Identificação de um gene que confere resistência a tubercidina em Leishmania (Leishmania) major por Juliana Ide Aoki - Versão HTML

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JULIANA IDE AOKI

Identificação de um gene que confere resistência a

tubercidina em Leishmania (Leishmania) major

São Paulo

Tese

apresentada

ao

Instituto

de

Medicina Tropical de São Paulo da

Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Doenças Tropicais

e Saúde Internacional

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Cotrim

2013

RESUMO

Identificação de um gene que confere resistência a tubercidina em Leishmania

(Leishmania) major (tese). São Paulo: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da

Universidade de São Paulo; 2013.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários

tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de compostos

antileishmania. Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação do análogo de purina

tubercidina (TUB) em Leishmania. Utilizando a estratégia de superexpressão após

transfecção gênica, isolamos um locus de Leishmania (Leishmania) major, de 31 kb,

capaz de conferir níveis de resistência quatro vezes maior que o parasita selvagem.

Várias deleções desse locus foram geradas e a construção de 3 kb (pSNBR/3kb Cla I-

Eco RI) também conferiu níveis de resistência quando comparado ao parasita elvagem.

Através de análises no genoma de L. (L.) major, localizamos esse locus no

cromossomo 31 e, no fragmento de 3 kb, um gene que codifica para uma proteína com

função desconhecida até o momento (LmjF.31.2010). Esta proteína foi relacionada

com resistência a TUB em todas as linhagens transfectadas analisadas (cosTUB2 e

pSNBR/3kb Cla I- Eco RI), assim denominamos LmjF.31.2010, de proteína relacionada

com resistência a TUB (PRRT). A quantificação relativa de transcritos de mRNA na

construção pSNBR/3kb Cla I- Eco RI apresentou níveis altos de transcritos da PRRT.

Foram gerados ainda mutantes de L. (L.) major e L. (L.) amazonensis resistentes a

TUB e estes se apresentaram bem adaptados a concentrações altas de TUB,

apresentando razão de resistência maior que 200 vezes, quando comparado com os

respectivos parasitas selvagens. A PRRT também foi relacionada na resistência a TUB

nos mutantes gerados, pois houve amplificação gênica de prrt. Os resultados obtidos

neste trabalho fornecem dados para inferir a importância da PRRT no mecanismo

relacionado com resistência a TUB.

Descritores: Leishmania, Tubercidina, Purinas, Transfecção

ABSTRACT

Aoki JI. Identification of a gene related with tubercidin resistance in Leishmania

(Leishmania) major (thesis). São Paulo: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da

Universidade de São Paulo; 2013.

The identification of genes associated with resistance to antiparasitic compounds has

contributed to a better understanding of the mechanism of action of compounds against

Leishmania. Little is known about the mechanism of action of purine analog tubercidin

(TUB) in Leishmania. Using a strategy of gene overexpression after transfection, we

isolated a locus of Leishmania (Leishmania) major, 31 kb, capable of conferring fold

resistance four times greater than the wild type parasite. A set of deletions of this locus

were generated and a 3 kb construction (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) conferred fold

resistance twice than the wild type. Analysis of L. (L.) major genome, located this locus

on chromosome 31 and on 3 kb fragment we identified a gene encoding a protein with

unknown function (LmjF.31.2010). This protein has been related to TUB resistance in

all strains analyzed (cosTUB2 and pSNBR/3kbClaI-EcoRI), so we named mjF.31.2010

of protein related with resistance to TUB (PRRT). Relative quantification of mRNA

transcripts in the construction pSNBR/3kbClaI-EcoRI showed high levels of PRRT

transcripts.Mutants of L. (L.) major and L. (L.) amazonensis resistant to TUB were also

generated and these were well adapted to high TUB concentrations, presenting fol

resistance greater than 200 times when compared with their respective wild type. The

PRRT was also related to TUB resistance mutants generated by PRRT gene

amplification. Despite the high fold resistance presented by TUB resistant mutants, the

ratio of expression of these mutant PRRT transfected and wild was similar to the wild

type.

Descriptors: Leishmania, Tubercidin, Purine 4,Transfection

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