Influência dos barorreceptores na evolução da cardiomiopatia e da nefropatia diabética em ratos por Janaina Paulini Aguiar - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Medicina

JANAINA PAULINI AGUIAR

Influência dos barorreceptores na evolução da

cardiomiopatia e da nefropatia diabética em ratos

São Paulo

2011

JANAINA PAULINI AGUIAR

Influência dos barorreceptores na evolução da

cardiomiopatia e da nefropatia diabética em ratos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, para Obtenção do

Título de Doutor em Ciências

Programa de Cardiologia

Orientadora: Profª. Drª. Maria Claudia Costa

Irigoyen

São Paulo

2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

A

g

u iar, Janaina Paulini

Influência dos barorreceptores na evolução da cardiomiopatia e da nefropatia

diabética em ratos / Janaina Paulini Aguiar. -- São Paulo, 2011.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Cardiologia.

Orientadora: Maria Claudia Costa Irigoyen.

Descritores: 1.Diabetes mellitus 2.Barorreflexo 3.Cardiomiopatias 4.Nefropatias

5.Fluxo sanguineo regional 6.Circulação renal

USP/FM/DBD-054/11

Aprovado em: ___/___/___

Banca Examinadora

Prof. Dr.

__________________Instituição: _______________

Julgamento:

__________________Assinatura: _______________

Prof. Dr.

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Julgamento:

__________________Assinatura: _______________

Dedicatória

Dedico esta tese aos meus pais. A vocês, que me deram a vida e me

ensinaram a vivê-la com dignidade, não bastaria um obrigado. A vocês, que

iluminaram os caminhos obscuros com afeto e dedicação para que os

trilhasse sem medo e cheio de esperança não bastaria um muito obrigado. A

vocês, que se doaram inteiros e renunciaram aos seus sonhos, para que,

muitas vezes, pudesse realizar os meus não bastaria um muitíssimo

obrigado. É por vocês que, mesmo sentindo a “presença da ausência”, tenho

forças para continuar. A vocês, pais por natureza, por opção e amor, não

bastaria dizer que não tenho palavras para agradecer tudo isso. Em

gratidão, o que posso lhes oferecer são meu amor e orgulho eternos.

Agradecimentos

Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras

pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto

pode mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso.

Aos meus pais, Manoel e Eliana, que além de me darem a vida, me deram

a sabedoria de viver, a paciência de esperar, a força para vencer e a

coragem para me re-erguer. Que me dão amor incondicional. Que muitas

vezes abriram mão de seus sonhos para realização dos meus! Que foram e

ainda são exemplos de pessoas para mim!

À Profa. Dra. Maria Claudia Irigoyen, ser humano de raríssima beleza,

exemplo de determinação, de liderança a ser alcançado; meu muito obrigada

pelo incentivo, apoio, orientação e o carinho ofertado, é muito bom aprender

com você. Obrigada pela confiança e dedicação incessante na minha

formação.

A Profa. Dra. Vera Farah por colocar a disposição seu laboratório.

A Patrícia Fiorino, pelo apoio, por colocar a disposição seu laboratório e

seu tempo, além dos ensinamentos na discussão deste trabalho e

discussões filosóficas sobre a vida.

A Profa. Dra. Kátia De Angelis, responsável pelo inicio da minha formação

acadêmica/cientifica.

As minhas grandes amigas Lisoca, Tati e Silbecas, pela grande

colaboração na realização deste trabalho, mas, principalmente, pela

amizade, forca, atenção e companheirismo ao longo dessa jornada.

A Minha grande amiga Luinha por todo auxílio, horas de discussão e idéias,

mas, acima de tudo por compartilharmos sonhos e a vontade de concretizá-

los.

Ao Edson, pelo carinho, torcida e auxílio no trabalho profissional;

Aos companheiros do laboratório pelo incentivo em todos os momentos.

A todos da divisão de experimentação do Instituto do Coração e do

Mackenzie aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a

realização deste trabalho.

A Eva, Juliana e Neuza da secretaria do programa de pós-graduação

Cardiologia, sempre solícitas no atendimento e esclarecimento das duvidas.

Ao (Cnpq) pela concessão da bolsa de doutorado.

A toda a equipe do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, por

apoiar a qualificação constante, compartilhando os esforços de uma

assistência, ensino e pesquisa com qualidade;

Às enfermeiras da Clinica medica do HU Carolina, Samira, Tatiana, Thais,

Isabel, Michelli, Josiane, Anna Claudia, Nivia, Fernanda, Angela, à Chefe

Felícia, pela amizade, união e cumplicidade na vida profissional, estar com

vocês é um privilégio;

À querida equipe de enfermagem da unidade de clínica médica (Manoel,

Marilane, Evandro, Rose, Cida, Nilse, Graça, Maria e Luiz), meu crescer,

meu coração, minha vida está entrelaçada com a de vocês;

Aos meus irmãos Cauê e Tainá, pelo amor, apoio em todos os sentidos,

amizade e incentivo em toda a minha vida.

Ao meu “presentinho” pela amizade sólida e verdadeira, por sua alegria e

energia positiva, estando sempre ao nosso lado.

Ao meu amado e querido Nicolas, por me ensinar o verdadeiro significado

da palavra amor.

A minha Família por ter feito o melhor por mim sempre.

Minha gratidão.

Sumário

Lista de abreviaturas e siglas

Lista de figuras

Lista de tabelas

Resumo

Abstract

1. Introdução ................................................................................................ 1

1.1

Diabetes ............................................................................................ 1

1.2

Nefropatia Diabética.......................................................................... 6

1.3

Cardiomiopatia Diabética .................................................................. 9

1.4 Controle Da Pressão Arterial........................................................... 10

1.5

Desnervação Sino-Aórtica............................................................... 12

2. Objetivo .................................................................................................... 16

2.1 Objetivos Específicos .......................................................................... 16

3. Métodos................................................................................................... 17

3.1 Animais e grupos................................................................................. 17

3.2 Delineamento Do Protocolo Experimental:......................................... 18

3.3 Diabetes induzido por estreptozotocina ............................................. 18

3.4 Desnervação Sino-Aórtica.................................................................. 19

3.5 Avaliações Metabólicas..................................................................... 22

3.5.1 Glicemia Plasmática e Teste de Tolerância a Glicose (GTT) ........ 22

3.5.2 Avaliação da ingesta hídrica e da excreção urinária (Gaiola

Metabólica)............................................................................................. 22

3.6 Medidas Hemodinâmicas .................................................................... 24

3.6.1 Ecodopplercardiograma ................................................................ 24

3.6.2 Canulação ..................................................................................... 29

3.6.3 Medidas de pressão arterial e labilidade da PA ........................... 31

3.6.4 Avaliação do Reflexo Pressorreceptor .......................................... 33

3.6.5 Análise Espectral e Espectral Cruzada ......................................... 35

3.6.6 Avaliação Do Controle Autonômico............................................... 36

3.7 Protocolo Experimental do Rim Isolado .............................................. 37

3.7.1 Protocolo Experimental ................................................................. 38

3.7.2 Análise dos parâmetros renais ..................................................... 40

3.7.3 Cálculo dos parâmetros renais..................................................... 40

3.8 Avaliação do Fluxo Sangüíneo – Método das Microesferas Coloridas 47

3.8.1 Digestão e processamento dos tecidos......................................... 48

3.8.2 Extração do corante e medidas de absorbância ........................... 49

3.8.3 Determinação do fluxo sanguíneo................................................. 49

3.8.4 Determinação do débito cardíaco.................................................. 50

3.8.5 Determinação do índice cardíaco.................................................. 51

3.8.6 Determinação da resistência vascular sistêmica total ................... 51

3.9 Análise Estatística ............................................................................... 51

4. Resultados ............................................................................................... 52

4. 1. Parâmetros metabólicos.................................................................... 52

4.1.1. Medida do peso corporal ............................................................. 52

4.1.2 Resposta à sobrecarga glicêmica.................................................. 53

4.1.3. Avaliação da ingesta hídrica e excreção urinária (Gaiola

Metabólica)............................................................................................. 55

4.2. Parâmetros Ecocardiográficos .......................................................... 57

4.3. Medida direta da pressão arterial e da freqüência cardíaca.............. 58

4.4 Avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores............................ 59

4. 5 Avaliação da modulação autonômica cardíaca ............................. 60

4.6 Avaliação no Sistema de Rim Isolado: Perfusão Renal Extracorpórea.

.................................................................................................................. 64

4.6.1 Pressão de Perfusão..................................................................... 64

4.6.2 Resistência Vascular Renal........................................................... 65

4.6.3 Fluxo Urinário ................................................................................ 66

4.6.4 Ritmo de Filtração Glomerular....................................................... 67

4.6.5 Fluxo Plasmático Renal................................................................. 69

4.7 Fluxos Sanguíneos Regionais............................................................. 70

4.8 Resistências Vascular Periférica Total e Regional.............................. 71

4.9 Débito e Índice Cardíaco..................................................................... 72

5. Discussão................................................................................................. 78

5.1 Parâmetros Metabólicos...................................................................... 78

5.1.1 Peso corporal e Resposta à sobrecarga glicêmica....................... 78

5.2 Avaliação da ingesta hídrica e da excreção urinária: gaiola metabólica

.................................................................................................................. 79

5.3 Avaliações morfométricas ................................................................... 81

5.4 Avaliações hemodinâmicas sistêmicas ............................................... 85

5.5 Avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores............................. 91

5.6 Avaliação da função autonômica........................................................ 93

5.7 Domínio da frequência ....................................................................... 97

5.8 Avaliação do Fluxo Sanguíneo Regional............................................. 99

5.9 Avaliação da Função Renal ex vivo: perfusão renal.......................... 101

6. Conclusões............................................................................................. 103

7. Referências bibliográficas ...................................................................... 105

Lista de abreviaturas e siglas

ATRAMI - Autonomic tone and reflex after myocardial infarction

DC- Débito cardíaco

DM - Diabetes Mel itus

DSA - Desnervação sino aórtica

ERP - Espessura relativa da parede

FC- Freqüência cardíaca

FCI- Freqüência cardíaca intrínseca

FEj % - Fração de ejeção

FEnc%- Fração de encurtamento

FPR- Fluxo plasmático renal

FU- Fluxo Urinário

GC - Grupo controle

GCD- Grupo controle desnervado

GD - Grupo diabético

GDD - Grupo desnervado diabético

GTT- Teste de tolerância a glicose

HF- Banda de alta freqüência

IP- Intervalo de pulso

ip – Intraperitonial

LF- Banda de Baixa freqüência

LV- Ventrículo esquerdo

LVW- Espessura diastólica e sistólica da parede posterior do ventrículo esquerdo

NTS- Núcleo do trato solitário

PA- Pressão arterial

PAD- Pressão arterial diastólica

PAM- Pressão arterial média

PAS- Pressão arterial sistólica

PDF- Pressão diastólica final

PP- Pressão de perfusão

PPDIA - Parede posterior na Diástole

RFG- Ritmo de filtração glomerular

RVP- Resistência vascular periférica

SIVDIA- Septo intraventricular na diástole

SNA- Sistema nervoso autônomo

STZ – Streptozotocina

TFG - Taxa de Filtração glomerular

TRIV- tempo de relaxamento isovolumétrico

VD- Ventrículo Direito

VE - Ventrículo esquerdo

VEDIA - Cavidade do ventrículo esquerdo em diástole

VESIS - Ventrículo esquerdo na sístole

VO2 MÁX. - Consumo máximo de oxigênio

VPA - Variabilidade da pressão arterial

WKY- Wistar Kyoto

Lista de figuras

Figura 1 - Visão ventral do animal, com incisão expondo a musculatura do

pescoço.........................................................................................................20

Figura 2 – Visão do feixe vásculo - nervoso, após afastamento da

musculatura do pescoço................................................................................21

Figura 3 – Inervação na região da bifurcação da carótida. A: localização do

nervo laríngeo superior; B: detalhe da inervação do corpo carotídeo e dos

pressorreceptores carotídeos........................................................................21

Figura 4: Gaiola metabólica utilizada no protocolo experimental para

avaliação do consumo hídrico, de ração e do volume urinário......................23

Figura 5- Modo-M do VE, guiado pelo modo bidimensional, com o cursor

posicionado entre a válvula mitral e o músculo papilar, mostrando espessura

diastólica e sistólica do septo-interventricular (IVS), cavidade do ventrículo

esquerdo na diástole e na sístole (LV) e espessura diastólica e sistólica da

parede posterior do ventrículo esquerdo (LVW)............................................28

Figura 6 – Corte apical 4 câmaras mostrando o posicionamento do volume

amostra (seta) , próximo à face ventricular da valva mitral para avaliação do

fluxo transmitral no estudo do Doppler pulsátil..............................................29

Figura 7 – Sítio de dissecção para a cateterização da artéria femoral.........30

Figura 8 – Isolamento da artéria femoral e inserção do cateter...................31

Figura 9- Esquema do sistema de registro de Pressão Arterial...................33

Figura 10: Registro da pressão arterial e freqüência cardíaca antes e após a

administração de drogas vasoativas. Observe a resposta reflexa dos

pressorreceptores..........................................................................................35

Figura 11: Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado de

rato.................................................................................................................42

Figura 12: Sistema de perfusão renal...........................................................44

Figura 13: Canulação do ureter (A), da canulação da artéria renal do rim

direito (B), início da perfusão renal (C) e acoplamento do rim no sistema

extracorpóreo (D)...........................................................................................46

Figura 14: Peso corporal inicial e final dos grupos Controle (GC), Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............................53

Figura 15: Área sob a curva de resposta glicêmica após injeção

intraperitonial (ip) de glicose (1.5g/kg) dos grupos Controle (GC), Diabético

(GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............................54

Figura 16: C urva da resposta glicêmica após injeção intraperitonial ( ip) de glicose (1.5g/kg) dos grupos Controle (GC), Diabético (GD), Desnervado

(GCD) e Desnervado diabético (GDD)..........................................................55

Figura 17: A variância do intervalo de pulso cardíaco (IP) foi menor nos

grupos Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)

em comparação ao grupo controle (GC).......................................................61

Figura 18: Correlação entre a sensibilidade barorreflexa (mmHg )e o nível

glicêmico plasmático (mg/dL)........................................................................74

Figura 19: Correlação entre a variabilidade do intervalo de pulso (ms2) e o

débito cardíaco (ml/ min)...............................................................................75

Figura 20: Correlação entre a sensibilidade barorreflexa (mmHg )e o fluxo

coronário (ml/min/g).......................................................................................76

Figura 21: Correlação entre a sensibilidade barorreflexa (mmHg )e o fluxo

renal (ml/min/g)..............................................................................................77

Lista de Tabelas

Tabela 1: Cálculo dos Parâmetros Renais....................................................41

Tabela 2: Componentes do sistema de perfusão renal................................43

Tabela 3: Procedimento para retirada do rim direito.....................................45

Tabela 4: Parâmetros avaliados na gaiola metabólica.................................56

Tabela 5: Parâmetros ecocardiográficos de morfometria diastólica e de

função cardíaca (sistólica e diastólica) dos ratos controles, diabéticos,

desnervados e desnervados diabéticos........................................................58

Tabela 6: Pressão Arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) média (PAM) e

freqüência cardíaca (FC) dos grupos Controle (GC), Diabético (GD),

Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético (GDD).....................................59

Tabela 7: Sensibilidade barorreflexa nos grupos Controle (GC), Diabético

(GD), Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético (GDD)...........................60

Tabela 8: Análise espectral da banda de baixa (LF) e de alta (HF) frequência

do tacograma e relação LF/HF nos grupos Controle (GC), Diabético (GD),

Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético (GDD).....................................62

Tabela 9: Variância da pressão arterial sistólica (PAS), banda de baixa (LF)

e de alta (HF) frequência do sistograma nos grupos controle (C), diabético

(GD), desnervado (GCD) e desnervado diabético (GDD).............................63

Tabela 10: Pressão de perfusão nos rins dos grupos Controle (GC),

Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............65

Tabela 11: Resistência vascular renal nos dos grupos Controle (GC),

Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............66

Tabela 12: Fluxo urinário dos grupos Controle (GC), Diabético (GD),

Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)......................................67

Tabela 13: Ritmo de filtração glomerular dos grupos Controle (GC),

Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............68

Tabela 14: Fluxo plasmático renal dos grupos Controle (GC), Diabético

(GD), Desnervado (GCD) e Desnervado diabético (GDD)............................69

Tabela 15: Análise do fluxo sanguíneo regional nos grupos Controle (GC),

Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético (GDD)...........70

Tabela 16: Análise da resistência vascular periférica total nos grupos

Controle (GC), Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético

(GDD)............................................................................................................71

Tabela 17: Análise da resistência vascular regional nos grupos Controle

(GC), Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético (GDD)..72

Tabela 18: Análise do débito cardíaco e do índice cardíaco nos grupos

Controle (GC), Diabético (GD), Desnervado (GCD) e Desnervado Diabético

(GDD)............................................................................................................73

Resumo

Paulini J. Influência dos barorreceptores na evolução da cardiomiopatia e

da nefropatia diabética em ratos [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2011. 154p.

Está bem documentada a importância da disfunção autonômica na

evolução das complicações do Diabetes. Adicionalmente, novas e

consistentes evidências indicam que o controle reflexo da circulação

comandado pelos baroreceptores poderia ser um marcador prognóstico

precoce no Diabete melito, clínico e experimental. No presente projeto,

testamos a hipótese de que a disfunção barorreflexa interfere no

desenvolvimento da nefropatia e cardiomiopatia diabética por alterar a

modulação autonômica comandada pelos barorreceptores arteriais sobre

vasos e coração. Foram utilizados ratos Wistar machos (230 a 260g)

divididos em 4 grupos experimentais: controle (GC, n=9), diabético (GD,

n=11), desnervado (GCD, n=9) e desnervado diabético (GDD, n=8). Após 7

dias de desnervação sinoaórtica, foi realizada a indução do diabetes (DM)

por estreptozotocina (STZ). Foram realizadas avaliações metabólicas, teste

de tolerância a glicose e avaliações ecocardiográficas durante a terceira

semana do protocolo. A partir dos 28 dias de protocolo foram realizados

registros diretos da pressão arterial (PA) e avaliações da sensibilidade

barorreflexas, da modulação autonômica cardiovascular (variabilidade da

freqüência cardíaca e da PA sistólica), análise dos fluxos sanguíneos

regionais e avaliações renais ex –vivo. Os grupos diabéticos (GD e GDD)

apresentaram aumento da glicemia e redução do peso corporal, da PA e da

freqüência cardíaca quando comparados com os grupos não diabéticos (GC

e GCD). Os grupos diabéticos apresentaram uma maior área de resposta

sob a curva de resposta glicêmica quando comparados aos grupos controle,

indicando assim uma intolerância maior a glicose. Nos parâmetros

morfométricos, o septo interventricular (SIVDIA) mostrou-se menor nos

grupos diabéticos quando comparados ao GC. A parede posterior do

ventrículo esquerdo (PPDIA) mostrou-se diminuída somente no grupo

diabético. Com relação ao tamanho da cavidade do ventrículo esquerdo na

diástole (VEDIA), observou-se uma tendência a aumento em todos os

grupos quando comparados ao controle. A massa do ventrículo esquerdo

(MVE) foi menor no grupo diabético em relação ao controle e maior nos

grupos submetidos à DSA quando comparados ao GC.

A função sistólica foi avaliada pela fração de ejeção (FE), na qual não foi

observada diferença entre os grupos estudados. A função diastólica foi

avaliada pelo tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) que foi maior no

grupo diabético quando comparado ao controle. Já o grupo desnervado

apresentou valores próximos ao do GC. Entretanto, o grupo desnervado

diabético apresentou valores menores de TRIV quando comparado aos

animais apenas diabéticos. Disfunção autonômica, avaliada pela

sensibilidade barorreflexa, pela variabilidade da FC (VFC) e da PA sistólica

(VPAS), foram observadas nos grupos GD, GCD e GDD em relação ao

grupo C. Os fluxos sanguíneos analisados nesse protocolo (coronariano,

pulmonar, renal e muscular) apresentaram-se reduzidos em todos os grupos

experimentais quando comparados ao GC. O grupo submetido à SAD

mostrou uma redução mais acentuada em todos os fluxos sanguíneos

estudados. A resistência vascular periférica total encontra-se aumentada em

todos os grupos analisados com um aumento maior nos grupos diabéticos.

O débito cardíaco mostrou-se reduzido em todos os grupos estudados, em

especial no grupo desnervado diabético, quando comparados com o GC.

Com relação ao índice cardíaco, também observamos uma redução em

todos os grupos, com uma redução maior nos grupos diabéticos sendo que a

desnervação não foi capaz de atenuar essa redução no grupo desnervado

diabético. A avaliação renal mostrou um aumento da pressão de perfusão do

GD, acompanhado por um aumento significativo na resistência vascular

renal, no fluxo urinário, no ritmo de filtração glomerular. Dessa forma, os

resultados obtidos no presente trabalho fornecem evidencias de que o papel

homeostático do baroreflexo é essencial no curso das alterações cardíacas e

renais tanto em animais normoglicêmicos como nos hiperglicêmicos, por sua

ação não só no controle das variações momento a momento (labilidade)

como também interferindo em alterações sustentadas da PA, como

observado nesse trabalho. Esses resultados poderão dar suporte a estudos

populacionais que associam maior sensibilidade do baroreflexo com melhor

prognóstico e sobrevida após evento cardiovascular em indivíduos

diabéticos.

Descritores: Diabetes mel itus, Desnervação sinoaórtica,Barorreflexo,

Cardiomiopatia, Nefropatia e Fluxo Sanguíneo.

ABSTRACT

Paulini J. Baroreceptor influence on the evolution of diabetic cardiomyopathy

and nephropathy in rats [thesis]. Sao Paulo: Faculty of Medicine, University

of São Paulo (Brazil); 2011. 154p.

It is wel documented the importance of autonomic dysfunction in

microvascular complications of diabetes. Additional y, new and consistent

evidence indicates that the reflex control of movement is control ed by the

baroreceptors could be an early prognostic marker in diabetes mel itus,

clinical and experimental. In this project, we tested the hypothesis that

baroreflex dysfunction interferes with the development of nephropathy and

diabetic cardiomyopathy by altering the autonomic modulation control ed by

the arterial baroreceptors on heart and blood vessels. We used male Wistar

rats (230 to 260g) were divided into four groups: control group (n = 9),

diabetic (GD, n = 11), denervated (GCD, n = 9) and diabetic denervated

(GDD, n = 8). After 7 days of sinoaortic denervation was performed we induced

diabetes (DM) by streptozotocin (STZ). We evaluated metabolic, glucose

tolerance test and echocardiographic evaluations during the third week of the

protocol. After 28 days of protocol records were taken direct blood pressure

(BP) and baroreflex sensitivity assessments of cardiovascular autonomic

(heart rate variability and systolic BP), regional blood flow analysis and

evaluations kidney ex vivo. Diabetic groups (GD and GDD) had higher blood

glucose and reduced body weight, blood pressure and heart rate when

compared with non-diabetic groups (GC and GCD). Diabetic groups showed

a larger response area under the glycemic response curve when compared

to control groups, thus indicating an increased glucose intolerance. The

morphometric parameters, interventricular septum (IVSD) was lower in both

diabetic groups compared to CG. The back wal of the left ventricle (PPDIA)

was reduced only in diabetic mice. Regarding the size of the cavity of the left

ventricle during diastole (Vedia), there was a tendency to increase in al

groups compared to control. The left ventricular mass (LVM) was lower in the

diabetic group compared to control, and higher in the groups submitted to

DSA when compared to CG.

Systolic function was evaluated by ejection fraction (EF), in which there was

no difference between groups. Diastolic function was evaluated by isovolumic

relaxation time (IVRT) was greater in the diabetic group compared to control.

The denervated group showed similar to the CG. However, the denervated

diabetic group showed lower values of IVRT as compared to diabetic animals

only. Autonomic dysfunction, as assessed by baroreflex sensitivity by HR

variability (HRV) and systolic (VPAS) were observed in groups GD, GCD and

GDD than in group C. The blood flows analyzed in this protocol (coronary,

pulmonary, kidney and muscle) were reduced in al experimental groups

compared to CG. The group submitted to SAD showed a marked reduction in

al blood flows studied. The total peripheral vascular resistance is increased

in al groups with a greater increase in the diabetic group. Cardiac output was

reduced in al groups, especial y in denervated diabetic group compared with

the GC. With respect to cardiac index, we also observed a reduction in al

groups, with a greater reduction in the diabetic group and that denervation

was not able to mitigate this reduction in denervated diabetic group. The

evaluation showed an increase in renal perfusion pressure of the GD,

accompanied by a significant increase in renal vascular resistance, urinary

flow, the glomerular filtration rate. Thus, the results obtained in this study

provide evidence that the homeostatic role of the baroreflex is essential in the

course of changes in both heart and kidney as in hyperglycemic animals

normoglycemic by acting not only in control of changes moment to moment

(lability) as wel as interfering with sustained changes in BP, as observed in

this study. These results could support population studies linking higher

sensitivity of the baroreflex with a better prognosis and survival after a

cardiovascular event in diabetic subjects.

Keywords: Diabetes mel itus, denervation sinoaórtica, Baroreflex,

cardiomyopathy, nephropathy and Blood Flow.

.

INTRODUÇÃO

_______________________________________________________________

1

1.

Introdução

1.1

Diabetes

Define-se diabetes mel itus (DM) como uma doença crônico-

degenerativa caracterizando-se por ser uma síndrome de etiologia múltipla,

decorrente da falta e/ou incapacidade da insulina exercer seus efeitos,

caracterizando-se por hiperglicemia crônica, com distúrbios do metabolismo

de carboidratos, lipídios e proteínas (Sociedade Brasileira de Diabetes,

2009).

De acordo com estimativas da Organização Mundial de Saúde (WHO,

2005), a prevalência mundial que foi de 4%, (135 milhões de portadores) em

1995, está projetada para, 5.4% no ano de 2025 (300 milhões de pessoas)

representando um aumento na incidência de 122% (King e cols., 1998). Só

nos países do continente americano a prevalência da população diabética

poderá chegar a 64 milhões até o ano de 2025. Enquanto que no Brasil,

estes números serão em torno de 11,6 milhões até a mesma data, sendo

atualmente o sexto país com maior incidência de casos no mundo (King e

cols., 1998).

Estes índices vêm crescendo em decorrência de vários fatores,

tais como processo de modernização, maior taxa de urbanização,

industrialização, hábitos alimentares inadequados, inatividade física,

obesidade, estresse, aumentos da expectativa de vida e maior sobrevida das

pessoas com diabetes (Zanetti, 1996; Tavares, 1997). Além desses fatores

2

que propiciam o aparecimento do diabetes, existem outros, talvez de cunho

sócio-econômico, que aumentam a morbi-mortalidade da doença. Na maioria

dos países aproximadamente 50% dos pacientes desconhecem sua doença,

por isso não se tratam e cerca de 20 a 30% dos que conhecem a doença,

não fazem nenhum tipo de tratamento (Malerbi & Franco, 1992). Geralmente

após a manifestação clínica de alguma de suas complicações crônicas, de

forma casual, 68% dos casos de diabetes são diagnosticados, fato pelo qual

cerca de dois terços da população de diabéticos correm o risco de

apresentarem tais complicações em virtude da demora no diagnóstico da

doença (Gagliardino et al., 2002).

O diabetes normalmente vem acompanhado de complicações

crônicas características, geralmente denominadas de doença microvascular

(específica do diabetes), doença macrovascular (aterosclerose com início

mais precoce no diabetes) e doença neuropática. Estas complicações

ocorrem tanto no diabetes tipo 1 como no diabetes tipo 2, embora com

algumas diferenças: a doença macrovascular é a maior causa de

morbimortalidade no diabetes tipo 2, provavelmente pela idade de início e

síndrome metabólica associada. A doença microvascular manifesta-se com

maior freqüência e intensidade no diabetes tipo 1, provavelmente pela maior

duração da doença e maior gravidade no quadro glicêmico (Duncan, 1996).

Vale ressaltar que a causa mais freqüente de mortalidade no diabetes é a

doença cardiovascular, sendo a principal responsável pelo pior prognóstico

nestes pacientes (Muir et al., 1992).

3

Estudos de Framingham demonstraram que a hiperglicemia diabética

dobra o risco de desenvolvimento de doenças cardiocirculatórias nos

homens e triplica nas mulheres (Muir et al., 1992). Além disso, os mesmo

autores demonstraram que indivíduos diabéticos apresentam maiores riscos

de lesões coronarianas, insuficiência cardíaca congestiva, infartos

recorrentes, arritmias e choque cardiogênico, quando comparados à

população não diabética.

As anormalidades vasculares que levam à nefropatia e à retinopatia

diabéticas são também identificadas na circulação sistêmica. Sendo assim, é

plausível que o desenvolvimento de alterações funcionais precoces, que por

sua vez conduzem à neuropatia diabética e à disfunção autonômica, seja em

parte resultante de anormalidades neurovasculares (Cameron & Cotter,

1994). De fato, o sistema nervoso periférico está freqüentemente

comprometido em pacientes diabéticos (Pickup & Wil iams, 1994).

A neuropatia diabética autonômica é uma importante e freqüente

complicação do diabetes e está associada à alta morbidade e mortalidade

em pacientes sintomáticos (Ewing et al., 1980, Vinik, 1992),. Entre suas

maiores manifestações clínicas encontram-se taquicardia de repouso,

intolerância ao exercício, hipotensão ortostática, constipação, gastroparesia,

disfunção erétil, função neurovascular alterada e insuficiência autonômica

hipoglicêmica. A neuropatia autonômica cardiovascular é a mais estudada e

clinicamente mais importante forma de neuropatia autonômica diabética. A

neuropatia autonômica cardiovascular resulta da lesão de fibras nervosas

autonômicas que inervam o coração e os vasos levando a anormalidades do

4

controle da frequência cardíaca e da dinâmica vascular. A redução da

variabilidade da frequência cardíaca é o mais precoce indicador de

neuropatia cardiovascular ( Ziegler D,1994, Fazan et al . , 1997).

O aumento da mortalidade associado à neuropatia autonômica

cardiovascular pode estar relacionado a alterações no controle

cardiovascular, incluindo atenuação do controle reflexo autonômico levando

à hipotensão ortostática, infarto do miocárdio não acompanhado de

sensação dolorosa e morte súbita (Page & Watkins, 1978), esta

possivelmente determinada por episódios de dessaturação (Neumann et al.,

1995) ou arritmias. Existem evidências de que a disfunção simpática

cardíaca no diabetes envolve áreas de desnervação (distal) tanto quanto

áreas de hiperinervação (proximal) do ventrículo esquerdo, o que facilitaria

as arritmias malignas por alterar a estabilidade elétrica e/ou comprometer o

fluxo sangüíneo miocárdico (Stevens et al., 1998).

Indivíduos diabéticos são mais predispostos à insuficiência cardíaca

congestiva, independentemente da presença de doença coronariana ou

hipertensão. Isto é possível pela presença da chamada cardiomiopatia

diabética, evidenciada por estudos experimentais, clínicos, patológicos e

epidemiológicos. A cardiomiopatia diabética provoca mudanças estruturais e

funcionais em indivíduos diabéticos. Cerca de 60% destes pacientes,

normotensos, têm disfunção sistólica, diastólica e redução do consumo

máximo de oxigênio (VO2 máx.) (Zaslavsky et al., 2005; Brandemburg et al.,

1999).

5

Modelos experimentais pelo uso de agentes diabetogênicos como

a estreptozotocina (STZ) e o aloxano têm sido usados na indução do

diabetes experimental em ratos, tendo se demonstrado eficiente no

estudo das alterações da função ventricular esquerda (Wichi et al., 2007;

Borges et al., 2006), bem como do sistema nervoso autonômico (Junod et

al . , 1969; Vadlamudi & McNeil , 1983). As várias complicações crônicas

micro e macrovasculares, além dos desequilíbrios hidroeletrolítico e da

homeostase, estão presentes também no diabetes experimental (Schaan

e cols, 2001). Ratos tratados com estreptozotocina desenvolvem quadro

de polidipsia, maior volume extracelular (Ilstrup e cols., 1981) e urinário,

refletindo a diurese osmótica provocada pela hiperglicemia (Junod e cols.,

1969), além de microalbuminúria (Schaan e cols, 2001). Estudos do

nosso grupo têm demonstrado que o diabetes induzido por STZ produz

bradicardia e alteração de reflexos cardiovasculares (Dal 'Ago e cols.,

1997; De Angelis e cols., 2000; Maeda e cols., 1995; Oliveira e cols.,

1997; Schaan e cols., 2004; De Angelis e cols., 2009). Tais alterações

ocorrem precocemente 5 dias após a administração de STZ (Maeda e

cols., 1995) e persistem por períodos de, pelo menos, até 80 dias (De

Angelis e cols., 2000).

Embora seja um modelo de deficiência de insulina, muitos animais

sobrevivem sem sua administração por longos períodos (Fazan et al . , 1997),

permitindo o estudo das complicações do diabetes não controlado. Dessa

forma, o diabetes experimental induzido por estreptozotocina , tem sido

6

usado por vários investigadores na busca de melhor compreensão das

alterações da cardiomiopatia diabética e do controle autonômico.

Os diabéticos têm alto risco para a doença macrovascular (doença

cardiovascular, 3 a 4 vezes, e cerebrovascular, 2 a 3 vezes), e esta é sua

principal causa de morte (Kannel & Mc Gee, 1979). Diversos fatores de risco

passíveis de intervenção, como a nefropatia diabética e hipertensão arterial

sistêmica estão associados ao maior comprometimento cardiovascular

observado nesses pacientes diabéticos.

1.2

Nefropatia Diabética

A nefropatia diabética é uma complicação que acomete cerca de 30%

a 40% dos pacientes, está associada a um aumento da mortalidade e evolui

inexoravelmente para a perda progressiva de função renal, necessitando o

uso de medidas de reposição da função renal através de hemodiálise e de

transplante (Ritz e cols., 1999).

A doença renal no diabético pode se desenvolver lenta ou

rapidamente, levando o paciente à insuficiência renal crônica. O declínio

funcional do rim dos diabéticos pela nefropatia é previsível e progressivo.

Depois de instalada a nefropatia, a perda mensal da função renal varia de

0,5-1%.

Existem evidências de que fatores genéticos e ambientais corroborem

para o aparecimento da nefropatia diabética.

7

A nefropatia é resultado de uma somatória de fatores hemodinâmicos

e metabólicos sobre a microcirculação renal, que culminam com a esclerose

glomerular. Os fatores hemodinâmicos exercem um papel-chave na gênese

da lesão renal, através de anormalidades na hemodinâmica intraglomerular,

dos efeitos deletérios da hipertensão arterial sistêmica e via produção renal

de citocinas. Igualmente importantes, são as conseqüências metabólicas da

hiperglicemia, que por diversos mecanismos, induzem lesões renais

(Zanel a, 2006).

A doença renal do diabetes melitus não-controlado pode evoluir quase

sempre com esclerose glomerular e atrofia tubular, com perda total de

função renal, levando o paciente à diálise ou ao transplante renal (Bruno &

Gross, 2000, Lagranha e cols, 2007). Segundo Zanel a (2006), durante a

evolução da doença, um número progressivamente menor de néfrons segue

funcionando adequadamente. Na teoria mais consistente, os glomérulos dos

néfrons ainda funcionantes sofreriam um processo de hipertrofia devido à

hiperperfusão conseqüente, à redução do leito capilar glomerular total e a

vasodilatação de suas arteríolas aferentes. Essa hiperperfusão levaria à uma

hipertensão glomerular, com conseqüente hiperfiltração glomerular e a lesão

das estruturas glomerulares. Essas alterações funcionais e morfológicas

determinam o aparecimento de proteinúria, sendo esse intenso tráfico de

proteínas lesivo às estruturas tubulares (tanto por seu próprio metabolismo,

como por suas substâncias agregadas).

8

Diversos fatores de risco têm sido descritos para a nefropatia

diabética, entre eles, o grau de hiperglicemia, a duração do diabetes, a

presença de hipertensão arterial, fatores genéticos, entre outros (Ritz e cols.,

1999); neste sentido, marcadores de nefropatia diabética estão sendo

enfaticamente procurados e a presença de microalbuminúria é um dos

fatores predisponentes mais estudados. A presença de microalbuminúria

está associada, de mesma forma, aos fatores de risco da nefropatia

diabética, à resistência insulínica e à síndrome metabólica (Isomaa e cols.,

2001).

O aumento da taxa de filtração glomerular (TFG) tem sido um achado

freqüente no diabetes (Al en e cols., 1997; Bank e cols., 1993; Komers e

cols., 1994; Komers e cols., 1996; Tolins e cols., 1993; Tomlinson e cols.,

1992) que, em longo prazo, pode responder pela perda progressiva de

função renal atribuída a hiperfiltração (De Angelis e cols., 2002) e,

conseqüente, nefroesclerose (D'Agord e cols., 2001). O mecanismo proposto

para explicar o aumento da TFG no diabetes não está totalmente

esclarecido. Mas a maior parte dos trabalhos sugere a hipótese de

alterações hemodinâmicas glomerulares, mediadas por modificações de

sistemas hormonais intra-renais (Al en e cols., 1997). Além disso, alterações

de tônus neurogênico periférico sobre o rim, especialmente aquelas

moduladas pelo barorreflexo podem estar contribuindo para este achado,

embora não existam informações sobre isso na literatura.

9

1.3

Cardiomiopatia Diabética

A cardiomiopatia diabética é vista, atualmente, como resultado de

complexas relações entre anormalidades metabólicas que acompanham o

diabetes e suas conseqüências moleculares, levando a alteração da

estrutura e função miocárdica (Poornima et al., 2006).

Estudos experimentais sobre a função miocárdica em ratos diabéticos

por estreptozotocina mostraram insuficiência ventricular em corações

isolados perfundidos de animais expostos à isquemia por 48 horas, havendo

um acúmulo intracelular de metabólitos, aumento da oxidação de ácidos

graxos e um efeito tóxico nos sistemas enzimáticos intracelulares. O fato de

o tratamento agudo com insulina reverter às anormalidades induzidas pelo

diabetes leva a crer num fator metabólico como causa das alterações

funcionais da célula miocárdica no DM, (Gotzsche, 1986). Além disso, em

nosso laboratório foi detectado prejuízo na função ventricular “in vivo” (Wichi

et al., 2004) e no coração isolado (De Angelis et al., 2000) de ratos

diabéticos

Resultados recentes sobre o curso temporal das alterações cardíacas

avaliadas pelo ecocardiograma em nosso laboratório mostraram que 30 dias

após a administração de STZ, existe comprometimento da função e da

estrutura cardíaca. (Malfitano et al, 2004). Nesse estudo, a dilatação do

ventrículo esquerdo (VE) foi acompanhada de redução da espessura da

parede posterior do VE e do septo interventricular, indicando redução da

massa do VE, dados que corroboram os achados de Dobrzynki et al. que

10

observaram redução do peso do coração e da massa do VE associados a

disfunção cardíaca e renal 21 dias após a administração de STZ.

Os mecanismos envolvidos nestas disfunções ainda não estão

perfeitamente esclarecidos, mas existem evidências consistentes do

envolvimento de alterações na freqüência cardíaca intrínseca, no tônus

vagal e no controle reflexo de freqüência cardíaca (barorreflexo e

quimioreflexo) neste prejuízo cardiovascular (De Angelis et al. 2002).

1.4

Controle Da Pressão Arterial

A perfusão tecidual adequada é garantida pela manutenção da força

motriz da circulação - a pressão sanguínea - em níveis adequados e

razoavelmente constantes, esteja o indivíduo em repouso ou desenvolvendo

diferentes atividades. A pressão, definida como força/unidade de área, é

uma entidade física. A pressão arterial (PA), portanto, dependem de fatores

físicos como o volume sangüíneo e a capacitância da circulação, sendo

resultante da combinação instantânea entre o volume minuto cardíaco (ou

débito cardíaco = freqüência cardíaca x volume sistólico), a resistência

periférica e a capacitância venosa, que condiciona a pré-carga e, portanto, o

volume sistólico. Cada um destes determinantes primários da PA é por sua

vez determinado por uma série de fatores (Michelini, 1999; Kaplan, 1998). A

manutenção (componente tônico), bem como a variação momento a

momento da PA (componente fásico) dependem de mecanismos complexos

e redundantes que determinam ajustes apropriados da freqüência e

11

contratilidade cardíacas, do estado contrátil dos vasos de resistência e de

capacitância e da distribuição de fluído dentro e fora dos vasos. A variação

do tônus vascular depende de diferentes fatores funcionais. Dentre eles,

destaca-se a atividade simpática gerada centralmente e modulada por

aferências de diferentes reflexos e por substâncias vasopressoras ou

vasodepressoras circulantes ou produzidas pelas células da musculatura lisa

ou endoteliais. Um considerável número de evidências dá suporte ao

aumento da atividade simpática precocemente na hipertensão (Dequattro e

Feng, 2002; Irigoyen e cols., 2001). Sabe-se que embora muitos reflexos

estejam envolvidos na modulação da atividade simpática, os barorreceptores

arteriais (alta pressão) são considerados o mais importante mecanismo de

controle reflexo da PA, momento a momento. A deformação da parede dos

vasos induzida por aumentos da PA gera potenciais de ação que são

conduzidos ao núcleo do trato solitário (NTS), no sistema nervoso central. A

partir daí, são produzidas respostas de aumento da atividade vagal e queda

da freqüência cardíaca bem como de redução da atividade simpática para o

coração e os vasos, contribuindo para a bradicardia, reduzindo a

contratilidade cardíaca e a resistência vascular periférica e aumentando a

capacitância venosa. A menor sensibilidade dos barorreceptores é

provavelmente o maior determinante do aumento da variabilidade da PA

(Irigoyen e Krieger, 1998; Floras e cols., 1988) associada às conseqüentes

lesões dos órgãos-alvo (Floras e cols., 1988). O controle reflexo da

circulação comandado pelos baroreceptores tem sido reconhecido também

como um importante preditor de risco após evento cardiovascular. De fato, o

12

estudo ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction)

forneceu evidências clínicas do valor prognóstico da sensibilidade do

barorreflexo e da variabilidade da freqüência cardíaca na mortalidade

cardíaca pós infarto do miocárdio, independente da fração de ejeção do

ventrículo esquerdo e de arritmias ventriculares (La Rovere e cols., 1998).

Dessa forma, intervenções no sentido de melhorar a sensibilidade do

barorreflexo e/ou a participação do parassimpático cardíaco no controle da

PA e da freqüência cardíaca têm sido vistas como novas estratégias no

manejo das doenças cardiovasculares (La Rovere e cols., 2002).

Embora exista consenso de que no diabetes clínico e experimental

ocorre prejuízo do controle reflexo da circulação (De Angelis et al, 2000;

Loimaala, 2003), não existem dados sobre a contribuição da função

barorreflexa sobre a evolução temporal da cardiomiopatia diabética.

1.5

Desnervação Sino-Aórtica

A manutenção da pressão arterial (PA) envolve um controle rígido

mediado tanto por mecanismos periféricos quanto centrais.

O tamponamento das flutuações da PA evitando alterações na

perfusão tecidual é uma das mais importantes funções dos reflexos

comandados pelos barorreceptores. Os pressorreceptores aórticos e

carotídeos constituem-se em terminações nervosas livres na parede do vaso

e é considerado o mais importante mecanismo de controle momento-a-

momento da pressão arterial (PA) (Krieger e Michelini,1992). A comprovação

13

da ação inibitória dos pressorreceptores sobre a atividade simpática é dada

pelo efeito hipertensor agudo após sua a retirada. A secção cirúrgica das

fibras aferentes dos pressorreceptores é denominada desnervação sino-

aórtica (DSA) e foi descrita no rato por Krieger (1964). A DSA leva a uma

conseqüente ativação de vias simpáticas principalmente para coração, rins e

vasos de resistência, provocando elevação da PA e aumento de sua

labilidade (Krieger, 1970, 1984).

Na fase inicial da DSA, o aumento da atividade simpática e da PA é

predominante (Irigoyen e cols. 1988); já na fase crônica, a normalização da

PA e atividade nervosa simpática renal reflete o balanço entre efeitos

opostos entre presso e quimiorreceptores (Irigoyen e cols. 1995). Uma

característica importante deste modelo é o aumento da labilidade da

pressão, que se mantém mesmo após a normalização desta (Barres e cols.,

1992).

No início da década de 1980, Friberg e colaboradores (1982)

demonstraram que a variabilidade da PA (VPA) estava aumentada em ratos

espontaneamente hipertensos (SHR), se comparados a linhagens de ratos

normotensos. No ano seguinte, Mancia e colaboradores (1983), estudando

grupos de pacientes normotensos, com hipertensão moderada e hipertensão

severa, demonstrou que havia um aumento da VPA quanto mais grave a

hipertensão. Estes e outros estudos abriram caminho para o uso de um

modelo de alta VPA e sem hipertensão, consistindo na DSA crônica (Su e

Miao, 2001), mesmo considerando a demonstração de que a DSA induz

alterações estruturais cardiovasculares, incluindo hipertrofia do coração e

14

hipertrofia vascular (Su e Miao, 2001; Van Vliet e cols., 1996). De fato, nesse

trabalho, Van Vilet et al, demonstraram que a desnervação carotídea

bilateral causava hipertrofia ventricular direita, enquanto a desnervação

aórtica e/ou sino-aórtica levava à hipertrofia ventricular esquerda, todas

essas alterações independentes de um aumento na pressão arterial. Dados

de nosso laboratório não publicados, entretanto, através da avaliação

ecocardiográfica, não identificaram alterações morfométricas em ratos, 26

dias após a desnervação sino-aórtica (DSA), embora esse tipo de alteração

tenha sido observado em outros tempos de desnervação. (Da Silva ICM et

al, 2010; Mostarda et al, 2010). Além disso, dados anteriores de nosso

laboratório (Oliveira et al, 1992) não mostraram diferenças dos efeitos da

DSA em ratos normais ou diabéticos por STZ. É sabido, entretanto, que a

DSA produz aumento da atividade simpática periférica e labilidade da PA

agudamente, e mantém a labilidade da PA na fase crônica (20 dias ou mais)

(Irigoyen et al, 1995).

Considerando que dois dos principais marcadores da atividade do

sistema nervoso autônomo são: a sensibilidade do barorreflexo e a

variabilidade da freqüência cardíaca, bem como o fato de que a disfunção

autonômica está associada com um aumento da mortalidade, especialmente

em diabéticos, hipertensos e sujeitos com história de doença cardiovascular

(Gerritsen et al, 2001) e, além disso, considerando a escassa informação

disponível na literatura sobre a evolução das lesões cardíacas e renais do

diabetes e sua relação com a modulação autonômica do coração e da

circulação, no presente projeto testamos a hipótese de que a desnervação

15

sino-aórtica crônica, por alterar a modulação autonômica periférica

comandada pelos pressorreceptores arteriais, modifica o desenvolvimento

da nefropatia e cardiomiopatia diabéticas avaliadas 21 dias após a

administração de STZ.

.

OBJETIVOS

_________________________________________________________

16

2. Objetivo

Avaliar a influência da integridade dos pressorreceptores nos

parâmetros cardiovasculares e na função renal no diabetes experimental

com 21 dias de duração.

2.1 Objetivos Específicos