Influência do vírus da lecucose bovina na resposta imunitária de animais naturalmente infectados por Milton Ricardo Azedo - Versão HTML

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MILTON RICARDO AZEDO

Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária

de animais naturalmente infectados

São Paulo

2010

2

MILTON RICARDO AZEDO

Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária de

animais naturalmente infectados

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de Doutor em

Ciências

Departamento:

Clínica Médica

Área de concentração:

Clínica Veterinária

Orientador:

Profa. Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera

São Paulo

2010

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2260

Azedo, Milton Ricardo

FMVZ

Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária de animais

naturalmente infectados / Milton Ricardo Azedo. -- 2010.

160 f. : il.

Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Clinica Médica, São Paulo, 2010.

Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária.

Área de concentração: Clínica Veterinária.

Orientador: Profa. Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera.

1. Bovinos. 2. Leucose enzoótica bovina. 3. Resposta imunológica. 4. Vacinação.

5. Febre aftosa. I. Título.

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FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: AZEDO, Milton Ricardo

Título: Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária de animais naturalmente infectados

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de Doutor em

Ciências

Data: ____ / ____ / _____

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ___________________________

Assinatura: __________________________

Julgamento: __________________________

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ___________________________

Assinatura: __________________________

Julgamento: __________________________

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ___________________________

Assinatura: __________________________

Julgamento: __________________________

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ___________________________

Assinatura: __________________________

Julgamento: __________________________

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ___________________________

Assinatura: __________________________

Julgamento: __________________________

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DEDICATÓRIA

A minha família.

Meus pais, Laurinda (“Dona Lalá”) e Milton (“Seu Mimi”),

meu irmão, Carlos Eduardo Azedo (“Dudu”),

meus sobrinhos, Rafael e Fernanda,

meus tios, tias, primos e primas.

Motivo e inspiração para seguir.

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AGRADECIMENTOS

No início de 2003, resolvi retornar a São Paulo para ter a oportunidade de ficar mais próximo de meus pais, à época, já com idade. A experiência dos 13 anos na Amazônia como, principalmente, buiatra, não seria inerente na busca por uma recolocação nesta cidade... e eu estava ciente disto.

Mas, em mim, já havia surgido a vocação para a docência... uma possibilidade. No entanto, seria necessária a busca por aperfeiçoamento, aprender a ensinar... a responder e a perguntar. Seriam prementes Mestrado e Doutorado.

Finda mais esta etapa, certo é que, a cada dia, ainda há muito que aprender, mas a vocação que surgira tornou-se paixão...

Muitos foram fundamentais para que estes últimos anos fossem agradáveis e produtivos. Em especial, agradeço:

À minha querida Amiga, Irmã e Orientadora, Profa Dra Alice Maria Melville Paiva Della

Libera, para sempre “minha chefinha”. Essencial... especial. Pelas conversas e conselhos, pelos ensinamentos, pela paciência, pela confiança, pelos exemplos de profissional prestativa e dedicada, de mãe, filha e esposa, sou eterna e incondicionalmente grato.

À valiosa equipe formada pelos Médicos Veterinários Pós-Graduandos Maiara Garcia Blagitz,

Camila Freitas Batista, Tatiana de Rezende Spínola, Melissa Hartman, Claudia Pestana

Ribeiro, Bárbara Gabriela Soares Sanches e Fernando Nogueira de Souza. Pessoas tão heterogêneas e tão intensas e dedicadas. Nossas pesquisas, nossos trabalhos são fruto do esforço de cada um de nós. Nosso fim... o desenvolvimento de todos. Obrigado por tudo!

Aos diletos Professores Doutores do Departamento de Clínica Médica, Archivaldo Reche Júnior,

Carla Bargi Belli, Carlos Eduardo Larsson, Cássio Xavier de Mendonça Júnior, Denise

Saretta Schwartz, Eduardo Harry Birgel Júnior, Enrico Lippi Ortolani, Fernando José

Benesi, Liliam Gregory, Márcia Mery Kogika, Maria Cláudia Araripe Sucupira, Maria

Helena Akao Larsson, Mitika Kuribayashi Hagiwara, Raquel Yvonne Arantes Baccarin,

Silvia Regina Ricci Lucas e Wilson Roberto Fernandess, por proporcionar adoráveis momentos de amizade e confiança. Por seus ensinamentos, disposição e carinho. Pela alegria da convivência e por todo incentivo, agradeço!

Ao Prof. Dr. Wanderley Pereira de Araújo,, amigo sincero que partiu, exemplo que permanece...

Especialmente ao Prof. Dr. Ubiraem Mario Schalch, certamente o Médico Veterinário mais generoso que eu já conheci. Graças aos seus ensinamentos, tornei-me mais seguro. Graças a sua confiança, tornei-me profissional. Graças a sua benevolência, este trabalho pôde ser realizado. A você, sempre serei grato e renderei, eternamente, homenagem e respeito.

Aos grandes amigos, funcionários desta Casa: Cláudia R. Stricagnolo, Maria Aparecida de

Freitas, Adelaide F. J. Borges, Clara S. Mori, Carmem S. Ribeiro, Marly E. F. de

Castro, Maria Helena F. Silva, Janilda S. Costa, Geraldo N. Thezi e Silvana R. Guedes

que, com um sorriso, um gesto, uma palavra, tornaram meus dias mais agradáveis. Pela convivência e pela colaboração, eu agradeço.

Às amigas do Departamento de Pós-Graduação da FMVZ-USP e da Biblioteca Virginie Buff D’Ápice, pela amizade e colaboração na confecção desta tese. E aos amigos da Clínica de Bovinos e Pequenos Ruminantes e do Hospital Veterinário de Pirassununga, da FMVZ-USP, Edison,

Francisco, Luis, Cecília, Zico, Paulão, pela ajuda, sempre plena, e pela convivência, sempre simpática e doce.

Ao Prof. Dr. Luis Carlos de Sá-Rocha , por permitir o uso do Laboratório de Neuroimunomodulação, do Departamento de Patologia Experimental e Comparada da FMVZ-USP. Velha amizade, novas possibilidades e a permanente colaboração. Obrigado!

Ao Prof. Dr. Flavio Vieira Meirelles, pela amizade, pela confiança e por disponibilizar o Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo; bem como aos seus orientados, Fabiana Bressan e Moyses S. W. Miranda, pela ajuda pronta, essencial e incondicional.

Aos companheiros do curso de Pós-Graduação... todos, sem exceção!! Por tornar meus dias mais ricos e aprazíveis. Por aturar um “tio”, às vezes “azedo” e ranzinza, mas, sempre, grato por poder estar juntode vocês. Pela troca de informações e experiências. Injusta troca, poisrecebi bem mais do

que dei. Obrigado... sem sua constante companhia teria sido bem mais difícil.

Especialmente ao seleto Médico Veterinário Prof. Fabio Celidonio Pogliani, pela amizade sincera, companhia constante e pela colaboração direta na confecção deste trabalho, à querida Médica Veterinária Dra. Mônica Sakai, pela boa vontade e pela valiosa ajuda técnica e à especial

Profa. Ana Carolina Rusca Correa Porto, pelo carinho e pela disposição em ouvir.

Aos colegas docentes e aos alunos da Faculdade de Medicina Veterinária da UNIMES, pelo apoio e companheirismo.

Aos responsáveis das propriedades rurais, que abriram suas portas, e a seus funcionários, que muito auxiliaram na coleta das amostras para a realização deste trabalho; e aos animais tão involuntariamente envolvidos nesta pesquisa, motivo da certeza e do orgulho de uma profissão bem escolhida!

À FAPESP – Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela concessão de Auxílio Pesquisa (Processo no 2005/00643-2) e Bolsa de Doutorado (Processo no 2007/57591-0), imprescindíveis para a implementação deste trabalho.

Acima de tudo, a minha família (meus pais, meu irmão, minha cunhada, sobrinhos, tios e

primos). Mais que incentivadores, carinhosos. Mais que torcedores, cúmplices. Mais que

queridos, essencialmente amados.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho...

...meu sincero, muito obrigado!

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A vida é uma sequência de consequências...

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RESUMO

AZEDO, M. R. Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária de animais naturalmente infectados. [Influence of enzootic bovine leukosis on immune response of naturally infected cattle]. 2010. 160 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.

A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma enfermidade neoplásica, infecto-

contagiosa, pluri-sintomática, de evolução crônica, que compromete os órgãos linfopoiéticos e está associada ao desenvolvimento de linfocitose persistente (LP) e linfossarcoma. Acarreta diminuição na produção, quer por seus efeitos danosos diretos, quer pelos indiretos. No entanto, seu efeito na função e na quantidade das diferentes subpopulações de linfócitos, assim como seu papel no estabelecimento de outras doenças oportunistas, ainda não está claro. O presente estudo avaliou a resposta imunitária de bovinos da raça Holandês Preto e Branco naturalmente infectados pelo vírus da LEB (VLB), após desafio antigênico fornecido por vacinação contra o vírus da febre aftosa. Para tal, foram coletadas amostras sanguíneas antes do desafio e, após o desafio, semanalmente, por sete semanas, de dez vacas soropositivas, sem LP; de dez vacas soropositivas, manifestando LP; e de dez vacas soronegativas. Foram avaliadas as alterações quantitativas das diferentes subpopulações de leucócitos circulantes; a função dos linfócitos B, por meio da quantificação de diferentes isotipos de imunoglobulinas (Ig) séricas; os índices de proliferação linfocitária; os índices de morte celular por apoptose ou por necrose; e as concentrações séricas de interleucina-10 (IL-10), IL-12, inteferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α). Foi verificada a normalidade da distribuição dos resultados obtidos, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F (para dados que apresentaram distribuição normal) ou do teste de Lavene (para dados que não apresentaram distribuição normal). Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, de acordo, respectivamente, com a ocorrência ou não de homoscedasticidade, foram feitos, para dados com distribuição normal, os testes de análise de variância (One-way ANOVA), seguida do teste de Tukey-Kramer ou o teste t; e, para dados que não apresentaram distribuição normal, o teste de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis. Para todos os resultados, foram consideradas significantes as análises que apresentaram p≤0,05. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações séricas de IgG1, de IgM e de IgA, tanto entre os tempos de coleta, quanto, a cada tempo, entre animais pertencentes aos diferentes grupos. As concentrações séricas de IgG2 aumentaram, após a vacinação, em todos os animais (p<0,05).

Todavia, 17 dias após o desafio antigênico, as concentrações séricas de IgG2, em animais manifestando LP foram, a cada tempo de coleta, menores (p<0,01) que aquelas verificadas nos animais pertencentes aos demais grupos, indicando que animais com LP apresentam resposta humoral menos intensa e menos duradoura. Observou-se que ocorreu um aumento no índice de proliferação de linfócitos sanguíneos (p<0,01), 24 dias após a vacinação contra o vírus da febre aftosa, independente da presença de infecção pelo VLB. A partir deste momento, ocorre um aumento na porcentagem de linfócitos γδ circulantes (p<0,05) e posterior diminuição nas concentrações séricas de IgG2 (p<0,05), indicando regulação desta resposta humoral por linfócitos γδ. Em bovinos com LP, o aumento na porcentagem de linfócitos γδ circulantes foi maior (p<0,05), ocasionando diminuição mais intensa e mais precoce nas concentrações séricas de IgG2. Constatou-se que a LP ocorre em decorrência de menor índice de apoptose, posto que as porcentagens de leucócitos sofrendo processo de apoptose foram menores (p≤0,001) entre as células obtidas de animais manifestando LP, do naquelas coletadas dos animais pertencentes aos demais grupos. Verificou-se que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th1, IL-12 e IFN-γ, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados pelo VLB, alinfocitóticos (p<0,01), ao passo que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th2, IL-10 e TNF-α, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados manifestando LP (p<0,01), indicando que alterações no perfil sérico de citocinas podem ser causa ou consequência da LP. Em resposta ao desafio vacinal, ocorre uma elevação nas concentrações séricas de IL-10 (p<0,01), de TNF-α

(p=0,005) e de IFN-γ (p<0,01), três dias após o desafio, e de IL-12 (p<0,001), dez dias após o desafio. A elevação na concentração sérica de IL-10 perdura até 31 dias após o desafio e pode ser responsável pelo maior índice de proliferação de linfócitos γδ verificado a partir de 31 dias após a vacinação. Foi observado que a maioria dos linfócitos B circulantes, em bovinos, consiste de linfócitos B1 e, em animais infectados pelo VLB, a LP ocorre em decorrência de um aumento na porcentagem de linfócitos B1a (p<0,05). Além disso, em animais infectados pelo VLB, apresentando LP, as relações entre linfócitos T auxiliares e citotóxicos são menores (p<0,01) e a porcentagem de linfócitos γδ é maior (p<0,01), indicando atividade viral nas células infectadas. Assim, os resultados permitem-nos concluir que animais infectados pelo VLB, manifestando LP, apresentam alterações na resposta imunitária frente vacinação contra o vírus da febre aftosa.

Palavras-chave: Bovinos. Leucose enzoótica bovina. Resposta imunológica. Vacinação. Febre aftosa.

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ABSTRACT

AZEDO, M. R. Influence of enzootic bovine leukosis on immune response of naturally infected cattle. [Influência do vírus da leucose bovina na resposta imunitária de animais naturalmente infectados]. 2010. 160 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.

Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is an infectious, multi-symptomatic, chronic, neoplastic disease, which undermines the lymphopoietic organs and is associated with the development of persistent lymphocytosis (PL) and lymphosarcoma. Infected animals present a decrease of production, either by its direct or its indirect harmful effects. However, its effect on the function and quantity of different lymphocyte subpopulations, as well as its role in the establishment of other opportunistic diseases, are unclear. This study evaluated the immune response of Holstein dairy cattle naturally infected with Bovine Leukosis Virus BLV, after antigen challenge provided by vaccination against foot and mouth disease (FMD) virus. To this end, blood samples were collected before challenge and after challenge, weekly, for seven weeks, from ten seropositive cows without PL, from ten seropositive cows expressing PL, and from ten seronegative cows. We evaluated the quantitative changes of different subpopulations of leukocytes; the function of B lymphocytes, through the quantification of different isotypes of immunoglobulins (Ig) serum concentration; the rate of lymphocyte proliferation; the rate of cell death by apoptosis or necrosis; and the serum concentrations of interleukin-10 (IL-10), IL-12, inteferon-γ (IFN-γ), and tumor necrosis factor-α (TNF-α). It was verified the normality of distribution of the results using the Anderson-Darling test, and their homoscedasticity, using the F test (for data with normal distribution) or the Levene test (for data without normal distribution). For the evaluation of differences between the average results, according respectively to the presence or absence of homoscedasticity, we used, for data with normal distribution, One-way ANOVA test, followed by the Tukey-Kramer test or the t test, and, for data without normal distribution, the Mann-Whitney test or the Kruskal-Wallis test. Results with p≤0.05 were considered statistically significant. There were no differences related to serum IgG1, IgM, and IgA concentrations, both among sampling time and, every time, among animals belonging to different groups. IgG2 serum concentrations increased after vaccination in all animals (p<0.05). However, in animals expressing PL, each collection time, 17 days after antigen challenge, IgG2 serum concentration was lower (p<0.01) than those observed in animals belonging to other groups, indicating that animals with PL present less intense and less enduring humoral response. It was observed that there was an increase in the rate of lymphocyte proliferation (p<0.01) 24 days after vaccination against FMD virus, irrespective of the presence of infection by BLV. From this moment, there was an increase in the percentage of γδ-lymphocytes (p<0.05) and a subsequent decrease in serum IgG2 (p<0.05), indicating regulation of this humoral response by γδ-lymphocytes. In cattle with PL, the increase in the percentage of γδ-lymphocytes was higher (p<0.05), leading to more intense and earlier decrease in IgG2 serum concentration. It was found that PL is due to a lower rate of apoptosis, since the percentage of leukocytes undergoing apoptosis was lower (p≤0.001) among cells obtained from animals expressing PL, when compared to those collected from animals from the other groups. It was found that serum concentrations of Th1

cytokines, specifically IL-12 and IFN-γ, were higher in blood samples from non-lymphocytotic infected animals (p<0.01), whereas serum concentrations of Th2 cytokines, particularly IL-10 and TNF-α, were higher in blood samples from infected animals expressing LP (p<0.01), indicating that changes in serum cytokines profile may be a cause or a consequence of PL. IL-10 (p<0.01), TNF-α (p=0.005), and IFN-γ (p<0.01) serum concentrations increased three days after the challenge, and IL-12 serum concentration increased (p<0.001), ten days after the challenge. The increase in IL-10 serum concentration lasts until 31 days after the challenge and may account for the higher rate of γδ-lymphocyte proliferation found from 31 days after vaccination. It was observed that the majority of circulating B lymphocytes in cattle consists of B1 lymphocytes and that, in BLV-infected animals, PL occurs due to an increase in the percentage of B1a lymphocytes (p<0.05).

Moreover, in lymphocytotic BLV-infected animals, the rate between helper and cytotoxic T-lymphocytes are smaller (p<0.01) and the percentage of γδ-lymphocytes is greater (p<0.01), indicating viral activity in infected cells. Thus, results allow us to conclude that lymphocytotic BLV-infected animals show changes in the immune response after vaccination against FMD

virus.

Key words: Cattle. Bovine leukosis. Immune response. Vaccination. Foot and mouth disease.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema representando a partícula viral do Vírus da Leucemia Bovina e seus componentes – São Paulo – 2010...................................................................... 29

Figura 2 – Esquema representando a hipótese de Gillet et al. (2007) para a manutenção do estado alinfocitótico em animais infectados pelo Vírus da Leucemia

Bovina – São Paulo – 2010................................................................................ 36

Figura 3 – Esquema representando hipótese para a manutenção do estado alinfocitótico em animais infectados pelo Vírus da Leucemia Bovina – São Paulo – 2010.... 37

Figura 4 – Esquema representando hipótese de Amills et al. (2002) para a manutenção da linfocitose persistente, em animais infectados pelo Vírus da Leucemia

Bovina – São Paulo – 2010................................................................................ 38

Figura 5 – Esquema representando hipótese de Gillet et al. (2007) para a gênese e manutenção da linfocitose persistente, em animais infectados pelo Vírus da

Leucemia Bovina – São Paulo – 2010............................................................... 39

Figura 6 – Esquema representando hipótese de suscetibilidade genética para a gênese e manutenção da linfocitose persistente, em animais infectados pelo Vírus da

Leucemia Bovina – São Paulo – 2010............................................................... 40

Figura 7 – Resumo esquemático do delineamento experimental adotado no presente estudo – São Paulo – 2010................................................................................. 47

Figura 8 – Resumo esquemático do ensaio de proliferação de linfócitos adotado no presente estudo (separação de células mononucleares por gradiente de

concentração, lise de eritrócitos e quantificação de células viáveis) – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 53

Figura 9 – Resumo esquemático do ensaio de proliferação de linfócitos adotado no presente estudo (incorporação de CFSE, incubação para proliferação celular

e leitura em citômetro de fluxo) – São Paulo – 2010......................................... 54

Figura 10 – Resumo esquemático do ensaio de avaliação da morte de leucócitos adotado no presente estudo – São Paulo – 2010.............................................................. 56

Figura 11 – Resumo esquemático do ensaio de quantificação de subpopulações de leucócitos do sangue periférico (fenotipagem) adotado no presente estudo –

São Paulo – 2010............................................................................................... 59

Figura 12 – Resultado da imunodifusão em agar gel (IDAG) para diagnóstico de leucose enzoótica bovina em 274 vacas da raça Holandês Preto e Branco – São Paulo

– 2010................................................................................................................. 61

Figura 13 – Resultado do teste ELISA para diagnóstico de leucose enzoótica bovina em 274 vacas da raça Holandês Preto e Branco – São Paulo – 2010...................... 62

Figura 14 – Distribuição (% sobre total) de 274 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função dos resultados da imunodifusão em gel de agar para diagnóstico

de Leucose Enzoótica Bovina e do leucograma – São Paulo – 2010................ 63

Figura 15 – Valores médios da contagem de eritrócitos (por µL de sangue) de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010..............................

66

Figura 16 – Valores médios da contagem total de leucócitos (por µL de sangue) de 30

vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 67

Figura 17 – Valores absolutos médios da contagem diferencial de linfócitos (por µL de sangue) de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função

do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................. 68

Figura 18 – Valores médios das relações entre os valores absolutos de linfócitos e os valores absolutos de neutrófilos verificados nos leucogramas de 30 vacas da

raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 69

Figura 19 – Valores séricos de cada classe de imunoglobulina verificados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010;;;.. 72

Figura 20 – Valores séricos de IgG2 verificados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta1 – São Paulo – 2010................................................................................ 73

Figura 21 – Valores séricos de IgG1 verificados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 74

Figura 22 – Valores séricos de IgM verificados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 75

Figura 23 – Valores séricos de IgA verificados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 76

Figura 24 – Índices médios de proliferação de linfócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do estímulo in vitro, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 80

Figura 25 – Índices médios de proliferação de linfócitos obtidos de 10 vacas da raça Holandês Preto e Branco soronegativas para a Leucose Enzoótica Bovina

(grupo SN), em função do estímulo in vitro, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010...................................................................................................... 81

Figura 26 – Índices médios de proliferação de linfócitos obtidos de 10 vacas da raça Holandês Preto e Branco positivas para a Leucose Enzoótica Bovina, não

manifestando linfocitose persistente (grupo AL), em função do estímulo in vitro, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.............................................

82

Figura 27 – Índices médios de proliferação de linfócitos obtidos de 10 vacas da raça Holandês Preto e Branco positivas para a Leucose Enzoótica Bovina,

manifestando linfocitose persistente (grupo LP), em função do estímulo in vitro, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.............................................

83

20

Figura 28 – Índices basais de proliferação de linfócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em relação ao grupo experimental, a cada tempo

de coleta – São Paulo – 2010............................................................................. 84

Figura 29 – Índices de proliferação, após estímulo in vitro com concanavalina-A, de linfócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em relação

ao grupo experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................. 85

Figura 30 – Índices de proliferação, após estímulo in vitro com lipopolissacarídeos de Escherichia coli (LPS), de linfócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em relação ao grupo experimental, a cada tempo de coleta –

São Paulo – 2010............................................................................................... 86

Figura 31 – Porcentagens médias células em processo de apoptose e de necrose verificadas em leucócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e

Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010......................................... 90

Figura 32 – Porcentagens médias células em processo de apoptose verificadas em leucócitos obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função

do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................. 91

Figura 33 – Concentrações séricas de Interleucina-10 (IL-10), IL-12, Interferon-γ (IFN-γ) e Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) verificados em 30 vacas da raça

Holandês Preto e Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010............. 95

Figura 34 – Concentrações séricas de Interferon-γ (IFN-γ) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 96

Figura 35 – Concentrações séricas de Interleucina-12 (IL-12) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 97

Figura 36 – Concentrações séricas de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 98

Figura 37 – Concentrações séricas de Interleucina-10 (IL-10) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 99

Figura 38 – Porcentagens médias de leucócitos CD3(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 103

Figura 39 – Porcentagens médias de leucócitos CD21(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 104

Figura 40 – Porcentagens médias de leucócitos CD2(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 105

Figura 41 – Porcentagens médias de leucócitos WC1(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 106

Figura 42 – Porcentagens médias de leucócitos CD14(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada tempo de

coleta – São Paulo – 2010.................................................................................. 107

Figura 43 – Porcentagens médias de leucócitos CD3(+) CD4(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada

tempo de coleta – São Paulo – 2010.................................................................. 110

Figura 44 – Porcentagens médias de leucócitos CD3(+) CD8(+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a cada

tempo de coleta – São Paulo – 2010.................................................................. 111

Figura 45 – Relações médias entre leucócitos CD3(+) CD4(+) e CD3(+) CD8(+), obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 112

Figura 46 – Porcentagens médias de linfócitos B1a (leucócitos CD21+ CD5+ CD11b+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 117

Figura 47 – Porcentagens médias de linfócitos B1b (leucócitos CD21+ CD5- CD11b+) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 118

Figura 48 – Porcentagens médias de linfócitos B2 (leucócitos CD21+ CD5- CD11b-) obtidos de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo

experimenta, a cada tempo de coleta1 – São Paulo – 2010............................... 119

Figura 49 – Porcentagens médias de leucócitos CD21(+) CD5(+) CD11b(-) obtidos de 30

vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 120

Figura 50 – Dinâmica das variáveis estudadas, em amostras sanguíneas obtidas de 30

vacas da raça Holandês Preto e Branco, em função do tempo de coleta – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 121

Figura 51 – Dinâmica das variáveis estudadas, em amostras sanguíneas obtidas de 10

vacas da raça Holandês Preto e Branco, soronegativas para Leucose

Enzoótica Bovina, em função do tempo de coleta – São Paulo – 2010............. 122

Figura 52 – Dinâmica das variáveis estudadas, em amostras sanguíneas obtidas de 10

vacas da raça Holandês Preto e Branco, soropositivas para Leucose

Enzoótica Bovina, sem linfocitose persistente, em função do tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 123

Figura 53 – Dinâmica das variáveis estudadas, em amostras sanguíneas obtidas de 10

vacas da raça Holandês Preto e Branco, soropositivas para Leucose

Enzoótica Bovina, com linfocitose persistente, em função do tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 124

22

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Valores do leucograma de fêmeas bovinas sadias, estratificadas segundo a idade, criadas no Estado de São Paulo, utilizados como referência no

presente trabalho – São Paulo – 2010................................................................ 49

Tabela 2 – Resultados médios (± desvio padrão) do hemograma, em números absolutos, de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 64

Tabela 3 – Resultados médios (± desvio padrão) do hemograma, em números absolutos, de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, a cada tempo de coleta – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 65

Tabela 4 – Resultados médios (± desvio padrão) das quantidades de imunoglobulinas séricas (mg/dL) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco,

separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 70

Tabela 5 – Resultados médios (± desvio padrão) das quantidades de imunoglobulinas séricas (mg/dL) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 71

Tabela 6 – Índices médios (± desvio padrão) de proliferação de linfócitos, com e sem estímulo in vitro, observados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 77

Tabela 7 – Índices médios (± desvio padrão) de proliferação de linfócitos, com e sem estímulo in vitro, observados em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010....................................................... 79

Tabela 8 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de leucócitos em processo de apoptose ou em processo de necrose, observadas em 30 vacas da raça

Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 87

Tabela 9 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de leucócitos em processo de apoptose ou em processo de necrose, observadas em 30 vacas da raça

Holandês Preto e Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010............. 88

Tabela 10 – Resultados médios (± desvio padrão) das quantidades de IL-12, IFN-γ, IL-10

e TNF-α séricas (pg/mL) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e

Branco, separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta

– São Paulo – 2010............................................................................................ 92

Tabela 11 – Resultados médios (± desvio padrão) das quantidades de IL-12, IFN-γ, IL-10

e TNF-α séricas (pg/mL) verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e

Branco, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010......................................... 93

Tabela 12 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de leucócitos CD3(+), CD21(+), WC1(+), CD2(+) e CD14(+), observadas no sangue periférico de 30 vacas da

raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo experimental, a

cada tempo de coleta – São Paulo – 2010.......................................................... 100

Tabela 13 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de leucócitos CD3(+), CD21(+), WC1(+), CD2(+) e CD14(+), observadas no sangue periférico em 30 vacas

da raça Holandês Preto e Branco, separadas em função do grupo

experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010................................ 101

Tabela 14 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de linfócitos CD3(+) CD4(+) e CD3(+) CD8(+) e relações entre linfócitos CD3(+) CD4(+) e CD3(+)

CD8(+), verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, separadas

em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São Paulo –

2010.................................................................................................................... 108

Tabela 15 – Porcentagens médias (± desvio padrão) de linfócitos CD3(+) CD4(+) e CD3(+) CD8(+) e relações entre linfócitos CD3(+) CD4(+) e CD3(+)

CD8(+), verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco, a cada

tempo de coleta – São Paulo – 2010.................................................................. 109

Tabela 16 – Porcentagens médias (± desvio padrão) das subpopulações de linfócitos B

(CD21+), verificadas em 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco,

separadas em função do grupo experimental, a cada tempo de coleta – São

Paulo – 2010...................................................................................................... 113

Tabela 17 – Porcentagens médias (± desvio padrão) das subpopulações de linfócitos B

(CD21+) no sangue periférico de 30 vacas da raça Holandês Preto e Branco,

a cada tempo de coleta – São Paulo – 2010....................................................... 114

24

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIDS

Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (do inglês: Acquired Immune

Deficiency Syndrome)

APC Célula

Apresentadora

de Antígeno (do inglês: Antigen-presenting Cell)

ATL

Leucemia aguda de células T (do inglês: Acute T-Cell Leukemia)

BoLA Antígeno

leucocitário bovino (do inglês: Bovine Leukocyte Antigen)

CD

Grupamento de Diferenciação (do inglês: Cluster of Differentiation ou Cluster of Designation)

CFSE

Éster de succinimidil diacetato de carboxifluoresceína (do inglês:

Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester)

Con-A Concanavalina-A

COX Cicloxegenase

Cy-5 Cianina-5

(do

inglês:

Cyanine-5)

DNA

Ácido desoxirribonucléico (do inglês: Deoxyribonucleic Acid)

EDTA Ácido

etilenodiamino

tetra-acético (do inglês: Ethylenediamine Tetraacetic Acid)

ELISA

Ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (do inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

ERO

Espécie reativa de oxigênio

FITC Isotiocianato

de

fluoresceína (do inglês: Fluorescein Isothiocyanate)

gp51 Glicoproteína

51

HAM/TSP

Mielopatia/paraparesia espástica tropical associadas ao HTLV (do inglês: HTLV-Associated Myelopathy/ Tropical Spastic Paraparesis)

HIV

Vírus da imunodeficiência de humanos (do inglês: Human Immunodeficiency

Vírus)

HTLV

Vírus linfotrópicos de células T de humanos (do inglês: Human T-lymphotropic Vírus)

IDAG

Imunodifusão em agar gel

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

INF Interferon

LEB

Leucose enzoótica bovina

LP Linfocitose

persistente

LPS Lipopolissacarídeos

MAPA

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MHC-II

Complexo principal de histocompatibilidade de classe II (do inglês: Major Histocompatibility ComplexClass II)

mRNA RNA

mensageiro

OIE Escritório

Internacional de Epizootias (do francês Office International des

Epizooties), atual Organização Mundial para Saúde Animal

OLA

Antígeno leucocitário ovino (do inglês: O vine Leukocyte Antigen)

p24 Proteína

24

p40 Proteína

40

PBMC

Células mononucleares de sangue periférico (do inglês: Peripheral Blood

Mononuclear Cells)

PBS

Solução salina fosfatada (do inglês: Phosphate Buffered Saline)

PCR

Reação em cadeia da polimerase (do inglês: Polymerase Chain Reaction) PE Ficoeritrina

(do

inglês:

Phycoerytrin)

PHEFA

Plano Hemisférico de Erradicação da Febre Aftosa

PI

Iodeto de Propídio (do inglês: Propide Iodide)

PNEFA

Programa Nacional de Erradicação da Febre Aftosa

PTLV

Vírus linfotrópicos de células T de primatas (do inglês: Primate T-lymphotropic Vírus)

RNA

Ácido ribonucléico (do inglês: Ribonucleic Acid)

RPMI Meio

Roswell Park Memorial Institute (do inglês: Roswell Park Memorial Institute medium)

sIgM

Imunoglobulina M de superfície

STLV

Vírus linfotrópicos de células T de símios (do inglês: Simian T-lymphotropic Vírus)

TNF

Fator de necrose tumoral (do inglês: Tumor necrosis factor)

VLB

Vírus da leucose bovina

26

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO................................................................................................... 27

2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................... 29

3

OBJETIVOS........................................................................................................ 45