Hipogonadismo hipogonadotrófico: diagnóstico pré-puberal e papel das isoformas e variantes gênicas.. por Karina Berger - Versão HTML

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Karina Berger

Hipogonadismo hipogonadotrófico : diagnóstico pré-

puberal e papel das isoformas e variantes gênicas do

hormônio luteinizante no fenótipo da doença

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Área de concentração: Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça

São Paulo

2006

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Este trabalho foi realizado na Unidade de

Endocrinologia do Desenvolvimento e no

Laboratório de Hormônios e Genética

Molecular LIM/42 da Disciplina de

Endocrinologia do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo.

Dedico este trabalho a todos aqueles que

lutaram pelos seus sonhos e os tornaram

realidade.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho representa um pedacinho muito valioso da minha vida.

Com ele aprendi muito e agradeço a todas as pessoas que contribuíram para que ele desse certo. Algumas menções especiais:

À minha orientadora, Profa. Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça,

uma pessoa muito especial, que confiou em mim e me recebeu de portas abertas em seu laboratório. Ensinou-me a viver bem e fazer do trabalho e do estudo atividades prazerosas. Mostrou-me que nada é impossível quando realizamos nosso trabalho com dedicação e responsabilidade.

Aos pacientes e seus familiares. Sem eles nada disso seria possível.

À amiga Luciani, admirável pela simplicidade, companheirismo,

dinamismo e competência. Com ela aprendi que a vida tem muitas coisas boas e que não devemos desistir quando as coisas não acontecem do jeito que planejamos.

Aos amigos: Maria Edna, Frederico, Maria Estela, Márcia Helena,

Catarina, Rocio, Milena Teles, Rafaela, Lize, Milena Abrão, Rogério, Regina, Emília, Miriam, Tânia, Mirta, Alzira, Aide e Bárbara pelo carinho e pela torcida.

À Nilda pelo pelos cuidados e ajuda constante.

Aos colegas que estiveram ao meu lado durante a minha formação,

nos trabalhos de bancada, nos trabalhos para publicação, nas aulas, nos congressos, no exame de qualificação:

Ao Prof. Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold pelas sugestões, orientação, paciência e disponibilidade em ensinar.

À Dra. Ana Elisa Correia Billerbeck pela dedicação, persistência nos experimentos de bancada e principalmente pelo carinho e apoio.

Ao Dr. Vinícius Nahime Brito pelas sugestões e valiosas discussões

científicas e principalmente pelo carinho e amizade.

À Dra. Elaine Maria Frade Costa pelas sugestões e apoio.

Ao Dr. Antônio Carlos Magnanelli e à Dra Valéria Sutti Nunes pela

disponibilidade em me ensinar e me auxiliar nos experimentos com a

cromatografia. Juntos, aprendemos um pouco sobre a cromatofocalização Ao Dr. Alexander Augusto de Lima Jorge pelas sugestões, orientação e constante disponibilidade em ensinar.

Ao Dr. Chin Jia Lin pelas sugestões nos experimentos de bancada.

Ao Dr. José Gilberto H Vieira pela gentileza em nos ceder o material necessário para dosagem da subunidade alfa livre.

Ao Prof. Dr. Walter Bloise, à Profa. Dra. Ana Cláudia Latrônico e à Profa.

Dra. Ieda Theresinha do Nascimento Verreshi, que constituíram a banca do exame de qualificação, pelas críticas, elogios e sugestões.

Aos amigos e colegas do Laboratório de Hormônios e Genética

Molecular e do Ambulatório da Endocrinologia do Desenvolvimento, que me receberam com muito carinho e me propiciaram um ambiente de trabalho saudável.

Aos meus pais Hildegardt e Waldemiro pelo amor e pela educação.

Aos meus irmãos Volkmar, Jaqueline, Alessandra e Florencio pelo

amor e apoio incondicional.

À minha irmã do coração, Ana Patricia, pelo carinho, pelos cuidados e principalmente pela presença, mesmo quando eu fazia tudo errado.

Aos meus sobrinhos Volkmar Junior, Lorenzzo, Gustavo e Christian

pelo enorme carinho e pela chance de voltar a ser criança.

À Liliana, a pessoa que me ensinou a ser autora da minha própria

história.

Por fim, agradeço à FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo - pelo apoio financeiro para a realização dos

experimentos.

SUMÁRIO

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Summary

1 - INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1

2 - OBJETIVOS............................................................................................ 16

3 - MÉTODOS.............................................................................................. 18

Casuística...............................................................................................19

Avaliação clínica.....................................................................................23

Avaliação hormonal ................................................................................26

Avaliação radiológica..............................................................................28

Extração de DNA a partir de sangue periférico ......................................29

Reação de polimerização em cadeia (PCR)...........................................30

Seqüenciamento automático ..................................................................31

Digestão enzimática ...............................................................................32

Cromatografia.........................................................................................34

Análise estatística...................................................................................36

3 - RESULTADOS ....................................................................................... 38

Avaliação hormonal dos pacientes portadores de hipopituitarismo ........39

Propriedades da resposta do LH e do FSH ao estímulo agudo com

GnRH no diagnóstico do hipogonadismo hipogonadotrófico ..................39

Imunoreatividade do LH em 2 diferentes ensaios imunofluorométricos

e dosagem da subunidade α ..................................................................40

Análise da influência das isoformas e das variantes alélicas do LH

sobre a concentração de LH em pacientes hipogonádicos ....................40

5 - DISCUSSÃO........................................................................................... 45

6 - CONCLUSÕES....................................................................................... 51

7 - ANEXOS ................................................................................................ 53

8 - REFERÊNCIAS ...................................................................................... 73

LISTAS

LISTA DE ABREVIATURAS

A Adenina

ACTH

Hormônio adrenocorticotrófico

ADH

Hormônio

antidiurético

Asn

Asparagina

Asp

Ácido

aspártico

B/I

bioatividade/imunorreatividade

C Citosina

CG

Gonadotrofina

coriônica

DAX1

Dosage-sensitive, sex reversal, adrenal hypoplasia congenita,

X chromosome gene 1

DGH

Deficiência do hormônio de crescimento

DGHI

Deficiência isolada do hormônio de crescimento

DHHM

Deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla

DNA

Ácido

desoxirribonucléico

DP

Desvio-padrão

E2

Estradiol

F Cortisol

FIE

Fluoroimunoensaio

FGFR1

Fibroblast growth factor receptor 1

FSH

Hormônio

folículo-estimulante

FSHβ

Subunidade beta do hormônio folículo-estimulante

G Guanina

GH

Hormônio

do

crescimento

Gly

Glicina

GnRH

Hormônio liberador de gonadotrofinas

GnRHR

Receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas

GPR54

G protein-coupled receptor-54

HESX1

Homeobox embryonic stem cell

HH

Hipogonadismo

hipogonadotrófico

HHI

Hipogonadismo

hipogonadotrófico isolado

IC Idade

cronológica

IFME

Ensaio imunofluorométrico

IGF-1

Fator de crescimento semelhante a insulina - 1

Ile Isoleucina

IO Idade

óssea

IRME

Ensaio imunorradiométrico

KAL1

Kallmann Syndrome 1

LH

Hormônio

luteinizante

LHβ

Subunidade beta do hormônio luteinizante

LHX3

Lim homeobox gene 3

LIM

Laboratório de investigação médica

nt Nucleotídeo

NL

Normal

pb

Pares de base

PC-1

Pró-hormônio convertase 1

PCR

Reação de polimerização em cadeia

PHF6

Plant homeo domain-like finger gene

pI Ponto

isoelétrico

PIF

Fator inibitório da prolactina

Pro

Prolina

PRL

Prolactina

PROP1

Prophet of Pit-1

RM

Ressonância

magnética

RIE

Radioimunoensaio

T Timina

Thr

Treonina

TRH

Hormônio liberador de tirotrofinas

TSH

Hormônio

estimulador

da tireóide ou tireotrófico

Val

Valina

vo Via

oral

SK

Síndrome de Kallmann

SNRPN

Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide SmN

SNC

Sistema nervoso central

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Resposta hormonal ao teste combinado (Insulina +TRH +

GnRH) realizado pré e pós-tratamento com GH e imagem

por RM da região hipotálamo-hipofisária dos pacientes com

hipopituitarismo........................................................................54

Tabela 2 – Dados clínicos, radiológicos e avaliação do eixo

gonadotrófico dos pacientes com hipopituitarismo em

estádio pré-puberal e puberal ..................................................56

Tabela 3 – Dados clínicos e radiológicos dos pacientes com

hipopituitarismo avaliados em idade puberal ...........................58

Tabela 4 – Dados clínicos, radiológicos e hormonais dos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH basal, em idade puberal ..................................59

Tabela 5 – Dados clínicos e desenvolvimento puberal das pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e

concentrações normais de LH .................................................60

Tabela 6 – Dados clínicos e desenvolvimento puberal dos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH .........................................................................61

Tabela 7 – Valores hormonais no teste combinado (Insulina + TRH +

GnRH) dos pacientes com hipogonadismo

hipogonadotrófico e concentrações normais de LH.................62

Tabela 8 – Dados clínicos, radiológicos e avaliação do eixo

gonadotrófico dos pacientes com hipogonadismo

hipogonadotrófico e concentrações normais de LH.................63

Tabela 9 – Propriedades dos testes laboratoriais......................................65

Tabela 10 – Resposta do LH e do FSH ao teste de estímulo com GnRH

realizado em estádio pré-puberal em pacientes com

hipopituitarismo do sexo masculino (n= 19) com

seguimento clínico até a idade puberal ...................................66

Tabela 11 – Resposta do LH e do FSH ao teste de estímulo com GnRH

realizado em estádio pré-puberal em pacientes com

hipopituitarismo do sexo feminino (n= 10) com seguimento

clínico até a idade puberal .......................................................66

Tabela 12 – Resposta do LH e do FSH ao teste de estímulo com GnRH

realizado em estádio puberal em pacientes com

hipopituitarismo do sexo masculino (n= 13).............................67

Tabela 13 – Resposta do LH e do FSH ao teste de estímulo com GnRH

realizado em estádio puberal em pacientes com

hipopituitarismo do sexo feminino (n= 9) .................................67

Tabela 14 – Propriedades da resposta do LH e do FSH ao estímulo

agudo com GnRH, realizado em estádio pré-puberal e

puberal, no diagnóstico do hipogonadismo

hipogonadotrófico em pacientes com hipopituitarismo ............68

Tabela 15 – Valores basais da subunidade α e do LH, dosado por

dois diferentes ensaios imunofluorométricos, dos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH .........................................................................69

Tabela 16 – Genótipo das variantes alélicas do gene LHβ nos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH .........................................................................70

Tabela 17 – Freqüência alélica das variantes Trp8Arg e Ile15Thr do

gene L Hβ em uma amostra da população de brasileiros

normais e em pacientes com hipogonadismo

hipogonadotrófico ....................................................................71

Tabela 18 – Valores médios de LH, FSH e estradiol ou testosterona,

dosados pelo IFME, e as variantes alélicas Trp8Arg e

Ile15Thr do gene LHβ em indivíduos normais e pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico ...................................72

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Causas de hipogonadismo hipogonadotrófico .........................12

Quadro 2 - Mutações nos genes que atuam no desenvolvimento e na função gonadal e causam hipogonadismo hipogonadotrófico .13

Quadro 3 - Estádios da puberdade feminina .............................................24

Quadro 4 - Estádios da puberdade masculina...........................................25

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática do gene LHβ................................4

Figura 2 - Representação esquemática do gene LHβ e a localização das suas variantes alélicas (em cinza) e suas mutações

(em preto) ..................................................................................5

Figura 3 -

Representação esquemática da estrutura dos

oligossacarídeos dos hormônios glicoprotéicos.........................9

Figura 4 - Digestão enzimática para estudo das variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr em indivíduos normais ..............................33

Figura 5 - Variantes alélicas 983T>C (Trp8Arg) e 1008T>C (Ile15Thr) em heterozigose, localizadas no éxon 2 do gene LHβ............42

Figura 6 - Variante alélica 1018G>C (Val18) em heterozigose, localizada no éxon 2 do gene LHβ...........................................42

Figura 7 - Variante alélica 1036C>A (Pro24) em heterozigose, localizada no éxon 2 do gene LHβ...........................................42

Figura 8 - Variante alélica 1423C>T (Gly75) em heterozigose, localizada no éxon 3 do gene LHβ..........................................42

Figura 9 - Padrão de distribuição das isoformas das gonadotrofinas

nos pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico e

concentrações normais de LH e nos controles LH e FSH

%: porcentagem de recuperação das gonadotrofinas nos

intervalos de pH básico e ácido .............................................. 43

Figura 10 - Padrão de distribuição das isoformas do FSH nos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH e nos controles ................................................44

Figura 11 - Padrão de distribuição das isoformas do LH nos pacientes

com hipogonadismo hipogonadotrófico e concentrações

normais de LH e nos controles ...............................................44

RESUMO

BERGER K. Hipogonadismo hipogonadotrófico: diagnóstico pré-puberal e papel das isoformas e variantes gênicas do hormônio luteinizante no fenótipo da doença [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2006. 86p.

O hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) resulta da ausência ou diminuição da capacidade do hipotálamo de secretar GnRH ou da glândula pituitária de secretar gonadotrofinas. Seu diagnóstico na infância é questionável e habitualmente postergado até a idade adulta, período no qual o diagnóstico se baseia nas concentrações baixas ou normais das gonadotrofinas. Na nossa casuística, 13% dos pacientes com HH apresentam concentrações

normais de gonadotrofinas no basal e após estímulo com GnRH. O hormônio luteinizante (LH) é composto de duas subunidades, α e β, que contêm

estruturas de oligossacarídeos altamente variáveis, as quais conferem diferentes cargas às isoformas das gonadotrofinas e interferem na sua meia-vida, biossíntese e bioatividade. Mutações ou polimorfismos no gene LHβ

podem alterar a imunorreatividade ou bioatividade do LH. Neste estudo, determinamos o valor preditivo da resposta das gonadotrofinas (LH e FSH) ao estímulo agudo com GnRH para o diagnóstico da deficiência de

gonadotrofinas em estádio pré-puberal em pacientes com hipopituitarismo e investigamos a origem da concentração sérica normal de LH encontrada em pacientes com HH através do estudo da região codificadora do gene LHβ e da análise das isoformas das gonadotrofinas. Foram selecionados 29

pacientes com história de baixa estatura, submetidos ao teste combinado em estádio pré-puberal. Após um período de 11,2 ± 3,7 anos de

acompanhamento ambulatorial, 6 pacientes evoluíram com desenvolvimento puberal espontâneo, enquanto que 23 pacientes necessitaram de reposição de esteróides sexuais. A avaliação das respostas das gonadotrofinas ao GnRH mostrou que a resposta diminuída do LH apresentou sensibilidade de 66,6% no sexo feminino e 50% no sexo masculino, enquanto que a resposta diminuída do FSH apresentou uma melhor sensibilidade no sexo feminino que no masculino (89% x 37,5%). O estudo do gene LHβ , utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida por

seqüenciamento automático, foi realizado em 13 hipogonádicos com

concentrações normais de LH. Para o estudo da freqüência das variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr do gene LHβ , utilizando a técnica de PCR

seguida por digestão enzimática, foram selecionados 35 hipogonádicos com concentrações baixas de gonadotrofinas e 202 adultos normais. O

seqüenciamento automático revelou 5 variantes alélicas: Trp8Arg e Ile15Thr, Val18Val, Pro24Pro e Gly75Gly. A freqüência gênica das variantes alélicas Arg8 e Thr15 foi similar nos adultos normais (7,6%) e hipogonádicos (8,3%) e não houve influência da presença das variantes nas concentrações séricas do LH em ambos os grupos. Para o estudo das isoformas das

gonadotrofinas, utilizando a cromatofocalização, foram selecionados 8

hipogonádicos com níveis normais de LH e 9 indivíduos normais. Houve um predomínio das isoformas ácidas do LH (pH < 6,9) e do FSH (pH < 6,9) em ambos os grupos. Concluímos que a resposta das gonadotrofinas ao GnRH, principalmente a resposta diminuída do FSH nas meninas, é útil para

predizer em idade pré-puberal o diagnóstico do HH nos pacientes com

hipopituitarismo. A freqüência similar das variantes Arg8 e Thr15 nos hipogonádicos e nos indivíduos normais exclui o papel dessas variantes nas concentrações séricas do LH. Houve um predomínio das isoformas ácidas do LH nos hipogonádicos, porém o encontro de isoformas ácidas também nos indivíduos normais, não permitiu atribuir à sua presença a baixa atividade biológica do LH imunorreativo encontrado em 13% dos

hipogonádicos.

Descritores: hipogonadismo/ diagnóstico, hipopituitarismo,

fluoroimunoensaio, hormônio luteinizante subunidade beta/ genética,

freqüência do gene, glicoproteínas, cromatografia.

SUMMARY

BERGER K. Hypogonadotropic hypogonadism: pre-pubertal diagnosis and the role of the isoforms and allelic variants of the luteinizing hormone in the disease phenotype [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2006. 86p.

Hypogonadotropic hypogonadism (HH) results from the absence or decrease of the hypothalamus capacity of secreting GnRH or the pituitary gland capacity of secreting gonadotropins. Its diagnosis in childhood is debatable and thus, it is usually delayed until adulthood, when the diagnosis is based on low or normal levels of gonadotropins. In our series, 13% of the HH

patients presented normal gonadotropin levels at baseline and after GnRH

stimulation. The luteinizing hormone (LH) consists of two subunits, α and β, which contain highly variable oligosaccharide structures that confer different charges to gonadotropin isoforms and interfere with their half-life, biosynthesis and bioactivity. Mutations or polymorphisms of the LHβ gene can alter LH immunoreactivity or bioactivity. In this study, we determined the predictive value of gonadotropin (LH and FSH) responses to an acute GnRH

stimulation for the diagnosis of gonadotropin deficiency at the pre-pubertal stage in patients with hypopituitarism and investigated the origin of the normal serum LH levels observed in HH patients through the study of the coding region of the LHβ gene and the analysis of gonadotropin isoforms.

The twenty-nine patients selected for the study had a history of short stature and underwent the combined test at the pre-pubertal stage. After a period of 11.2 ± 3.7 yrs of follow-up at outpatient clinic level, 6 patients evolved with spontaneous pubertal development, whereas the remaining 23 needed

sexual steroid replacement therapy. The evaluation of gonadotropin

responses to GnRH showed that the decreased LH response had a

sensitivity of 66.6% and 50% in female and male patients, respectively, whereas the decreased FSH response showed a better sensitivity in the female sex compared to the male sex (89% vs. 37.5%). The study of the LHβ

gene, utilizing the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique followed by automatic sequencing was carried out in 13 hypogonadic individuals with normal LH levels. Thirty-five hypogonadic subjects with low gonadotropin levels and 202 normal adults were selected for the study of the allelic variants Trp8Arg and Ile15Thr of the LHβ gene, which utilized PCR followed by enzymatic digestion. Automatic sequencing disclosed 5 allelic variants: Trp8Arg and Ile15Thr, Val18Val, Pro24Pro and Gly75Gly. The allelic

frequencies of the allelic variants Arg8 and Thr15 were similar between normal adults (7.6%) and hypogonadic individuals (8.3%), with no influence ascribed to the presence of the variants on serum LH levels in both groups.

For the study of gonadotropin isoforms, which utilized chromatofocusing, 8

hypogonadic subjects with normal LH levels and 9 normal individuals were selected. There was a predominance of acid LH (pH < 6.9) and FSH (pH < 6.9) isoforms in both groups. We conclude that gonadotropin response to GnRH, especially the decreased FSH response in girls, is a useful tool for predicting HH diagnosis at the pre-pubertal stage, in patients with

hypopituitarism. The similar frequencies of the variants Arg8 and Thr15 in hypogonadic subjects and normal individuals exclude the role of these variants on serum LH levels. There was a predominance of acid LH isoforms in hypogonadic subjects, which does not allow us to ascribe to their presence the low biological activity of the immunoreactive LH, found in 13% of the hypogonadic individuals.

Descriptors: hypogonadism/ diagnostic, hypopituitarism, fluoroimmunoassay, beta subunit luteinizing hormone/ genetic, gene frequency, glycoproteins, chromatography.

1 - INTRODUÇÃO

Introdução

2

O desenvolvimento e a maturação do sistema reprodutivo são

processos ativos que têm início na vida fetal e se estendem até os primeiros meses de vida. O sistema reprodutivo torna-se então inativo na infância até a sua reativação na adolescência, quando ocorre a maturação sexual. A reativação fisiológica do eixo hipotálamo-hipófise-gônadal ocorre

normalmente entre os 8 e 13 anos de idade nas meninas e entre os 9 e 14

anos nos meninos1, 2.

O início da puberdade é decorrente do aumento da secreção pulsátil

do decapeptídeo GnRH, por neurônios localizados no hipotálamo médio

basal. O GnRH estimula a secreção hipofisária das gonadotrofinas

essenciais para a maturação gonadal, caracterizada pela secreção dos esteróides sexuais e pela gametogênese2.

Anormalidades no eixo hipotálamo-pituitário levam a um prejuízo da

função gonadal com conseqüente diminuição nas concentrações das

gonadotrofinas e hormônios sexuais, quadro este denominado de

hipogonadismo hipogonadotrófico (HH)1, 3, 4.

O hormônio luteinizante (LH) é uma glicoproteína sintetizada e

secretada pelas células gonadotróficas da hipófise anterior, com papel fundamental na regulação da função gonadal, na produção de estrógenos e andrógenos e na gametogênese3, 4. No sexo masculino, o LH estimula a Introdução

3

produção de testosterona pelas células de Leydig. No sexo feminino,

estimula a produção de estrógenos, andrógenos e progesterona pelos

ovários e é responsável pela ovulação2, 3.

A secreção do LH é regulada pela concentração plasmática dos

produtos secretados pelas glândulas-alvo (esteróides sexuais e peptídeos gonadais) e pelos neuropeptídeos produzidos no hipotálamo2, 3. Os padrões fisiológicos de secreção do LH são determinados pela freqüência e

amplitude de pulso do GnRH. O LH exerce sua atividade biológica através da interação com um receptor específico, o receptor de LH/CG, pertencente à família dos receptores de membrana ligados à proteína G3, 5.

A estrutura química do LH é semelhante à dos outros membros da

família dos hormônios glicoprotéicos: o hormônio folículo-estimulante (FSH), a gonadotrofina coriônica (CG) e o hormônio tireotrófico (TSH). Estes hormônios são heterodímeros constituídos por uma subunidade α comum e uma subunidade β específica, unidas por ligações não covalentes. Pontes dissulfídicas mantêm as ligações entre as subunidades α e β e determinam a estrutura da molécula madura3, 6, 7.

A subunidade α, comum a todos os hormônios glicoprotéicos, é

codificada por um gene de 13,5 kb. Este gene localiza-se no cromossomo 6q21.1-23, é constituído por quatro éxons e codifica uma proteína de 92

aminoácidos. A proteína madura contém 10 resíduos de cisteína que estão envolvidos nas ligações dissulfídicas intra-subunidade3, 7.

A subunidade β do LH é codificada por um gene localizado no

cromossomo 19q13.32, constituído de 1.662 pb três éxons e que codifica um

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index-28_2.png

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Introdução

4

peptídeo sinalizador de 20 aminoácidos e uma proteína madura de 121

aminoácidos (Figura 1). A proteína madura contém 12 resíduos de cisteína3, 7, 8. Embora a subunidade β confira especificidade funcional aos hormônios glicoprotéicos, existe uma grande homologia estrutural entre eles,

principalmente entre o LH e o CG humanos. Apesar deste alto grau (83%) de homologia entre as porções codificadoras do LHβ e do CGβ humanos, o que permite a ligação de ambos os hormônios ao mesmo receptor, suas regiões promotoras são divergentes e suas regiões 5’ não-traduzidas são distintas7, 9.

Cromossomo 19q13.32

1662 pb

5’

1

2

3

3’

Peptídeo

Proteína madura

sinalizador

121 aa

20 aa

Figura 1 - Representação esquemática do gene LHβ

A expressão completa da atividade biológica dos hormônios

glicoprotéicos requer a presença de ambas as cadeias polipeptídicas

íntegras3, 7.

index-29_1.png

index-29_2.png

index-29_3.png

Introdução

5

Uma única mutação no gene da subunidade α foi descrita em

humanos num carcinoma indiferenciado da região femoral10. Trata-se de uma mutação missense, com troca de glutamato por alanina no códon 56 da subunidade α. A proteína mutada apresentava um peso molecular maior do que a proteína nativa e não era capaz de se dimerizar com a subunidade β.

A ausência de mutações no gene da subunidade α em linhagem germinativa pode indicar que tais alterações sejam letais causando uma disfunção de todos os hormônios glicoprotéicos11, 12.

Duas mutações missense causando inativação funcional do LH e 4

variantes alélicas foram descritas no gene LHβ (Figura 2). A primeira mutação, (Glu54Arg) foi identificada em homozigose em um adolescente de 17 anos, filho de pais consangüíneos, com atraso puberal e com

concentrações séricas elevadas de LH e baixas concentrações de

testosterona13. A biópsia testicular revelou espermatogênese incompleta e ausência de células de Leydig. Essa mutação gerou um LH com

imunorreatividade elevada, porém sem bioatividade in vitro 13-15. A mãe e a irmã eram heterozigotas assintomáticas, enquanto que 3 tios maternos heterozigotos apresentavam infertilidade13.

W8R I15T

A-3T

G36D

Q54R

G102S

5’

1

2

3

3’

Figura 2 - Representação esquemática do gene LHβ e a localização das suas variantes alélicas (em cinza) e suas mutações (em preto)

Introdução

6

Outra mutação causando inativação funcional do LH é a Gly36Asp, encontrada em um homem de 30 anos com quadro de infantilismo sexual, infertilidade, concentrações séricas indetectáveis de LH, concentrações baixas de testosterona e concentrações elevadas de FSH16. Essa mutação desfaz um sítio vital, o CAGYC, da cisteína do LHβ impedindo a sua dimerização com a subunidade α e a secreção do hormônio16.

Vários estudos analizaram a presença de variantes polimórficas no gene LHβ associada a diferentes quadros clínicos. A variante alélica, Ala(-3)Thr, no peptídeo sinalizador da subunidade β do LH foi encontrada em heterozigose em 3 de 100 indivíduos de uma população da Ruanda17. Estudos in vitro demonstraram que essa variante alélica não compromete a dimerização das subunidades α e β, a ligação do hormônio no seu receptor e a clivagem do peptídeo sinalizador, porém causa um aumento na produção de fosfato inositol e uma pequena redução na resposta do AMP cíclico estimulado17.

A variante alélica Gly102Ser foi descrita em uma população chinesa

de Cingapura e parece estar restrita a populações do leste asiático18, 19, pois num rastreamento realizado em populações da Finlândia, Dinamarca,

Bengala e Ruanda, ela não foi encontrada20. Embora esta variante tenha sido associada a distúrbios menstruais e quadros de infertilidade em ambos os sexos21-24, os estudos in vitro demonstraram que a bioatividade do LH

mutado e do LH selvagem são semelhantes20.

As variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr foram descritas pela primeira vez em três mulheres com distúrbios menstruais, infertilidade e LH

imunologicamente anômalo25, 26. Este fenômeno é explicado pelo fato de que Introdução

7

a mutação Ile15Thr introduz um sítio de glicosilação extra (Asn13-Ala14-Thr15) na cadeia β do LH e esse carboidrato extra é responsável pela

imurreatividade reduzida ou abolida aos anticorpos contra o dímero intacto25-27.

As variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr estão em completo desequilíbrio de ligação e também foram descritas em indivíduos normais de diversas

populações do mundo, com uma freqüência relativamente alta em

populações da Finlândia (41,9%) e Austrália (53,5%)19, 22, 23, 28-36. O efeito fenotípico do LH variante ainda é discutível, devido à significância estatística marginal obtida em grandes estudos populacionais nos quais o efeito das variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr foi relacionado à ação do LH em diversas situações clínicas tais como na síndrome dos ovários policísticos e na progressão da puberdade12, 34, 37. Por outro lado, em outras populações foi demonstrada uma significante associação entre essas variantes alélicas, em homo ou heterozigose, e infertilidade29, 30. Estudos in vitro demonstraram que o LH variante forma dímero com a subunidade α, mantém sua capacidade de ligação ao receptor e apresenta uma elevada biopotência para a produção de progesterona pelas células MA-10 ( Leydig tumor cells)27, 38. In vivo, o LH variante é capaz de induzir ovulação e a sua taxa de depuração é mais rápida que a do LH selvagem27.

Em humanos, após a tradução da proteína, ocorre um processo de

transferência de complexos de oligossacarídeos com carga negativa ou neutra para resíduos específicos de asparagina (Asn), serina (Ser) ou treonina (Thr), chamado glicosilação. Existem dois sítios de glicosilação, um sítio ligado ao radical amina (NH2) da asparagina, denominado N-ligado e Introdução

8

um sítio ligado ao radical hidroxila (OH) da serina e da treonina, denominado O-ligado7. O processo de localização dessas cadeias de carboidratos é essencial para a sinalização do hormônio, difere entre as gonadotrofinas e é espécie-específico3, 7, 39-42.

Os hormônios glicoprotéicos contêm quantidade e estrutura variável de oligossacarídeos na sua molécula (15 a 45%). Os oligossacarídeos podem ser divididos em três categorias: sializados, sulfatados e híbridos sulfatados-sializados (Figura 3) e têm carga negativa ou neutra, de acordo com o número de resíduos de sulfato ou de ácido siálico presentes na sua estrutura7, 39-42. O

carboidrato tem como papel principal o de determinar a meia-vida circulante dos hormônios glicoprotéicos, além de influenciar a biossíntese, a secreção e a modulação de atividades específicas das glicoproteínas7, 41, 43.

A subunidade α possui dois sítios de glicosilação localizados nos

resíduos Asn52 e Asn78. A subunidade β do LH humano (hLH) possui um sítio de glicosilação localizado na Asn30. O hLH possui oligossacarídeos

predominantemente sulfatados ou híbridos, enquanto que o CG e o FSH

humanos possuem somente oligossacarídeos sializados7, 40, 44.

Técnicas de separação das proteínas através da sua carga elétrica

têm identificado mais de vinte isoformas distintas do LH, básicas e ácidas, que diferem pela complexidade e magnitude das modificações no processo de glicosilação pós-tradução45, 46. Existem evidências crescentes de que a extensão e o padrão de glicosilação estão sob controle endócrino

multifatorial, regulados pelo GnRH, estradiol e a testosterona47-52.

index-33_1.png

Isoforma híbrida

Isoformas sializadas

Isoformas sulfatadas

Sulfato

Ácido siálico

Galactose

Manose

H

Fucose

H

Introduçã

o

FONTE: Bousfield GR, et al 7

Figura 3 - Representação esquemática da estrutura dos oligossacarídeos dos hormônios glicoprotéicos 9

Introdução

10

Ensaios da cinética do LH in vivo mostraram que isoformas altamente sializadas (pH ácido) exibem uma meia-vida mais longa, ao contrário das isoformas alcalinas (pH básico) e dessializadas de meia-vida mais curta Apesar da meia-vida mais curta, isoformas mais alcalinas apresentaram maior bioatividade in vitro 45, 48, 53.

Vários estudos avaliaram o papel das isoformas do LH e do FSH em

diversas situações e períodos do desenvolvimento sexual. A fase inicial do desenvolvimento puberal (estádio II de Tanner) dos meninos é marcada por uma significante mudança nas cargas das isoformas, com predomínio das isoformas das gonadotrofinas mais ácidas49. No sexo feminino as mudanças são menos expressivas e há um predomínio das isoformas mais básicas em todos os estádios do desenvolvimento puberal49. Um estudo avaliando o efeito agudo do GnRH exógeno sobre as isoformas das gonadotrofinas hipofisárias, em meninos e meninas em desenvolvimento puberal, demonstrou que as

meninas tiveram menos isoformas ácidas do que os meninos54.

Em homens normais foi demonstrado um predomínio das isoformas

mais ácidas do LH que apresentaram correlação positiva com concentrações séricas normais de testosterona55. Por outro lado, em pacientes urêmicos em hemodiálise que apresentavam elevada imunorreatividade do LH, porém uma relação de bioatividade/imunorreatividade (B/I) reduzida, e em homens obesos com história de diminuição da libido associada a concentrações diminuídas de testosterona e concentrações elevadas de estradiol foi observado um predomínio de isoformas do LH mais básicas51, 55, 56.

Introdução

11

Na mulher jovem, com secreção normal de estrogênio, há um

predomínio das isoformas do LH mais alcalinas, caracterizado por uma elevada relação B/I in vitro. Num estudo detalhado da distribuição das isoformas do LH e do FSH nas diversas fases do ciclo menstrual foram observadas diferenças significativas na proporção de isoformas do FSH mais ácidas (pH < 4,5), 50% no meio do ciclo, 36% no início para o meio do ciclo, 37% na fase folicular tardia e 29% na fase lútea. Em relação ao LH, não houve diferença significante na proporção das isoformas nas distintas fases do ciclo menstrual, embora todos os valores fossem superiores ao

encontrado nas mulheres menopausadas50.

Até o momento, os mecanismos básicos envolvidos na regulação das

mudanças e distribuição das isoformas das gonadotrofinas são incertos e a relevância das isoformas no desenvolvimento puberal e maturação sexual ainda é desconhecida.

O hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) é definido como uma

deficiência da secreção pituitária do hormônio luteinizante e do hormônio folículo-estimulante decorrente de lesões funcionais ou estruturais do eixo hipotálamo-pituitário2 (Quadros 1 e 2). O diagnóstico do HH baseia-se nas manifestações clínicas e laboratoriais presentes nas diversas fases do período de maturação sexual1, 2.

Introdução

12

Quadro 1 - Causas de hipogonadismo hipogonadotrófico

Distúrbios no sistema nervoso central (SNC)

Tumores

Histiocitose de Langerhans

Lesões pós-infecciosas do SNC

Anomalias vasculares do SNC

Radioterapia

Malformações congênitas especialmente associadas a anomalias craniofaciais Trauma craniano

Hipofisite linfocítica

Deficiência isolada de gonadotrofinas

Síndrome de Kallmann

Mutação no gene KAL

Mutação no gene FGFR1

Mutação no receptor do GnRH

Hipoplasia adrenal congênita (mutação no DAX1)

Deficiência isolada de LH

Deficiência isolada de FSH

Deficiência de pró-hormônio convertase 1

Hipogonadismo hipogonadotrófico idiopático

Formas idiopáticas e genéticas de deficiência hormonal pituitária múltipla

Mutação no gene PROP1

Mutação no gene HESX1

Mutação no gene LHX3

Miscelâneas

Síndrome de Prader-Willi

Síndromes de Laurence-Moon e Bardet-Biedl

Deficiência funcional de gonadotrofinas

Doenças sistêmicas crônicas

Desnutrição

Anorexia nervosa

Bulimia

Amenorréia psicogênica

Puberdade atrasada de atletas e dançarinas

Hipotireoidismo

Diabetes mellitus

Doença de Cushing

Hiperprolactinemia

Uso de maconha

Doença de Gaucher

2

FONTE: Grumbach MM, et al.

Introdução

13

Quadro 2 - Mutações nos genes que atuam no desenvolvimento e na função gonadal e causam hipogonadismo hipogonadotrófico

Gene Locus

Herança Fenótipo

predominante

HH, anosmia/hiposmia, agenesia

KAL

Xp22.3

Ligada ao X

renal unilateral e sincinesia

HH, anosmia/hiposmia, fenda

FGFR1

8p11.2 AD

palatina e lábio leporino

DAX1

Xp21.3

Ligada ao X

HH e hipoplasia adrenal congênita

Leptina

7q31.3

AR

HH e obesidade

Receptor da leptina

1p31

AR

HH e obesidade

PC1

5q15

AR

HH, hipocortisolismo e obesidade

GnRHR

4q21.2 AR

HH

isolado

Hipopituitarismo, neurohipófise

HESX1

3p21.2 AR/AD

ectópica e displasia septo-óptica

Hipopituitarismo, malformações

LHX3

9q34.3 AR

esqueléticas cervicais

PROP1

5q35 AR

Hipopituitarismo

LHβ

19q13.32 AR

HH

isolado

FSHβ

11p13 AR

HH

isolado

GPR54

19p13.3 AR

HH

isolado

Síndrome de Prader-Willi e

SNRPN

15q12 *

obesidade

Síndrome de Borjeson-Lehmann e

PHF6

Xq26.3

Ligada ao X

hipopituitarismo

AD: autossômica dominante; AR: autossômica recessiva, HH: hipogonadismo hipogonadotrófico

* perda de função da região 15q11-q13 paterna ou dissomia uniparental materna Introdução

14

No período neonatal apenas no sexo masculino o diagnóstico pode

ser aventado frente a um recém-nascido com micropênis, criptorquia e concentrações baixas de gonadotrofinas associadas a concentrações baixas de esteróides sexuais e inibina B1, 57.

Na infância, em ambos os sexos, o diagnóstico do HH não pode ser

realizado pelos achados clínicos e a dosagem das gonadotrofinas, tanto em condição basal quanto após estímulo com GnRH, usando o

radioimunoensaio (RIE)58, 59 ou o ensaio imunorradiométrico (IRME)60, 61 não permite o diagnóstico preciso. Com o advento de técnicas mais sensíveis, como o ensaio imunofluorométrico (IFME), as limitações das dosagens das gonadotrofinas foram parcialmente superadas62, 63. A incidência do HH

associado a deficiência do hormônio de crescimento (DGH) é elevada, como demonstrado em diversos estudos64-67. Em nossa casuística, a deficiência do setor gonadotrófico está presente em 54% (35/64) dos pacientes portadores de DGH. Assim, o uso de testes diagnósticos em idade pré-puberal que pudessem antever a evolução para HH em uma criança com deficiência de GH associada ou não a outras deficiências hipofisárias seria de grande utilidade para a prática clínica.

Na idade adulta, o diagnóstico de HH baseia-se na história clínica de ausência ou parada do desenvolvimento puberal, caracterizada no sexo feminino por amenorréia primária ou secundária e infertilidade e no sexo masculino por impotência, infertilidade e diminuição da libido nos homens.

Ao exame físico observa-se infantilismo sexual e proporções corporais eunucóides. As dosagens hormonais identificam concentrações baixas ou Introdução

15

normais de gonadotrofinas associadas a concentrações de esteróides

gonadais baixas para a idade cronológica1, 3, 68.

Em nossa casuística de 101 pacientes com hipogonadismo

hipogonadotrófico, observamos que em 13% deles as concentrações de LH

basal e após estímulo com GnRH estavam dentro dos valores puberais

normais, apesar do quadro clínico de hipogonadismo. Este achado sugere que a gonadodotrofina embora com imunorreatividade normal apresente

uma bioatividade reduzida. Considerando as alterações estruturais das diferentes isoformas do LH e as alterações moleculares do gene LHβ, nossa proposta é investigar se um destes fatores é o responsável pelas

concentrações normais de LH no HH.

2 - OBJETIVOS

Objetivos

17

1- Determinar em pacientes com hipopituitarismo em estádio pré-puberal o valor preditivo da resposta do LH e do FSH, medidos pelo ensaio

imunofluorométrico, ao estímulo agudo com GnRH para o diagnóstico da deficiência de gonadotrofinas.

2- Investigar a origem da concentração sérica normal de LH encontrada em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico através do:

a) estudo da região codificadora do gene LHβ

b) análise das isoformas do LH e do FSH

3 - MÉTODOS

Métodos

19

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(HCFMUSP/ CAPPesq 578/03) e o consentimento esclarecido foi concedido pelos pacientes ou responsáveis.

Casuística

A) Casuística do objetivo 1

Pacientes:

Foram selecionados 29 pacientes (19 do sexo masculino) com história

de baixa estatura, em idade cronológica (IC) de 13 anos (variação de 4,8 a 17,7 anos) e idade óssea (IO) de 9 anos (variação de 2 a 13 anos),

submetidos ao teste combinado (Insulina, TRH e GnRH) em estádio pré-

puberal para diagnóstico do hipopituitarismo (Tabelas 1 e 2).

Todos os pacientes foram acompanhados até a idade puberal ou

adulta. A avaliação do desenvolvimento dos caracteres sexuais

secundários foi realizada de acordo com os critérios de Marshall e

Tanner69, 70 e o desenvolvimento gonadal no sexo masculino foi baseado nos critérios de Root71. Após um período médio de 11,2 ± 3,7 anos

Métodos

20

(variação de 3,5 a 20,4 anos) de acompanhamento ambulatorial, 6

pacientes (5 do sexo masculino) evoluíram com desenvolvimento puberal espontâneo e foram classificados como normais (NL), enquanto que 23

pacientes (14 do sexo masculino) necessitaram de reposição de esteróides sexuais para desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários e foram classificados como HH (Tabela 3). A reposição hormonal no sexo

masculino foi iniciada aos 18,4 anos de idade cronológica (variação de 13,7

a 26,6 anos) e IO de 12,5 anos (variação de 8 a 17 anos) e no sexo

feminino aos 15,5 anos (variação de 12,6 a 20,7 anos) e IO de 12 anos (variação de 10 a 13,6 anos).

Vinte e dois pacientes (13 do sexo masculino) aos 18,9 anos de IC

(variação de 14,2 a 27,9 anos) e 14 anos de IO (variação de 11 anos a idade óssea adulta) realizaram um novo teste de estímulo agudo com GnRH em estádio puberal (Tabela 2).

A ressonância magnética da região hipotálamo-hipofisária de 28

pacientes mostrou adenohipófise hipoplásica em 24 (86%), neurohipófise ectópica em 21 (75%), transecção de haste em 17 (61%) e haste afilada em um paciente (Tabela 1).

A etiologia do hipopituitarismo não foi estabelecida em 26 pacientes enquanto que em duas pacientes foi identificada mutação no gene PROP1

72, 73 e em uma paciente mutação no gene HESX1 74 (Tabela 1).

Ao final do tratamento com hormônio do crescimento, 23 pacientes

foram resubmetidos ao teste combinado para reavaliar as deficiências hormonais (Tabela 1).

Métodos

21

Controles:

A resposta das gonadotrofinas ao teste de estímulo agudo com GnRH

dos pacientes com hipopituitarismo foi comparada a de um grupo controle normal constituído por 27 crianças (16 do sexo masculino) em estádio puberal Tanner I e 18 adultos (9 do sexo masculino) em estádio puberal Tanner V 62.

B) Casuísticas do objetivo 2

Pacientes:

a) 13 pacientes (7 do sexo feminino) portadores de HH congênito de

diferentes etiologias (síndrome de Kallmann em 3 pacientes,

hipogonadismo hipogonadotrófico isolado em 3 pacientes e deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla em 7 pacientes) que apresentavam

concentrações normais de LH em condição basal foram selecionados para estudo da região codificadora do gene LHβ (tabela 4) . Todos os pacientes tinham história de ausência ou parada do desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários ou infertilidade. Duas mulheres apresentavam

amenorréia primária e 5 amenorréia secundária (Tabelas 5 e 6). Sete

pacientes realizaram o teste combinado (Insulina, TRH e GnRH) em duas ocasiões, no momento do diagnóstico do hipopituitarismo e ao final do tratamento com GH. As deficiências hormonais encontradas foram de GH

em 7 pacientes (100%), de ACTH em 4 pacientes (57%), de PIF em 3

pacientes (43%) e de TRH em 2 pacientes (28%) (Tabelas 7 e 8). Seis

pacientes realizaram somente o teste de estímulo com GnRH (Tabela 8).

Na idade puberal, todos os pacientes apresentavam concentrações séricas Métodos

22

normais de gonadotrofinas em condição basal. Após o estímulo agudo com GnRH, 3 mulheres e 1 homem apresentaram hiperresposta do LH (Tabela

4). Apesar de possuírem concentrações de LH normais para a idade

puberal, todos os pacientes apresentavam quadro clínico sugestivo de deficiência das gonadotrofinas (Tabelas 5 e 6). Todos os pacientes

receberam reposição dos esteróides sexuais, iniciada em diferentes idades cronológicas de acordo com o início do quadro clínico. Imagens da

ressonância magnética da região hipotálamo-hipofisária dos 7 pacientes portadores de DHHM mostraram adenohipófise hipoplásica em 7 pacientes (100%), neurohipófise ectópica em 6 pacientes (86%), transecção de haste em 4 pacientes (57%) e haste afilada em 2 pacientes (28%). Nos 5

pacientes com deficiência isolada de gonadotrofinas a RM mostrou

adenohipófise normal em todos os pacientes, ausência dos bulbos

olfatórios com hipoplasia dos sulcos olfatórios em 1 paciente e ausência do sulco olfatório esquerdo em outro paciente.

b) 35 pacientes com fenótipo clássico de HH foram incluídos, totalizando 48

pacientes com HH, no estudo das variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr do gene LHβ .

c) 8 dos 13 pacientes portadores de HH e concentrações séricas normais de LH (6 do sexo feminino) foram incluídos no estudo das isoformas do LH e do FSH.

Métodos

23

Controles:

a) 202 brasileiros adultos (115 mulheres) com função sexual preservada e sem uso exógeno de esteróides sexuais foram selecionados para o

estudo das variantes alélicas Trp8Arg e Ile15Thr do gene LHβ .

b) 9 indivíduos normais (4 do sexo feminino) com função sexual preservada e sem uso exógeno de esteróides sexuais foram selecionados para o

estudo das isoformas do LH e do FSH.

Avaliação clínica

Todos os pacientes selecionados foram avaliados clinicamente no

ambulatório da Unidade de Endocrinologia do Desenvolvimento da Disciplina de Endocrinologia do Hospital das Clínicas da FMUSP. A altura foi medida através de um estadiômetro. O desvio-padrão da altura foi calculado usando padrões britânicos de referência75. O grau de desenvolvimento puberal foi avaliado de acordo com a classificação de Marshall e Tanner69, 70 e o desenvolvimento genital no sexo masculino foi baseado nos critérios de Root71 (Quadros 3 e 4)

Métodos

24

Quadro 3 - Estádios da puberdade feminina

Desenvolvimento mamário

M1 – Pré-adolescente. Elevação apenas da papila.

M2 – Estádio de broto mamário: há elevação da mama e da papila, formando um pequeno broto subareolar, há aumento da aréola.

M3 – Aumento maior da mama e da aréola, sem separação dos contornos.

M4 – Aumento da mama com protusão da aréola e mamilo, formando um contorno secundário em relação ao restante da mama.

M5 – Estádio adulto. Projeção apenas do mamilo com recessão areolar, que passa a integrar o contorno da mama. Curvatura da porção superior da mama.

Pêlos pubianos

PP1 – Pré-adolescente. O velo sobre o púbis não é mais desenvolvido que o da parede abdominal.

PP2 – Crescimento esparso de pêlos longos, pigmentados, lisos ou discretamente curvos, principalmente sobre os grandes lábios.

PP3 – Pêlos mais grossos, escuros e encaracolados que confluem sobre a junção do púbis

PP4 – O pêlo tem a característica do adulto, cobre a área pubiana, mas ainda não totalmente e não há pêlos sobre a raiz das coxas

PP5 – Os pêlos cobrem todo o púbis, formando um triângulo invertido do padrão feminino clássico e atingindo a face interna das coxas, mas não a linha alba.

FONTE: Grumbach MM, et al2

Métodos

25

Quadro 4 - Estádios da puberdade masculina

Genitais

G1 – Pré-adolescente. Testículos, bolsa escrotal e pênis apresentam aspecto infantil.