Expressão diferencial de genes induzidos por antracnose em feijoeiro em resposta à indução da... por Ana Luiza Ahern Beraldo - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA

ANA LUIZA AHERN BERALDO

Expressão diferencial de genes induzidos por antracnose em feijoeiro em

resposta à indução da resistência por silício

Piracicaba

2012

ANA LUIZA AHERN BERALDO

Expressão diferencial de genes induzidos por antracnose em feijoeiro em

resposta à indução da resistência por silício

Versão revisada de acordo com a Resolução CoPGr 6018 de 2011

Tese apresentada ao Centro de Energia Nuclear na

Agricultura da Universidade de São Paulo para a

obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Biologia na Agricultura e no

Ambiente

Orientadora: Profa. Dra. Siu Mui Tsai

Piracicaba

2012

AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER

MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE

QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP

Beraldo, Ana Luiza Ahern

Expressão diferencial de genes induzidos por antracnose em feijoeiro em resposta à

indução da resistência por silício / Ana Luiza Ahern Beraldo; orientadora Siu Mui

Tsai. - - Versão revisada de acordo com a Resolução CoPGr 6018 de 2011. - -

Piracicaba, 2012.

172 f. : il.

Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de

Concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na

Agricultura da Universidade de São Paulo.

1. Bioinformática 2. Biologia molecular 3. Expressão gênica 4. Feijão 5. Fungos

fitopatogênicos 6. Interação planta-patógeno 7. Microscopia eletrônica de varredura

8. Reação em cadeia por polimerase I. Título

CDU 575.111 : 633.35

Dedico este trabalho ao meu pai Antonio Ludovico, e

aos meus irmãos Ana Lídia e Francisco, que sempre me

apoiaram e torceram pelo meu sucesso;

Ao Almir, por me amar, me apoiar, por ser meu

companheiro e me fazer muito feliz;

A toda minha família, em especial aos meus queridos avós

Gervásio e Efigênia;

A todos meus amigos que de certa forma me apoiaram

durante o decorrer deste trabalho;

Ofereço este trabalho a minha mãe, Maria Amélia, pela

sua força, coragem e determinação. Por ser uma

pessoa maravilhosa, capaz de sorrir, mesmo na dor,

conseguindo só ver o lado bom da vida. Você é um

exemplo a ser seguido.

“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas,

que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos

caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o

tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado,

para sempre, à margem de nós mesmos.”

Fernando Pessoa

AGRADECIMENTOS

À Profa. Siu Mui Tsai, não só pela orientação, ensinamentos e oportunidades de aprendizado

concedidas durante estes anos, mas principalmente pela sua generosidade;

Ao Programa de Pós-Graduação do CENA/USP pelas oportunidades concedidas no decorrer

deste trabalho e principalmente aos funcionários da Pós, sempre dispostos a ajudar;

Ao CNPq pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de estudos;

Aos técnicos do Laboratório de Biologia Celular e Molecular: Fábio Duarte, Elias Gomes,

Wagner Piccinini e principalmente ao Francisco Montrazi (Chiquinho), pelo apoio nos

experimentos, ajuda na casa de vegetação e principalmente pela amizade...vamos sentir

saudades de você;

À Danielle Gregógio Gomes Caldas, pelos conselhos durante o decorrer do trabalho;

À querida Ludmila Campos, sempre presente, sorridente e prestativa;

Ao Bean Team Aline, Milena, Enéas e Gustavo;

A todos os alunos da Profa. Tsai: Acácio, Bia, Clóvis, Caio, Dennis, Felippe, Fernanda, Lina,

Lucas, Marcela, Marina, Marília e Naissa;

Aos alunos do Laboratório de cima: Rafael, Carol e Fabiana pelos dias divertidos que

passamos juntos, e em especial a minha querida Maria Julia (Maju) vou sentir falta dos nossos

papos...Aos alunos que já saíram do CENA, Aline, Amanda, Mariana Redondo e

principalmente a Mariana Germano, pessoa especial...muito querida;

Em especial aos meus meninos queridos Enéas e Gustavo. Eu sempre serei grata a vocês pela

amizade sincera que construímos nesses quatro anos;

Ao Welligton e Juan pela amizade, risadas, jantares;

Aos amigos Thiago Mezetti, Fernanda Raquel, Regina Priolli e Natalie pelas distrações nos

finais de semana;

Aos pesquisadores do Centro de Grãos e Fibras do IAC: Sérgio Augusto Moraes Carbonell e

Alisson Fernando Chiorato não só por me cederem todo o espaço necessário para a realização

dos experimentos de inoculação, disponibilização de sementes, pela ajuda nas avaliações, mas

também pelo carinho e confiança que depositaram em mim durante todos esses anos;

Ao Centro de Fitopatologia do IAC, principalmente a Profa. Margarida Fumiko Ito e Renata

Guillen, pela gentileza e pela disponibilização dos isolados do patógeno;

Ao pesquisador do CBMEG-UNICAMP Dr. Márcio José da Silva, não só pelo

sequênciamento e análises dos dados de bioinformática, mas também pela amizade construída

durante esses anos;

À Profa Adriana Martinelli pela disponibilização do espaço e regentes para os experimentos

de Microscopia e em especial a técnica Monica Lanzoni Rossi, pessoa muito querida e sempre

disposta a ajudar, responsável pelas fotos realizadas durante este trabalho.

Ao laboratório NAP/MEPA da ESALQ/USP, em especial ao Prof. Elliot Watanabe Kitajima

não só pela disponibilização do uso do microscópio, mas também pela simpatia e gentileza;

Ao professor Mario Fernando de Goes pela disponibilização do equipamento de EDX e ao

Adriano L. Martins, pela ajuda na obtenção das análises;

A toda a minha família de Boa Esperança do Sul e de Paulínia;

Ao amigo Carlos Ivan Aguillar Vildoso.

Aos meus amigos da Panela 99 que me acolheram muito bem e que hoje são meus amigos

também.

RESUMO

BERALDO, A. L. A. Expressão diferencial de genes induzidos por antracnose em feijoeiro em

resposta à indução da resistência por silício. 2012. 172f. Tese (Doutorado) – Centro de Energia

Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2012.

O feijão é importante fonte carboidratos, vitaminas, minerais e fibras. No Brasil, a

produtividade desta leguminosa é baixa e um dos fatores é a ocorrência de doenças como a

antracnose causada pelo Colletothrichum lindemuthianum, que gera perdas de até 100% da

produção. Plantas possuem diversos mecanismos de defesa contra patógenos e relatos

apontam que o silício é capaz não só de promover mudanças morfológicas nas folhas, mas

também de ativar os genes de resistência. O presente trabalho foi dividido em três estudos que

tinham como objetivo: (1) entender a resposta de três cultivares de feijoeiro ao silício

disponível na solução nutritiva; (2) identificar a contribuição do Si na expressão de genes

relacionados à infecção pelo fungo através da construção de duas bibliotecas subtrativas por

supressão (SSH), visando selecionar genes diferencialmente representados durante a infecção

da planta com a raça 65 de C. lindemuthianum (a) e durante a infeção da planta na presença de

uma maior dose silicato de potássio (75 ppm) no substrato (b); (3) identificar a resposta de

dez transcritos selecionados no Estudo 2 para tentar entender a resposta dos mesmos em

diferentes períodos (0; 6; 42; 72 h) após a inoculação, com ou sem suplemento de Si. Como

resultados, foi observado que para as três cultivares avaliadas o Si começa a ser absorvido 14

dias após o transplante. Também foi identificado por de microscopia de varredura (MEV) que

não há diferença significativa entre o número de tricomas e cada cultivar, mas que para o

número de estômatos a cultivar IAC-Harmonia destacou-se das demais. Além disso, quando

as três cultivares foram suplementadas com Si, houve a formação de uma cera epicuticular

descrita como mecanismo de defesa da planta contra fungos; e que através de EDX (Energy-

dispersive X-ray spectroscopy) foi possível constatar que plantas tratadas com Si apresentam

maior teor deste elemento nas folhas. Através de inoculações com a raça 65 do patógeno

verificou-se o efeito do mineral na redução da severidade da doença nas cultivares IAC-

Harmonia e Pérola. No segundo estudo, duas bibliotecas de hibridização subtrativa por

supressão (SSH), foram construídas visando selecionar os genes diferencialmente expressos

entre plantas inoculadas e não-inoculadas (A) e entre plantas inoculadas e tratadas ou não com

75 ppm de Si (B). Foram geradas 991 sequências únicas, anotadas através do GeneOntolgy.

Quinze genes de cada biblioteca foram selecionados para os experimentos de validação por

RT-qPCR. Para a Biblioteca A, 11/15 genes foram positivamente regulados, e em B, 14/15.

No terceiro estudo ficou evidenciado que a inoculação com o patógeno alterou positivamente

a expressão de sete genes, enquanto que o tratamento com 75 ppm de Si alterou a expressão

de oito genes, em pelo menos um dos tempos avaliados.

Palavras-chave: Phaseolus vulgaris L. Colletothrichum lindemuthianum. Silicato de

potássio. Biblioteca de hibridização subtrativa por supressão (SSH). Expressão gênica. RT-

qPCR.

ABSTRACT

BERALDO, A. L. A. Differential expression of genes activated by anthracnose in response to silicon

induced resistance. 2012. 172 f. Tese (Doutorado) – Centro de Energia Nuclear na Agricultura,

Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2012.

Beans are an important source of carbohydrates, vitamins, minerals and fibers. In Brazil, this

legume still has low productivity and one of the factors involved is the occurrence of diseases

such as anthracnose, caused by the fungus Colletothrichum lindemuthianum, which causes

losses in production of up to 100%. Plants present several defense mechanisms against

pathogens and the reports indicate that silicon does not only promote morphological changes

in leaves, but also activates resistance genes. This work was divided into three studies aiming:

(1) to understand the response of three bean cultivars to a silicon source in a nutrient solution,

(2) to identify the contribution of Si in the expression of genes related to the infection by the

fungus by constructing two subtractive suppression libraries (SSH), to select genes

differentially represented during infection of the plant with race 65 of C. lindemuthianum (a)

and during infection of the plant in the presence of higher dose of potassium silicate (75 ppm)

in the substrate (b), (3) to identify the response of ten selected transcripts in Study 2 in various

periods (0, 6, 42, 72 h) after inoculation, with or without supplemental Si. As a result, it was

observed that for all three cultivars Si begins to be absorbed 14 days after transplantation.

Was also identified by microscopy (SEM) that there is no significant difference between the

number of trichomes among cultivars, but that the number of stomata for the IAC-Harmonia

stood out from the rest. Moreover, when the three cultivars were supplemented with Si, thus

forming an epicuticular wax described as a defense mechanism against plant fungi, and that

by EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) it was found that plants treated with Si have

higher content of this element in leaves. Through inoculations with race 65 of the pathogen it

was verified the effect of the mineral in reducing disease severity in IAC-Pérola and IAC -

Harmonia. In the second study, two libraries from suppression subtractive hybridization

(SSH) were constructed in order to select the differentially expressed genes between

inoculated and non-inoculated (A) and between plants inoculated and treated or not with 75

ppm of Si (B). In total, 991 unique sequences were generated, those recorded by

GeneOntolgy. Fifteen genes from each library were selected for the validation experiments by

RT-qPCR. For library A, 11/15 genes were positively regulated, and in B, 14/15. In the third

study it is showed that inoculation with the pathogen positively altered expression of seven

genes, whereas treatment with 75 ppm of Si changed the expression of eight genes, in at least

one of the times analyzed.

Palavras-chave: Phaseolus vulgaris L. Colletothrichum lindemuthianum. Potassium silicate.

Suppressive subtractive hybridization (SSH). Gene expression. RT-qPCR.

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 21

1.1 Hipótese......................................................................................................................................23

1.2 Objetivos....................................................................................................................................23

1.2.1 Objetivo geral............................................................................................................................23

1.2.2 Objetivos específicos.................................................................................................................23

2

REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................. 25

2.1

Importância econômica e social da cultura do feijoeiro ...................................................... 25

2.2

Antracnose do feijoeiro ........................................................................................................... 27

2.3

Indução de resistência ............................................................................................................. 32

2.4

O papel do silício na indução de resistência nas plantas ...................................................... 35

2.4.1. Absorção pelas plantas............................................................................................................ 35

2.4.2. Benefícios ................................................................................................................................. 37

2.4.3. Estresses bióticos ..................................................................................................................... 38

2.4.4. Estresse abióticos ..................................................................................................................... 40

2.5

Identificação e isolamento de genes de resistência ............................................................... 40

2.6

Classificação de genes através da ferramenta Gene Ontology (GO) .................................. 44

2.7

Análise de expressão gênica através de RT-qPCR em tempo real ...................................... 45

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 47

3

ESTUDO 1: RESPOSTA DO FEIJOEIRO SUPLEMENTADO COM SILÍCIO AO

ESTRESSE CAUSADO PELO FUNGO Colletothrichum lindemuthianum..................................... 57

RESUMO ............................................................................................................................................. 57

ABSTRACT ........................................................................................................................................ 58

3.1

INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 59

3.2

MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 60

3.2.1 Material Vegetal ..................................................................................................................... 58

3.2.1.1 Determinação do teor de silício nas folhas de feijoeiro diferentes estádios de

desenvolvimento da planta ................................................................................................................. 60

3.2.1.2.Determinação do teor de silício nas folhas de feijoeiro em três diferentes variedades de

feijoeiro ................................................................................................................................................ 62

3.2.1.3 Análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV), de luz (MO) e EDX (Energy-

dispersive X-ray spectroscopy). ......................................................................................................... 62

3.2.1.4.Teste de verificação da raça do patógeno ............................................................................. 64

3.2.1.5. Verificação da atenuação da infecção por C. lindemuthianum pelo silicato de

potássio.... ...............................................................................................................................................65

3.3

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 66

3.3.1 Absorção de silício em diferentes estádios fenológicos do feijoeiro .................................... 66

3.3.2. Absorção diferencial de silício entre genótipos de feijoeiro ................................................ 68

3.3.3 Modificações morfológicas e/ou estruturais em folhas tratadas com silício ...................... 69

3.3.3.1.Análises de folhas não tratadas com silício........................................................................... 69

3.3.3.2.Análises de folhas tratadas com silício .................................................................................. 71

3.3.3.3. Verificação da remediação da antracnose pelo silicato de potássio .................................. 77

3.3.3.4.Alterações na espessura da epiderme ................................................................................... 80

3.3.3.5.Deteminação de silício através do EDX ................................................................................ 82

3.4

CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 84

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 85

4

ESTUDO 2: DETERMINAÇÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS

ATRAVÉS DE BIBLIOTECA SSH .................................................................................................. 89

RESUMO ............................................................................................................................................. 89

ABSTRACT ......................................................................................................................................... 90

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 91

4.2 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 92

4.2.1 Material vegetal ....................................................................................................................... 92

4.2.2 Bibliotecas ................................................................................................................................ 92

Biblioteca A .......................................................................................................................................... 92

Biblioteca B .......................................................................................................................................... 93

4.2.3 Extração e Purificação de RNA total ..................................................................................... 93

4.2.4 Purificação do mRNA ............................................................................................................. 94

4.2.5 Construção da biblioteca subtrativa de cDNA ..................................................................... 95

4.2.6 Síntese da 1ª fita de cDNA e amplificação por LD-PCR. ..................................................... 95

4.2.7 Cromatografia em coluna ....................................................................................................... 97

4.2.8 Digestão das fitas de ds-cDNA ................................................................................................ 97

4.2.9 Purificação da digestão e ligação dos Adaptadores. ............................................................ 98

4.2.10. Ligação dos adaptadores ........................................................................................................ 98

4.2.11 Análise da ligação ................................................................................................................... 99

4.2.12 Hibridizações ......................................................................................................................... 100

4.2.13 Amplificação das sequências de cDNA diferencialmente expressas ................................ 101

4.2.14 Purificação do DNA .............................................................................................................. 101

4.2.15 Clonagem em vetor usando pGEM®- T Easy Vector ....................................................... 101

4.2.16. Transformação em bactérias quimiocompetentes ............................................................. 102

4.2.17. Preparação de DNA plasmidial em placas ......................................................................... 102

4.2.18 Protocolo de sequênciamento .............................................................................................. 103

4.2.19 Análise das sequências (Bioinformática) ............................................................................ 103

4.2.20 Anotação das sequências através do Gene Ontology (GO) ............................................... 105

4.2.21 Desenho dos primers para validação das bibliotecas ........................................................ 105

4.2.22 Validação das duas bibliotecas subtrativas por RT-qPCR ............................................... 110

4.2.23 Análise dos dados de expressão .......................................................................................... 111

4.2.24 Programas LinRegPCR e REST ......................................................................................... 112

4.3

RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 112

4.3.1 Sequênciamento e bioinformática. ...................................................................................... 112

4.3.2 Categorização dos genes pelo programa Gene Ontology .................................................. 120

4.3.3 Validação das bibliotecas por qRT-PCR............................................................................. 124

4.4

CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 128

REFERÊNCIAS ................................................................................................................................ 129

5

Estudo 3: Análise da Expressão Gênica em resposta a infecção por C. lindemuthianum, e

suplemento de Si. ............................................................................................................................... 132

RESUMO ........................................................................................................................................... 132

ABSTRACT ....................................................................................................................................... 133

5.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 134

5.2 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 135

5.2.1 Análise da expressão dos genes selecionados sob efeito do ataque do patógeno e

suplementação com Si. ...................................................................................................................... 136

5.3

RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 138

5.3.1 Variação da expressão gênica de genes responsivos ao estresse por antracnose e/ou

suplemento de Si. ............................................................................................................................... 138

5.4

CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 160

REFERÊNCIAS ................................................................................................................................ 161

ANEXOS……………………………………………………………………………………………..167

21

1 INTRODUÇÃO

A produtividade do feijoeiro no Brasil é considerada baixa, e vários fatores estão

relacionados a isso, como por exemplo, adversidades climáticas, deficiências na adubação

e/ou fertilidade do solo, uso inadequado de cultivares e de espaçamento de plantas,

zoneamento agrícola inadequado, e principalmente devido à ocorrência de doenças e pragas

em toda a época de plantio da cultura.

Dentre essas doenças, destaca-se a antracnose causada pelo fungo Colletothrichum

lindemuthianum, por ser frequente não apenas no estado de São Paulo, mas também em todos

os estados produtores de feijão do Brasil (ALZATE-MARIN; SARTORATO, 2004). Esta

doença causa um impacto negativo na cultura do feijoeiro, pois as vagens infectadas resultam

em um decréscimo na qualidade e número dos grãos (BÉRNARD-CAPELLE et al., 2006) e

dependendo do grau de infecção, pode causar perdas de até 100% da produção (BIANCHINI

et al., 2005).

Na natureza, este patógeno pode penetrar na planta através de aberturas naturais como

estômatos ou ferimentos; através da penetração forçada (força mecânica exercida pelo

patógeno); ou mesmo através da secreção de enzimas que degradam a cutina, facilitando a

penetração; e, por fim, a última hipótese é que ambos os mecanismos possam interagir para

auxiliar a penetração (BAILEY et al., 1992).

Sendo assim, a resposta de defesa de plantas contra patógenos está associada com

diversos eventos precoces e tardios, no que se diz respeito ao início do estresse. Vários

eventos fisiológicos, moleculares e celulares, como ativação do metabolismo de estresse

oxidativo, mudanças no fluxo iônico ou mesmo na síntese de fitoalexinas e de uma série de

proteínas relacionadas à patogênese (PR), ocorrem durante a resposta da planta seguida da

infecção pelo patógeno. Além disso, as plantas são capazes de aumentar a força da matriz

extra-celular através da formação de cutina e deposição de calosidades. Estas respostas ativas

e passivas levam tanto a defesas locais quanto sistêmicas contra uma série de ataque de

patógenos (BENHAMOU; BÉLANGER, 1998; OROBER; SIEGRIST; BUCHENAUER,

2002; SAROWAR et al., 2009; FALARA et al., 2011; MAZID; KHAN; MOHAMMAD,

2011).

Diferentes compostos inorgânicos ou orgânicos e diversas substâncias de origem

biológica induzem resistência em plantas. Essas substâncias foram denominadas indutores,

devido a sua capacidade de induzir resistência contra doenças nas plantas tratadas, sem

22

apresentarem um efeito antimicrobiano direto sobre os agentes patogênicos. Os indutores

podem ser compostos inorgânicos, como sais de fosfato (OROBER; SIEGRIST;

BUCHENAUER, 2002); compostos orgânicos, como os ácidos graxos araquidônico,

linoleico, linolênico e oleico (COQUOZ et al., 1995); quitosanas (BENHAMOU;

THERIAULT, 1992); ácido salicílico, (MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1998) , dentre outros.

Diversos estudos comprovam o efeito do silício na ativação de genes envolvidos na

produção de compostos secundários do metabolismo, como os polifenóis e enzimas

relacionadas com os mecanismos de defesa (FAUTEAUX et al., 2005) e acúmulo de

componentes antifúngicos como as fitoalexinas e proteínas relacionadas à patogênese (FAWE

et al., 1998; RÉMUS-BOREL; MENZIES; BÉLANGER, 2005; FAUTEUX et al., 2006).

Além disso, a ação benéfica da aplicação de silício em plantas tem sido associada a outros

efeitos como: aumento na capacidade fotossintética, plantas mais eretas, redução da

transpiração, aumento da resistência mecânica das células, maior resistência das plantas a

insetos e doenças; diminuição do efeito tóxico de certos metais pesados; maior tolerância ao

estresse hídrico e salino e a radiação ultravioleta, dentre outros (LANA et al., 2003; SHEN et

al., 2010; HASHEMI; ABDOLZADEH; SADEGHIPOUR, 2010; CHEN et al., 2011).

Desta forma, o presente trabalho se propõe a elucidar o efeito do silicato de potássio

durante a interação feijoeiro vs a raça 65 de C. lindemuthianum. Para isso, genótipos de

feijoeiro, contrastantes para a resposta à antracnose foram utilizados nas análises buscando

identificar modificações estruturais nas folhas e/ou atenuação da infecção pelo patógeno após

o tratamento com silicato de potássio.

Além disso, a identificação de genes de hospedeiros envolvidos em respostas de defesa

é importante para a elucidação dos mecanismos de resistência em plantas contra patógenos. A

técnica de hibridização subtrativa (DIATCHENKO et al., 1996) foi a metodologia escolhida

por permitir que apenas os transcritos diferencialmente expressos durante esta interação sejam

selecionados. Desta forma, dois conjuntos de bibliotecas subtrativas foram criados, a primeira

visando selecionar transcritos presentes durante a infecção do feijoeiro pelo C.

lindemuthianum e a segunda, também selecionando transcritos que ocorrem durante a

infecção porém em plantas tratadas com o silicato de potássio. Os transcritos diferencialmente

selecionados nas duas bibliotecas foram usados nos experimentos de expressão gênica no

decorrer do tempo após a infecção.

23

1.1 Hipóteses

a) O silício é capaz de induzir ou aumentar a resistência de Phaseolus vulgaris contra estresses

bióticos;

b) Plantas tratadas com silício devem apresentam modificações estruturais na parede celular da

epiderme foliar, dificultando, assim, a penetração de patógenos;

c) Como o Si atua como indutor de resistência, ele deve favorecer uma expressão diferencial dos

genes relacionados à defesa do feijoeiro contra C. lindemuthianum.

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo Geral

O presente estudo propôs-se a analisar a contribuição do silicato de potássio em

promover mudanças na morfologia, na atenuação da infecção e na expressão de genes de

plantas da variedade IAC-Harmonia inoculada com a raça 65 de C. lindemuthianum.

1.2.2 Objetivos Específicos

a) Estudar a resposta do feijoeiro à adição de silicato de potássio na solução nutritiva, visando

identificar em qual fase do desenvolvimento a planta aumenta a absorção de Si; verificar o

teor de Si absorvido por diferentes variedades de feijoeiro; analisar se o Si é capaz de

promover alguma mudança estrutural nas folhas e avaliar se a aplicação de Si é capaz de

promover uma redução nos sintomas da infecção do feijoeiro pela raça 65 de C.

lindemuthianum;

b) Identificar através da contrução de duas bibliotecas de hibridização subtrativa por supressão

(SSH), genes diferencialmente expressos na interação feijoeiro vs Colletothrichum

24

lindemuthianum e de feijoeiro vs Colletothrichum lindemuthianum em condições normais ou

acrescidas de silício;

c) Analisar a expressão temporal destes genes em plantas de feijoeiro sob três tipos de

estresse: (i) inoculados com a raça 65 de C. lindemuthianum e irrigados com solução nutritiva

contendo 75ppm de silicato de potássio; (ii) inoculados com a raça 65 C. lindemuthianum e

irrigados com solução nutritiva sem adição de silicato de potássio e (iii) não-inoculados com o

patógeno e irrigados com solução nutritiva sem adição de silicato de potássio, de através de

PCR em tempo real.

25

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Importância econômica e social da cultura do feijoeiro

Entre as leguminosas, o feijoeiro-comum ( Phaseolus vulgaris) é considerado a segunda

cultura de maior importância atrás apenas da soja (SINGH; MUÑOZ, 1999). O feijoeiro é

uma das culturas mais antigas do Novo Mundo e junto com o milho e a mandioca, foram os

principais alimentos nas Américas por milênios. Em alguns países como México e Brasil, os

feijões são a principal fonte de proteínas consumida por estas populações. O feijão também é

fonte de ferro, fósforo, magnésio, manganês, zinco, cobre, cálcio (BROUGHTON et al. ,

2003), carboidratos, vitaminas, minerais e fibras da população brasileira (BULISAMI, 2003).

Um adulto chega a consumir de 15 a 20 kg de feijão por ano, o que fornece cerca de 10 a 20%

dos nutrientes necessários para seu desenvolvimento (BROUGHTON et al., 2003).

A organização atual da diversidade genética no conjunto gênico de espécies cultivadas

do feijoeiro é resultado da evolução natural e do cultivo durante os séculos. Antes da

domesticação, o feijoeiro selvagem já tinha se divergido em dois grandes centros de origem, o

Mesoamericano e o Andino, cada um deles com suas distribuições geográficas características

(GEPTS, 1998).

Grande parte dos produtores de feijão na América Latina incluindo o Brasil possuem

pequenas fazendas cujo tamanho varia de 1 a 10 hectares (BROUGHTON et al. , 2003). O

feijoeiro é uma das culturas de elevada relevância socioeconômica para o Brasil, sendo os

principais produtores: Paraná, Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Bahia, os quais respondem

por mais de 65% da produção nacional. Em 2011 as grandes regiões produtoras de cereais,

leguminosas e oleaginosas apresentaram a seguinte distribuição: Região Centro-Oeste, 62,8

milhões de toneladas; Sul, 56,5 milhões de toneladas; Sudeste, 18,4 milhões de toneladas;

Nordeste, 16,4 milhões de toneladas; e Norte, 4,5 milhões de toneladas. Para 2012, o Mato

Grosso lidera como maior produtor nacional de grãos, com uma participação de 23,1%,

seguido pelo Paraná, com 19,3% e Rio Grande do Sul, com 12,5% (IBGE, 2012). Ainda

segundo o IBGE, para o feijão da 2ª safra, a produção esperada registra um incremento de

3,1% frente a fevereiro, alcançando 1.397.398 toneladas, acréscimo observado em função da

26

estimativa de maior de área plantada nos estados de Paraná, Minas Gerais, Mato Grosso e

Goiás.

Ainda para 2012, a estimativa da área a ser cultivada com as principais culturas é 4,8%

maior que a cultivada na safra 2010/2011, passando de 49,89 para 52,29 milhões de hectares,

representando um aumento de 2,4 milhões de hectares. A estimativa da área cultivada em

2012 com feijão sinaliza uma diminuição de área na maioria dos Estados produtores,

principalmente devido aos problemas climáticos adversos onde os Estados mais prejudicados

foram: Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Desta forma, o somatório das áreas

consolidadas e previstas para o cultivo de feijão, nas três épocas de plantio, deve ser de 3,9

milhões de hectares, 2,4% a menos que na safra 2010/2011 (CONAB, 2012).

A evolução das práticas culturais, aliadas ao desenvolvimento de cultivares modernas e

a adoção de tecnologias pelos agricultores brasileiros, permitiu expressivo ganho em

produtividade, saindo de patamares de 500 kg/ha de média nacional, no final da década de

1970, para 1.000 kg/ha na safra de 2009/2010 (RICHETTI; de MELO; de SOUZA, 2011).

Entretanto, esses valores ainda são considerados baixos e vários fatores estão relacionados a

isso, como a ocorrência de adversidades climáticas, deficiências na adubação e/ou fertilidade

do solo, uso inadequado de cultivares e de espaçamento de plantas, zoneamento agrícola

inadequado, e principalmente a presença de pragas e doenças em toda a época de plantio da

cultura.

Até o momento, a maneira mais eficiente de prevenir doenças no campo é através do

uso de sementes livres de contaminação, uso de variedades resistentes e aplicação de

fungicidas ao longo do ciclo da cultura. Esforços consideráveis foram dispendidos no

desenvolvimento de cultivares melhoradas para combater os patógenos do feijoeiro,

entretanto, a duração destas cultivares é limitada, devido principalmente a rápida emergência

de novas raças do patógeno (SINGH; SCHWARTZ, 2010; BOTELHO et al. , 2011).

Segundo Graham e Ranalli (1997), as doenças de maior destaque para a cultura são a

antracnose ( Colletothrichum lindemuthianum), ferrugem ( Uromyces appendiculatus),

crestamento bacteriano ( Xanthomonas campestris Pv phaseoli), murcha de fusarium

( Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli) e mancha angular ( Phaeoisariopsis griseola).

27

2.2 Antracnose do feijoeiro

A antracnose é causada pelo fungo Ascomiceto da espécie Colletothrichum lindemuthianum,

sendo a mais importante e frequente não apenas no estado de São Paulo, mas também em

todos os estados produtores de feijão do Brasil (ALZATE-MARIN et al. , 2004). A resistência

à antracnose é condicionada por onze genes independentes, Co-1 ao Co-13 sendo o Co-9/Co-

33 e o Co-7/Co-3 alélicos, já caracterizados. Com exceção do gene recessivo co-8, todos os

outros genes são dominantes e exibem multialelismo em Co-1, Co-3, Co-4 e Co-5 (Tabela 1).

Nove genes de resistência ( Co-2 ao Co-11) foram identificados em genótipos

Mesoamericanos e Co-1, Co-12 e Co-13 em genótipos Andinos (Tabela 1).

A distribuição destes genes em ambos os centros de origem os torna viáveis a serem

amplamente utilizados nos programas de melhoramento, contribuindo para a redução da

vulnerabilidade do feijoeiro ao fungo (GONÇALVES-VIDIGAL et al. , 2009).

Um dos fatores limitantes para o controle da antracnose no feijoeiro é a existência de

um grande número de raças de C. lindemuthianum. Além disso, existe ainda o surgimento de

novas raças, o que justifica a importância de se caracterizar tanto as raças como os bancos de

germoplasma, em busca de novas fontes de resistência, para introduzi-las em futuros

programas de melhoramento (BIGIRIMA; HÖFTE, 2001).

28

Tabela 1 - Simbolos dos genes de resistência á antracnose, as fontes genéticas, os centros de origem (A – Andino; MA

– Mesoamericano) e as referências dos genes de resistência á antracnose (BIC, 2012)

Símbolo dos

Centros de

Fonte Genética

Referências

Genes

Origem

Co-1

Michigan Dark Red Kidney

A

KELLY et al., 2003

Co-12

Kaboon

MA

MELOTTO; KELLY, 2000

Co-13

Perry Marrow

MA

MELOTTO; KELLY, 2000

Co-14

AND 277

MA

ALZATE-MARIN et al., 2003a

Co-15

Widusa

MA

GONÇALVES-VIDIGAL; KELLY, 2006

Co-2

Cornell 49-242

MA

MASTENBROEK, 1960

Co-3

Mexico 222

MA

BANNEROT, 1965

Co-32

Mexico 277

MA

FOUILLOUX, 1979

Co-33

BAT 93

MA

GEFFROY et al., 1999

Co-4

TO

MA

FOUILLOUX, 1979

Co-42

SEL 1308; G2333

MA

YOUNG et al., 1998

Co-43

PI 207262

MA

ALZATE-MARIN et al., 2002

Co-5

TU

MA

YOUNG et al., 1998

Co-52

SEL 13060

MA

VALLEJO; KELLY, 2009

Co-6

AB 136

MA

SCHWARTZ et al., 1982

Co-7

HI; MSU 7-1; G2333

MA

YOUNG et., 1998

co-8

AB 136

MA

ALZATE-MARIN et al., 1997

Co-9

BAT 93

MA

GEFFROY et al., 1999

Co-10

Ouro Negro

MA

ALZATE-MARIN et al., 2003b

Co-11

Michelite

MA

GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2007