmóide; 10 pacientes com endometriose retrocervical

e no endométrio tópico de 32 mulheres sem endometriose comprovada por

laparoscopia para laqueadura tubária.

Resultados: Dentre as quimiocinas relacionadas às células Natural Killer,

encontramos diferença estatística significativa na CX3CL1 e CXCL12, as

quais foram mais expressas no foco de endometriose intestinal e

retrocervical, quando comparadas ao endométrio tópico das pacientes e

controles (p<0,05). Das relacionadas às células T-reguladoras, a CCL17 foi

mais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão em

retossigmóide quando comparada aos demais grupos (p<0,05).

Conclusões: As quimiocinas CX3CL1 e CXCL12 foram mais expressas nos

focos de endometriose intestinal e a CCL17 foi mais expressa no endométrio

tópico de pacientes com lesão de retossigmóide. Estes resultados sugerem

que as quimiocinas CX3CL1, CXCL12 e CXCL17 participam da resposta

inflamatória que ocorre na endometriose pélvica.

Descritores: endometriose, células matadoras naturais, linfócitos T

reguladores, quimiocinas, endométrio

SUMMARY

Objective: Endometriosis is a highly prevalent inflammatory condition

associated with an altered immune response in the peritoneal cavity and

uterus. Evidence suggests a participation of inflammatory mediators such as

natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cells in the pathogenesis of this

disease while the response of these cells may be controlled by the activity of

some chemokines.

Patients and Methods: Gene expressions of the chemokines that regulate

the activity of NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 and CX3CL1)

and T-reg cells (CCL17 and CCL21) were evaluated using real time

polymerase chain reaction (PCR) in the eutopic and ectopic endometrium of

22 patients with bowel endometriosis, 10 patients with retrocervical

endometriosis and 32 controls.

Results: Of the chemokines associated with NK cells, the expression of

CX3CL1 and CXCL12 was significantly greater in the foci of endometriosis

(p<0.05). Of those associated with T-reg cells, significant differences

between groups were found in CCL17. In addition, CCL17 was expressed to a

higher degree in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid

lesions when compared to the other groups (p<0.05).

Conclusions: Chemokines CX3CL1 and CXCL12 were more expressed in

intestinal endometriosis and CCL17 expression was higher in eutopic

endometrium of the patients with rectosigmoid lesions. These results suggest

that those chemokines participate in the inflammatory response that occurs in

pelvic endometriosis.

Descriptors: endometriosis; Natural Killers cells; T regulatory limphocytes;

chemokines; endometrium.

1

1. INTRODUÇÃO

2

Endometriose representa uma afecção ginecológica comum, que

atinge de 10 a 15% das mulheres no período reprodutivo e até 50% das

mulheres com dor pélvica crônica e/ou infertilidade (Viganò, et al., 2004;

Bellelis, et al., 2010). Estima-se que o número de mulheres com

endometriose seja de 7 milhões nos Estados Unidos da América e de mais

de 70 milhões no mundo. Em países industrializados, é uma das principais

causas de hospitalização ginecológica (Vercellini, et al., 2007).

Esta doença é definida como a implantação de estroma e/ou epitélio

glandular endometrial em localização extrauterina (Gao, et al., 2006),

podendo comprometer diversos locais, entre eles ovários, peritônio,

ligamentos

úterossacros,

região

retrocervical,

septo

retovaginal,

retossigmóide, íleo terminal, apêndice, bexiga e ureteres (Vinatier, et al.,

2001; Abrao, et al., 2006; Vercellini, et al., 2007; Podgaec, et al., 2008).

Nisole e Donnez, em 1997, dividiram esta doença em três afecções

distintas: peritoneal, ovariana e de septo retovaginal, sendo esta última

chamada de endometriose infiltrativa profunda (Cornille, et al., 1990). No

primeiro caso, estariam incluídas as pacientes com implantes superficiais; no

segundo os cistos ovarianos típicos da doença e no terceiro caso, a

endometriose infiltrativa com lesões com 5mm ou mais de espessura que

podem acometer as regiões retro e paracervical, de fórnice vaginal e vagina,

além dos tratos gastrointestinais e urinário.

Apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia

(Ulukus, et al., 2009), alguns aspectos continuam sendo alvo de pesquisa,

destacando-se a busca pela etiopatogenia (Abrao, et al., 2006; Podgaec,et

al., 2008; Ascien & Velasco, 2013). Duas correntes principais de hipóteses

etiopatogênicas são citadas há quase um século: a teoria da metaplasia

celômica (Meyer, 1919) e a da menstruação retrógrada (Sampson, 1927).

Esta segunda teoria seria possível por influência de um ambiente hormonal

favorável e de fatores imunológicos que não eliminariam as células

endometriais da cavidade peritoneal (Harada, et al., 2001; Podgaec, et al.,

2007; Berbic & Fraser, 2013).

3

Pacientes portadoras de endometriose podem ser assintomáticas ou

apresentarem queixas clínicas em diferentes intensidades, sendo as

principais dismenorréia, dor pélvica crônica, infertilidade, dispareunia de

profundidade e sintomas intestinais e urinários cíclicos, como dor ou

sangramento ao evacuar ou urinar durante o período menstrual. A demora do

diagnóstico da endometriose pode ser explicada pela inespecificidade do

quadro clínico e, eventualmente, pela falta de correlação entre sintomas e

gravidade da doença ( Arruda, et al., 2003; Hemmings, et al., 2004; Kashima,

et al., 2004; Heilier, et al., 2007).

Considerações gerais sobre os aspectos imunológicos

Nos últimos anos, muito tem se estudado acerca dos fatores

imunológicos na patogênese da endometriose e muitas anomalias foram

encontradas (Berkkanoglu and Arici, 2003; Podgaec, et al., 2007; Fairbanks,

et al., 2009; Berbic & Fraser, 2013), sendo que o principal mecanismo

avaliado é complementar à teoria da menstruação retrógrada. Por algum

motivo, ainda indeterminado, as células endometriais que adentraram à

cavidade endometrial não seriam eliminadas e deste modo, seria permitido a

elas se implantarem e desenvolverem a doença (Harada, et al., 2001; Berbic

& Fraser, 2013).

As células que caem na cavidade abdominal deveriam ser

identificadas como antígenos e serem submetidas à resposta imune local.

Algumas células, como os macrófagos, funcionam como apresentadoras de

antígenos aos linfócitos T através do complexo de histocompatibilidade

principal (CHP). O CHP pode ser classe I ou II, sendo que no primeiro caso

atrai os linfócitos T citotóxicos e no segundo os lintócitos T helper

(auxiliadores). Os citotóxicos secretam substâncias letais que provocam a

morte da célula-alvo e os T- helper secretam citocinas que induzem

mecanismos e fatores que podem levar à morte celular (Abbas, et al., 2011).

Deste modo, existem dois tipos de resposta imune: a inata e a

adaptativa ou adquirida. Em um dos mecanismos da resposta inata,quando

um antígeno invade o organismo, um grupo de células tenta destruí-lo por

4

meio da fagocitose. Estas células podem ser monócitos, macrófagos,

neutrófilos e/ou células Natural Killer. Este tipo de reconhecimento é

inespecífico, pois as células fagocitam vários tipos de micro-organismos e

fazem parte da primeira linha de defesa do organismo. Já a adaptativa, é

uma resposta específica e conta com a atuação dos linfócitos, que

reconhecem o patógeno invasor (Abbas, et al., 2011).

Existem vários tipos de linfócitos, dentre os quais destacam-se os

linfócitos B, que produzem anticorpos que se ligam ao antígeno para eliminá-

lo, os linfócitos T, que estão envolvidos na produção de linfócitos B, auxiliam

na fagocitose, atuam na eliminação antigênica e na replicação da resposta

imune e as células NK que não apresentam em sua superfície marcadores

que são encontrados nas células B, nem os que caracterizam as células T.

No sangue circulante, 10-15% dos linfócitos são NK. Estas, por sua vez,

atacam as células neoplásicas e células infectadas por vírus sem

necessidade de estímulo prévio. (Robertson, 2002; Abbas, et al., 2011).

Nesse tópico, o balanço entre imunidade e tolerância é importante para

manter a homeostase imune, onde muitos mecanismos são utilizados para

manter a resposta imune sob controle, incluindo-se a atividade das células

Natural Killer (NK) e T-reguladoras (T-reg) (Ota, et al., 2002; Qin, et al., 2008;

Engel and Kronenberg, 2012) e do importante papel de outros mediadores da

resposta imune como as quimiocinas (Clore and Gronenborn, 1995; Rollins,

1997).

Quimiocinas

As quimiocinas são uma grande família de citocinas estruturalmente

homólogas, de aproximadamente 8 a 12kD, que estimulam o movimento dos

leucócitos (quimiocinese) e regulam a migração destes do sangue para os

tecidos (quimiotaxia) sendo, portanto, citocinas quimiotáticas (Clore and

Gronenborn, 1995; Rollins, 1997). As citocinas, por sua vez, são mensageiros

do sistema imunológico. Correspondem a um extenso grupo de moléculas

que atuam emitindo sinais entre as células durante o desencadeamento da

resposta imune, atuando em diferentes etapas desta resposta (Abbas, et al.,

2011). As quimiocinas envolvidas em reações inflamatórias são produzidas

5

por leucócitos em resposta a estímulos externos e as quimiocinas que

regulam o tráfego celular entre os tecidos são produzidas e constituídas por

várias células, como endotélio, fibroblastos e megacariócitos (Moser and

Loetscher, 2001; Abbas, et al., 2011).

As moléculas da estrutura das quimiocinas possuem duas alças

internas de dissulfeto e são divididas em duas subfamílias dependendo da

posição de seus resíduos de cisteína aminoterminais imediatamente

adjacentes ( cys-cys) ou separados por um aminoácido ( cys-X- cys). Estas

diferenças se correlacionam com a organização de duas subfamílias

principais (CC e CXC) em aglomerados separados de genes. Cada

subfamília possui seu próprio receptor e tem funções diferenciadas uma da

outra. As quimiocinas CXC são quimiotáxicas para neutrófilos, enquanto as

CC não agem neste último grupo celular, mas atraem monócitos, basófilos e

linfócitos. Uma terceira família tem como única representante a fractalquina

(CX3CL1), em que a característica estrutural é a presença de duas cisteínas

separadas por três aminoácidos (CX3C) e tem por função a quimiotaxia de

linfócitos T e monócitos, além de promover a adesão de leucócitos com

células endoteliais. Finalmente, a quarta família, que tem dois

representantes, a linfotactina  (XCL1) e linfotactina  (XCL2), possui uma

única cisteína (família C) que promove a atração de células T. Esta

classificação foi realizada pela International Union of Immunological

Societies/World

Health

Organization

Subcommittee

on

Chemokine

Nomenclature (Bacon, et al., 2003).

Quimiocinas atuam por meio de receptores trans-membranas de alta

afinidade expostos na superfície de células circulantes. Onze receptores

diferentes para quimiocinas CC (chamadas CCR1 a CCR11) e seis para

quimiocinas CXC (chamadas CXCR1 a CXCR6) foram identificados (Moser

and Loetscher, 2001; Raman, et al., 2011). Os receptores de quimiocinas

possuem sítios de ligação que podem ser específicos (CCR9, CXCR6), mas,

comumente, o mesmo receptor pode ser alvo de ligação de várias

quimiocinas do mesmo grupo (Tabela 1 -Gonçalves, et al., 2007).

6

Os receptores de quimiocinas são expressos em leucócitos, com o

maior número de receptores diferentes vistos em linfócitos T. A expressão

dos receptores de quimiocinas pode definir subtipos de linfócitos T, como

Th1, Th2, Th17 ou mesmo Treg (Ekman, et al., 2013). Além disso, linfócitos T

periféricos maduros expressam diferentes receptores de quimiocinas

dependendo do seu fenótipo funcional. Estas diferenças determinam, em

parte, o tipo de resposta imune que irá se desenvolver em um sítio de

inflamação (Sallusto, et al., 1998; Bacon, et al., 2003; Ekman, et al., 2013).

7

Tabela 1 - Quimiocinas humanas identificadas até o momento – modificado

e atualizado de Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel

das quimiocinas nas uveítes. 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370.

Família

Quimiocina Nome Original

Receptores

Localização no Gene

CXC

CXCL1

GRO / MIP-2

CXCR2

24q21

CXCL2

GRO 

CXCR2

4q21

CXCL3

GRO 

CXCR2

4q21

CXCL4

PF-4

CXCR3

4q21

CXCL5

ENA-78

CXCR2

4q21

CXCL6

GCP-2

CXCR2

24q21

CXCL7

NAP-2

CXCR2

4q21

CXCL8

IL-8

CXCR2+CXCR1

24q21

CXCL9

MIG

CXCR3

4q21

CXCL10

IP-10

CXCR3

4q21

CXCL11

I-TAC

CXCR3

4q21

CXCL12

SDF-1

CXCR4

10q11.21

CXCL13

BCA-1

CXCR5

4q21

CXCL14

BRAK

Não determinado 5q31.1

CXCL15

Lungkine

Não determinado Não determinado

CXCL16

CXCL16

CXCR6

17p13

CC

CCL1

I-309

CCR8

17q11

CCL2

MCP-1

CCR2

17q12

CCL3

MIP-1

CCR1, CCR5

17q12

CCL4

MIP-1

CCR5

17q12

CCL5

RANTES

CCR5

17q12

CCL6

C10

Não determinado Não determinado

CCL7

MCP-3

CCR1, CCR2, CCR3 17q11

CCL8

MCP-2

CCR3, CCR5

17q11

CCL9

MIP-1

Não determinado Não determinado

CCL10

CCL10

Não determinado Não determinado

CCL11

Eotaxin

CCR3

17q11

CCL12

MCP-5

CCR2

Não determinado

CCL13

MCP-4

CCR2, CCR3

17q11

CCL14

HCC-1

CCR1, CCR5

17q12

CCL15

HCC-2/MIP-1/ Leotactin-1 CCR1, CCR3

17q12

CCL15

HCC-4/LEEC

CCR1, CCR2

17q12

CCL17

TARC

CCR4

16q13

CCL18

PARC/DC-CK1

Não determinado 17q12

CCL19

MIP-3/ELC

CCR7

9p13.3

CCL20

LARC/MIP-3

CCR6

2q36.3

CCL21

SLC/6Ckine

CCR7

9p13.3

CCL22

MDC

CCR4

16q13

CCL23

MPIF-1

CCR1

17q12

CCL24

Eotaxin-2/ MPIF-2

CCR3, CCR5

7q11

CCL25

TECK

CCR9

19q13.3

CCL26

Eotaxin-3

CCR3

7q11

CCL27

ESkine/MCC/Ctack

CCR10

9p13.3

CCL28

MEC

CCR3, CCR10

5p12

XC

XCL1

Linfotactina 

XCR1

1q24

XCL2

Linfotactina 

XCR1

1q24

CX3C

CX3CL1

Fractalkine

CX3CR1

16q13

8

Após serem ativados pelas quimiocinas, os receptores das quimiocinas

iniciam uma complexa cascata de sinalização que leva à ativação de

moléculas de integrina na superfície celular. As integrinas são moléculas

essenciais para que ocorra a adesão das células de defesa aos tecidos

envolvidos nos processos inflamatórios (Cameron and Kelvin, 2003).

Além das funções como agente quimiotático de linfócitos, os estudos

com as quimiocinas e seus receptores revelaram outros importantes papéis

para estas moléculas, como a sua relação com metástases tumorais e,

contraditoriamente, a inibição do crescimento de células tumorais, assim

como infecções e doenças autoimunes, como artrite reumatóide e esclerose

múltipla (Loetscher and Moser, 2002; Dong, et al., 2003; Raman, et al., 2011).

As quimiocinas exercem um papel soberano na progressão tumoral.

Processos inflamatórios crônicos promovem a formação tumoral e tanto as

células tumorais como as células do estroma, produzem quimiocinas e

citocinas. Estas atuam tanto por mecanismos autócrinos, como parácrinos

para sustentar o crescimento da célula tumoral, induzir a angiogênese e

facilitar a diminuição da vigilância imunológica (Raman, et al., 2007).

As quimiocinas e seus receptores também têm papel importante no

desenvolvimento e manutenção da imunidade inata e adaptativa (Raman, et

al., 2007) Além disso, atuam no processo de cicatrização de feridas e

angiogênese (Raman, et al., 2011). Quando o papel fisiológico das

quimiocinas é subvertido ou cronicamente ampliado, a doença pode se

desenvolver. Como estão envolvidas na fisiopatologia da inflamação crônica,

tumorigênese e metástase, assim como nas doenças autoimunes, tem sido

avaliado o uso potencial de antagonistas de quimiocinas para terapia salvo

apropriadas (Raman, et al., 2011). Apesar da ação das quimiocinas na

modulação da atividade de outras células do sistema imune ainda não ter

sido completamente elucidado, algumas de suas ações em outros

mediadores imunológicos como as células T-reguladoras e NK já são

bastante conhecidas (Qin, et al., 2008; Robertson, 2002).

9

Células T-reguladoras

O balanço entre imunidade e tolerância é importante para manter a

homeostase imune. Muitos mecanismos são utilizados para manter a

resposta imune sob controle, como a anergia de linfócitos T, a apoptose e a

ignorância imunológica (Abbas, et al., 2011). Um quarto mecanismo de

tolerância periférica é a supressão ativa por células reguladoras como células

T CD4+CD25high (T-reg) que expressam, constitutivamente, as moléculas

CTLA-4, GITR e Foxp3 (Fontenot, et al., 2005), células Th3 produtoras de

TGF-beta, células Tr1 produtoras de IL-10 e células T CD8+CD28- (Maloy and

Powrie, 2001; Askenasy, et al., 2008). As células T reguladoras foram

primeiramente descritas no início dos anos 70, mas como fatores

supressores solúveis hipotéticos não puderam ser identificados em nível

molecular e marcadores celulares apropriados não eram conhecidos

(Sakaguchi, et al., 1995). O conceito de célula T supressora permaneceu

esquecido por um longo tempo. A descoberta de Sakaguchi e colaboradores

de que a transferência adotiva de uma população de células T depletadas da

molécula CD25 induzia uma série de doenças autoimunes órgão-específicas

em recipientes imunodeficientes, colocou o modelo de células T reguladoras

novamente no foco da imunologia (Sakaguchi, et al., 1995). As células T

CD4+CD25high foram denominadas células T reguladoras (T-reg) e, desde

então, as mesmas têm sido intensivamente estudadas (Long and Buckner,

2011; Filaci, et al., 2011; Selmi, 2011)

Inicialmente, acreditava-se que eram células derivadas do timo

(Seddon and Mason, 2000), entretanto, depois verificou-se que essas células

também podem ser geradas na periferia (Waldmann and Cobbold, 2001). As

células T-reg podem ser ativadas por antígenos próprios ou não próprios e,

uma vez ativadas, podem suprimir células T de maneira antígeno não

específica (Jonuleit and Schmitt, 2003; Sakaguchi, et al., 2010). Os efeitos

supressivos dessas células não são restritos ao sistema imune adaptativo

(células T e B), mas podem também influenciar a ativação e a função de

células do sistema imune inato (monócitos, macrófagos, células dendríticas).

Após a ativação do TcR (receptor de células T para antígeno de superfície),

10

as células T-reg naturais inibem respostas imunes in vivo e in vitro de

maneira antígeno não específica, CHP não restrito e via um processo

independente de células apresentadoras de antígenos (CAA). Células T-reg

adaptativas são induzidas por antígenos, desenvolvem-se na periferia e

exercem sua função por meio da secreção de citocinas inibitórias (como IL-10

e TGF-β) ou tolerizando CAA por interações célula-célula (Maloy and Powrie,

2001; Selmi, 2011).

O Foxp3 foi identificado como um marcador molecular específico para

células T-reg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a função

desta célula. A expressão ectópica de Foxp3 em linfócitos T convencionais

pode conferir atividade supressora aos mesmos e estes também passam a

apresentar altos níveis de CD25. Aparentemente, o Foxp3 age estabelecendo

e mantendo o programa genético da T-reg e funciona como um regulador

negativo da ativação de células T e talvez como efetor transcricional de

programas de citocinas anti-inflamatórias (Fontenot, et al., 2005; Filaci, et al.,

2011; Josefowicz, et al., 2012).

No entanto, a identificação das células T-reg permanece problemática

porque não existe consenso acerca de seus marcadores. Algumas evidências

sugerem que todos os marcadores atualmente utilizados (CD25, CTLA-4,

GITR, LAG-3. CD127 e o próprio Foxp3) podem representar marcadores

gerais de linfócitos T, ao invés de serem realmente específicos para as

células T-reg. (Askenasy, et al., 2008; Corthay, et al., 2009). Apesar de que

as evidências mais recentes, assim como uma grande revisão sistemática

sobre o tema, demonstraram a especificidade de ação do Foxp3 como

marcador específico e efetor transcricional das células T-reg (Josefowicz, et

al., 2012; Peterson, et al., 2012)

Sabe-se que em humanos, as células T-reg são reguladas pelas

quimiocinas CCL17 e CCL21 (ligantes de CCR4 e CCR7) que podem

modular e expressar a sua atividade nos tecidos (Qin, et al., 2008).

11

Células Natural Killer

As células Natural Killer (NK) estão entre as principais células do

sistema imune dos vertebrados. O papel das células NK é análogo ao de

células T citotóxicas na resposta imune adaptativa. As células NK fornecem

respostas rápidas para as células infectadas por vírus e respondem à

formação de tumores, começando a atuar cerca de 3 dias após a infecção.

Sendo assim, desempenham importante papel na resposta inata podendo

diferenciar células infectadas por vírus, células neoplásicas e células normais

(Sikora, et al., 2011; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011).

As células NK são linfócitos e possuem a habilidade de eliminar

células-alvo de acordo com o reconhecimento do complexo de

histocompatibilidade principal (CHP) expresso em suas superfícies. Elas

reconhecem as células que expressam o CHP classe I como próprias, sendo

destruídas aquelas células que não o apresentam. Foram nomeadas natural

killers por causa da noção inicial de que não necessitam de ativação para

eliminar as células sem marcadores self do CHP classe I. São definidas como

linfócitos granulares grandes (LGG) e constituem o terceiro tipo de células

diferenciadas do antepassado comum linfóide que gera linfócitos B e T. Elas

podem também contribuir, por meio da produção de citocinas, na resposta

imune adaptativa contra patógenos intracelulares e células malignas

(Robertson, 2002; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011).

Além do conhecimento que as células NK são efetores da imunidade

inata, uma pesquisa revelou informações sobre a atividade tanto na ativação

quanto na inibição dos receptores das células NK, os quais desempenham

importante papel, tanto na função de auto-tolerância quanto na sustentação

da atividade das células NK (Arina, et al., 2007). Elas também desempenham

um papel na resposta imune adaptativa. Numerosas experiências têm

trabalhado para demonstrar a sua capacidade de facilmente adaptar-se ao

meio ambiente de forma quase que imediata e formular memória imunológica

antígeno específica, fundamental para responder a infecções secundárias

com o mesmo antígeno (Vivier, et al., 2011). A capacidade das células NK

para atuar tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa tem se tornado

12

objeto de pesquisa importante, na tentativa de se utilizar seus resultados em

potenciais terapias (Arina, et al., 2007).

Nos humanos células NK migram em resposta a ligantes conhecidos

das quimiocinas CXCR3 (CXCL9, 10, 11) e CXCR4 (CXCL12) e a quimiotaxia

de células NK é estimulada por XCL1 e CX3CL1 (Robertson, 2002).

Considerações sobre endometriose, células NK e células T-reg

Devido à função das células NK e T-reg, postula-se que elas

desempenhem importante papel na gênese da endometriose.

A primeira publicação em inglês avaliando a relação das células NK e

endometriose vem da Bélgica, em 1991(Oosterlynck, et al., 1991). Este grupo

avaliou o percentual de células NK em relação à subpopulação linfocitária em

sangue periférico e sua citotoxicidade em relação ao endométrio tópico das

mesmas pacientes. A atividade das células NK e a citotoxicidade contra o

endométrio tópico autólogo estava diminuída nas pacientes com

endometriose e, além disto, se correlacionava com a severidade da doença.

Após avaliação in vitro puderam observar que a citotoxicidade das células

NK era menor nas pacientes com endometriose quando comparadas às

mulheres sem a doença e que esta diminuição era menor, quanto maior fosse

o estadiamento da doença. O mesmo grupo ainda relatou uma diminuição da

atividade das células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose

(Oosterlynck, et al., 1992).

Da mesma forma, Kikuchi et al, (Kikuchi, et al., 1993) avaliaram o

percentual de células NK em sangue periféricos de 10 mulheres com

endometriose, 10 mulheres com miomas e 9 mulheres hígidas e encontraram

uma diminuição do percentual de células NK nas portadoras de

endometriose.

Dias Jr et al., em 2012, realizaram citometria de fluxo em sangue

periférico de 155 mulheres, sendo 100 pacientes com endometriose e 55

mulheres submetidas à laqueadura tubária. Estas mulheres foram

13

submetidas à laparoscopia e encontraram diferenças nas concentrações de

células NK em pacientes com endometriose profunda. Estas pacientes

apresentaram uma maior concentração de células NK no sangue periférico

(15,3%), em comparação às pacientes sem endometriose (9,8%). Ao

avaliarem as pacientes com estádio avançado da doença (especialmente

àquelas com doença de retossigmóide), esta diferença foi ainda maior (19,8%

vs. 10,3%).

Apesar de resultados díspares na literatura, sugere-se que as células

NK efetivamente participam do clearance das células endometriais

regurgitadas para a cavidade abdominal, durante o período menstrual

(Maeda, et al., 2002; Berbic & Fraser, 2013).

Em relação às células T-reguladoras, Berbic et al. (Berbic, et al., 2010)

demonstraram um aumento da expressão de Foxp3, em avaliação

imunoistoquímica, no endométrio tópico de pacientes com endometriose

durante a fase secretora do ciclo menstrual. Os autores postularam haver

diminuição da habilidade dos leucócitos em reconhecer e marcar

efetivamente antígenos endometriais regurgitados pela menstruação,

permitindo sua sobrevivência e, desta forma, a capacidade de se implantar

em sítios ectópicos. Além disto, a variabilidade da expressão do Foxp3

nestes sítios ectópicos, teve correlação com a fase do ciclo menstrual e com

as características e estádios de cada lesão.

Braundmeier et al. (Braundmeier, et al., 2012), utilizaram um modelo

animal de endometriose ( Papio anubis) e avaliaram a expressão de Foxp3 no

sangue periférico (imunoistoquímica) e endométrio tópico (RT-PCR) de

animais controles e com endometriose induzida. A expressão de Foxp3 e

células T-reg também estava reduzida no endométrio tópico comparada com

os animais controles, ao passo que estes parâmetros estavam aumentados

no endométrio ectópico quando comparados com o endométrio tópico.

Assim como na endometriose, no câncer parece haver um distúrbio da

resposta imune e algumas pesquisas têm tentado demonstrar que a inibição

das células T-reg poderia permitir uma melhor resposta às terapias

14

imunológicas contra a doença. Existem evidências de que certos regimes de

quimioterapia são capazes de mediarem seus efeitos, pelo menos em parte,

por meio da inibição das células T-reg. Já foi demonstrado que a

ciclofosfamida e o paclitaxel acarretam uma diminuição da população de

células T-reg maior do que outras células do sistema imune, diminuindo

também seu papel inibitório e possibilitando assim uma resposta mais

adequada das células do sistema imune (Menetrier-Caux, et al., 2012).

Podgaec et al, 2012, avaliaram 98 mulheres, sendo 70 com

endometriose e 28 sem a doença. Primeiramente, foram isolados os linfócitos

do fluído peritoneal e as células CD4+CD25high por meio da citometria de

fluxo. A seguir, foi utilizado o RT-PCR para se verificar a expressão de

Foxp3 nestas células. De todos os linfócitos isolados no fluído peritoneal das

mulheres com endometriose, 36,5% (mediana) foram CD4+CD25high, ao

passo que nas mulheres sem doença, somente 1,15% (mediana). O

resultado da expressão do Foxp3 foi semelhante, sendo 50 (pacientes com

endometriose) versus 5 (grupo controle).

Assim, para a hipótese do presente estudo, salientamos que a atuação

deste grupo de mediadores da resposta inflamatória parece ter importante

papel na coordenação da resposta imune contra as células endometriais.

Como demonstrado por Dias et al., 2012, as células NK estão aumentadas no

sangue periférico de pacientes com endometriose profunda e por Podgaec et

al, 2012, mostraram que as células T-reg também estão aumentadas no

fluido peritoneal das pacientes com endometriose, provavelmente, as células

endometriais, quando presentes na cavidade peritoneal não seriam

eliminadas desse local impróprio por ação deficiente em várias etapas da

resposta imune. Talvez o aumento das células NK seja compensatório pela

diminuição em sua citotoxicidade. Ou ainda que o aumento das células T-reg

poderia bloquear a resposta imune e, desta forma, permitir a implantação das

células endometriais. Este aumento poderia ainda ser compensatório, para

bloquear a exacerbação da resposta imune contra a instalação da

endometriose.

15

Sabemos que macrófagos e células dendríticas, que são células

apresentadoras de antígenos, podem estar ativadas e aumentadas, porém,

suprimidas pela ação das células T-reg aumentadas (Corthay, 2009;

Peterson, 2012).

Sabendo que as células NK são reguladas pelas quimiocinas CXCL9,

CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 e as T-reguladoras pelas

quimiocinas CCL17 e CCL21, o estudo destes mediadores que modulam a

atividade e migração destas células pode permitir uma melhor compreensão

de mais uma etapa da resposta imune e ainda contribuir, no futuro, para

eventuais tratamentos desta doença. Se estas células estão aumentadas, as

quimiocinas que regulam sua migração devem ter um expressão diferenciada

nas pacientes com endometriose.

16

2. OBJETIVOS

17

Objetivo principal

 Avaliar a expressão gênica de quimiocinas reguladoras da

atividade de células Natural Killer (CXCL9, CXCL10, CXCL11,

CXCL12, XCL1 e CX3CL1) e T-reguladoras (CCL17 e CCL21) no

tecido endometrial tópico e na lesão endometriótica de pacientes

com endometriose profunda (retossigmóide e retrocervical).

Objetivos específicos

 Relacionar, em pacientes com endometriose profunda, a expressão

gênica das quimiocinas reguladoras da atividade de células Natural

Killer e T-reguladoras com:

a. fase do ciclo menstrual;

b. quadro clínico;

c. estadiamento da endometriose (ASRM, 1996);

d. localização da doença: retrocervical e retossigmóide.

18

3. PACIENTES E MÉTODOS

19

3.1 Pacientes

3.1.1 Local de estudo e pacientes

O estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica

Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (HC-FMUSP). As pacientes foram divididas em

três grupos: pacientes com endometriose de retossigmóide confirmada

histologicamente (grupo A), pacientes com endometriose retrocervical

confirmada histologicamente (grupo B) e pacientes sem endometriose

submetidas à cirurgia de laqueadura tubária como método de planejamento

familiar (grupo C). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição

(nº0025/10). As pacientes foram previamente informadas sobre o estudo e o

material foi coletado após a assinatura do termo de consentimento livre e

esclarecido, pelas mesmas. A coleta das amostras respeitou os princípios

éticos, práticos e de biossegurança estipulados pelo Ministério da Saúde e

pelas Comissões de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da instituição.

3.1.2 Número de paciente estudados

Trata-se de estudo caso-controle prospectivo exploratório, com

um n de 64 pacientes entre casos e controles, que foi o número de casos

operados consecutivamente em um ano.

3.1.3 Critérios de inclusão/exclusão

Determinou-se para os grupos A e B os seguintes critérios de inclusão:

 Idade entre 18 e 40 anos;

 Ciclos menstruais eumenorreicos com o intervalo entre os ciclos

variando de 26 a 34 dias;

 Endometriose comprovada histologicamente em região de

retossigmóide (A) ou retrocervical (B);

20

 Ausência de doenças autoimunes comprovadas por anamnese,

exame físico e laboratoriais quando necessário;

 Não utilização de terapêutica hormonal nos três meses que

antecederam a cirurgia, incluindo análogos de GnRH,

progestagênios e contraceptivos hormonais orais.

Para o grupo C, foram selecionadas mulheres respeitando os mesmos

critérios acima, com exceção da confirmação histológica de endometriose.

3.2 Métodos

3.2.1 Dinâmica do Estudo

Todas as pacientes foram avaliadas do ponto de vista clínico pela

história, exame físico e de imagem (ultrassonografia pélvica e/ou transvaginal

e ressonância magnética, quando apropriado), de acordo com a indicação

clínica para confirmação da suspeita de endometriose e posterior indicação

cirúrgica.

A decisão sobre a realização de tratamento clinico ou cirúrgico

depende, de forma preponderante, do quadro clínico, assim como do desejo

reprodutivo, idade da paciente e das características das lesões. No grupo A,

as pacientes foram submetidas à cirurgia quando da presença de lesão em

retossigmóide à ultrassonografia e que não apresentaram melhora clínica

após 6 a 12 meses de tratamento, ou ainda, quando havia quadro sugestivo

de suboclusão intestinal. No grupo B, foram encaminhadas para cirurgia as

pacientes com ultrassom sugestivo de lesões retrocervicais e que

apresentavam falha do tratamento clínico após 6 a 12 meses de tentativa.

Com relação ao grupo C, foram encaminhadas para cirurgia de

laqueadura tubária, pacientes com prole constituída e sem desejo

reprodutivo. Durante a cirurgia foi possível confirmar a ausência de lesões de

endometriose.

21

No momento da vídeo-laparoscopia foi anotado o dia do ciclo

menstrual, sendo considerado como fase folicular do primeiro ao décimo

quarto dia do ciclo e fase lútea do décimo quinto até o último dia do ciclo

menstrual.

Os fragmentos de endométrio das participantes do estudo foram

coletados com cureta de Pipelle antes do início da vídeo-laparoscopia. Os

fragmentos das lesões de endometriose foram coletados apos a exérese dos

mesmos durante o procedimento terapêutico. Foi coletado aproximadamente

3cm2 de tecido por paciente.

Cada fragmento coletado foi dividido em duas partes iguais: a primeira

foi armazenada em tubo com RNAlatter (Qiagen® -Ontario- CA code 76106)

a -80ºC e a segunda encaminhada para o Departamento de Anatomia

Patológica, para seguir os trâmites habituais do diagnóstico histológico da

doença.

3.2.2 Quadro Clínico

Todas as pacientes foram questionadas sobre os seis sintomas

relacionados à endometriose:

1. Dismenorréia – dor em cólica durante o período menstrual;

2. Dispareunia de profundidade – dor pélvica durante o ato sexual;

3. Dor pélvica acíclica – dor pélvica sem relação com o período

menstrual, constante, sem melhora com o uso de analgésicos;

4. Infertilidade – dificuldade para um casal, sem o uso de métodos

contraceptivos, engravidar por pelo menos um ano de tentativa, com

vida sexual ativa (duas ou mais relações por semana);

5. Alteração intestinal cíclica – dor e/ou sangramento à evacuação no

período menstrual;

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22

6. Alteração urinária cíclica – dor e/ou sangramento à micção no período

menstrual.

Todos os quadros álgicos tiveram sua intensidade avaliada de acordo com

uma escala analógica de dor (anexo 1).

Quadro 1 – Representação esquemática da dinâmica de estudo

3.2.3 Estadiamento da Endometriose

As pacientes do grupo A foram estadiadas segundo a classificação da

American Society for Reproductive Medicine (1996) (Figura 1). Para fins

estatísticos, agrupamos os estádios I e II como “estádio inicial” e os estádios

III e IV como “estádio avançado”.

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23

Figura 1: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for

Reproductive Medicine (1996)

24

3.3 Detecção das quimiocinas por PCR em tempo real no endométrio

tópico e nas lesões endometrióticas

Extração de RNA

Células do endométrio tópico e lesão endometriótica, obtidas durante o

procedimento cirúrgico dos pacientes e dos indivíduos controle, foram

descongeladas, pulverizadas em gral com nitrogênio líquido e submetidas à

extração do RNA total, por meio da técnica descrita por Chomizinski and