Interações entre bactérias láticas produtoras de bacteriocinas e a microbiota autóctone de charque por Vanessa Biscola - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Ciências dos Alimentos

Área de Bromatologia

Interações entre bactérias láticas produtoras de bacteriocinas e a

microbiota autóctone de charque

Vanessa Bíscola

VERSÃO CORRIGIDA

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientadora:

Profª. Drª. Bernadette D. G. M. Franco

São Paulo

2011

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Vanessa Biscola

Interações entre bactérias láticas produtoras de bacteriocinas e a

microbiota autóctone de charque

Comissão Julgadora

da

Tese para obtenção do grau de Doutor

Profa. Dra. Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco

orientador/presidente

____________________________

1o. examinador

____________________________

2o. examinador

____________________________

3o. examinador

____________________________

4o. examinador

São Paulo, 14de outubro de 2011.

A Deus, pelo dom da vida e presença constante.

Aos meus pais, Fátima Regina e Antonio, por todo

apoio, compreensão e amor. Por terem acreditado

sempre, tornando este momento possível.

À minha irmã, Cintia, por ser parte da minha vida e

estar sempre ao meu lado.

A Dra. Hikmate Abriouel, no sólo por compartir sus

conocimientos

científicos,

sino

también

por

enseñarme lecciones para toda la vida.

À Profª Titular Bernadette Dora Gombossy de Melo

Franco, a quem passei a admirar não apenas pelo

grande conhecimento e competência profissional,

mas também pela sincera grandeza de caráter.

Agradecimentos

À Profª Drª Bernadette D.G.M. Franco, pela amizade, orientação, paciência, apoio e oportunidade

de aprendizado.

Al prof Dr. Antonio Gálvez Del Postigo Ruiz, por la recepcción amable y por la gran oportunidad

del crecimiento profesional.

Al Dr. Nabil Ben Omar, por su estímulo y amistad.

A Dra. Elena Ortega Morente, a Dra. Magdalena Martínez Cañamero y a Dra. Rosario Lucas

López, por el apoyo y por la agradable convivencia.

Às Profª Drª Mariza Landgraf e Profª Drª Maria Teresa Destro pelo apoio e convívio.

Ao Prof. Dr. Luiz Augusto Nero, pelas sugestões feitas no exame de qualificação.

À Drª Martha Villareal, pelas sugestões feitas no exame de qualificação.

À Profª. Drª. Mariza Landgraf, pelas sugestões feitas no exame de qualificação.

À Verena Sant’Anna Cabral Capuano, pela amizade e por toda ajuda prestada na realização deste

trabalho.

Aos colegas do laboratório de microbiologia de alimentos: Adriana, Ana Carolina, Anderson,

Aline, Haissa, Isabela, Janaína, Maria Crystina, Maria Fernanda, Matheus, Patrícia, Priscila A.,

Priscila C., Rafael, Rita, Slavi e Vinicius, pelo companheirismo e troca de conhecimentos.

Ao grande amigo, Adriano Andreghetto, por fazer parte da minha vida.

Às irmãs que a vida colocou no meu caminho Ana Eucares, Ângela, Cecília, Kátia Leani e

Tatiana, por sempre terem estado ao meu lado.

Ao Amigo André Otuki, por todos os momentos de alegria, companheirismo e troca de

conhecimentos.

Às companheiras de apê Érica e Patrícia, pelos ótimos momentos desfrutados nos últimos quatro

anos.

A los compañeros de laboratório y cerveza, Antonio Sánchez, Juanma, Leire, Marina, Miguel

Ángel, Natacha, Rubén, Wendy y Zouzouni por toda la ayuda, amistad e intercambio de

conocimientos, lo que siempre me hace querer volver pronto.

À auxiliar de laboratório Lucia, pelo convívio agradável e por sempre estar disposta a ajudar.

À Cleonice, à Essy e à Mônica da secretaria do departamento, pela atenção dedicada e serviços

prestados.

Ao Edílson, ao Jorge e à Elaine, da secretaria de Pós-Graduação, pela atenção dedicada e serviços

prestados.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão de

bolsa de estudos.

À empresa Kienast & Kratschmer Ltda., pela disponibilização da planta piloto para a elaboração

das amostras de charque utilizadas neste trabalho.

À empresa Charque 500 Ltda., pela doação das amostras de charque utilizadas para o isolamento

dos micro-organismos utilizados neste trabalho.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para este trabalho de pesquisa.

i

SUMÁRIO

pg.

SUMÁRIO.......................................................................................................................

i

LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................

iv

LISTA DE TABELAS....................................................................................................

vi

RESUMO.........................................................................................................................

viii

ABSTRACT.....................................................................................................................

ix

1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................

1

1.1 Charque.................................................................................................................

1

1.2 Fermentação de produtos cárneos.........................................................................

2

1.3 Bioconservação de produtos cárneos....................................................................

4

1.3.1 Bacteriocinas da classe I.................................................................................

7

1.3.1.1 Nisina........................................................................................................

7

1.3.2 Bacteriocinas produzidas por bactérias láticas isoladas de produtos cárneos...

13

1.4 Ecologia microbiana em productos cárneos fermentados.....................................

16

2. OBJETIVOS................................................................................................................

19

3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................

20

3.1 Amostras de charque.............................................................................................

20

3.2 Obtenção dos micro-organismos utilizados neste estudo.........................

20

ii

3.2.1 Isolamento de bactérias halotolerantes a partir de charque.............................

20

3.2.2 Identificação das bactérias halotolerantes isoladas do charque......................

21

3.2.3 Isolamento das bactérias láticas potencialmente produtoras de bacteriocinas

a partir de charque.................................................................................................

23

3.3 Seleção dos isolados com atividade bacteriocinogênica.......................................

23

3.3.1 Confirmação da atividade antimicrobiana......................................................

24

3.3.2 Sensibilidade das substâncias inibidoras produzidas a tratamento com

enzimas proteolíticas, pH, agentes químicos e calor.......................................

24

3.3.3 Espectro de atividade......................................................................................

25

3.3.4 Multiplicação e sobrevivência do isolado 69 em diferentes concentrações

de NaCl...........................................................................................................

26

3.3.5 Produção e atividade de bacteriocinas em meio líquido MRS contendo

concentração de NaCl similar a do charque (20%).........................................

26

3.4 Identificação da cepa bacteriocinogênica isolada (isolado 69).............................

27

3.5 Investigação da presença de genes codificadores para bacteriocinas produzidas

por L. lactis no isolado 69.....................................................................................

28

3.6 Avaliação do potencial bioconservante da cepa bacteriocinogênica (isolado 69)

no charque modelo................................................................................................

30

3.6.1 Preparo dos cultivos de bactérias halotolerantes para inoculação no charque

modelo.............................................................................................................

30

3.6.2 Preparo do charque modelo.............................................................................

30

3.6.3 Avaliação microbiológica...............................................................................

32

3.6.3.1 Enumeração de bactérias halotolerantes...................................................

33

iii

3.6.3.2 Enumeração de bactérias láticas................................................................

33

3.6.4 Análise estatística............................................................................................

33

3.7 Avaliação da ecologia microbiana do charque modelo.........................................

34

3.7.1 Isolamento dos micro-organismos presentes no charque modelo nas

diferentes etapas de sua produção...................................................................

34

3.7.2 Extração do DNA............................................................................................

34

3.7.3 Amplificação da região hipervariável V3 da porção 16S de rDNA...............

35

3.7.4 Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)..............................

36

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................

38

4.1 Identificação das bactérias halotolerantes isoladas a partir de charque................

38

4.2 Obtenção e caracterização da cepa bacteriocinogênica a ser aplicada ao

charque modelo.....................................................................................................

41

4.3 Identificação da cepa bacteriocinogênica isolada.................................................

51

4.4 Investigação da presença de genes codificadores para bacteriocinas produzidas

por L. Lactis no isolado 69....................................................................................

53

4.5 Avaliação do potencial bioconservante da cepa bacteriocinogênica no charque

modelo...................................................................................................................

56

5. CONCLUSÕES...........................................................................................................

66

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................

67

iv

LISTA DE FIGURAS

pg.

Figura 1.

Estrutura primária das variantes naturais de nisina: A, Z, Q e U................ 9

Figura 2.

Modelo de formação de poros na membrana, mediada por interações com o

lipídeo II, proposto por Chatterjee et al. (2005).................................................... 11

Figura 3.

Fluxograma de processamento do charque modelo, adaptado de Torres et

al. (1994)..................................................................................................... 31

Figura 4.

Eletroforese em gel de agarose 2% (p/v) dos fragmentos de DNA das

cepas medianamente halotolerantes e altamente halotolerantes, isoladas

de charque, amplificados na PCR-multiplex com os primers

tag765/Tstag422, Sap1/Sap2, XylF/XylR e Sa422-1/Sa422-2................... 40

Figura 5.

Representação gráfica da curva de multiplicação do isolado 69 a 30ºC

em caldo MRS contendo 0%, 3% e 5% de NaCl........................................ 50

Figura 6.

Representação gráfica da curva de multiplicação do isolado 69 a 30ºC

em caldo MRS contendo 10%, 15% e 20% de NaCl.................................. 50

Figura 7.

Sequência completa de nucleotídeos da porção 16S de rDNA da cepa

Lactococcus lactis subsp. lactis 69............................................................. 52

Figura 8.

Eletroforese em gel de agarose 2% (p/v) dos fragmentos de DNA da

cepa L. lactis subsp. lactis 69 amplificados com os primers sub-espécie-

específicos gadB21 e GAD7....................................................................... 52

Figura 9.

Eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) dos fragmentos de DNA da

cepa L. lactis subsp. lactis 69 amplificados com primers para o gene

codificador de nisina................................................................................... 53

Figura 10.

Média das populações de bactérias medianamente halotolerantes

encontradas nos charques modelo controle e teste nas diferentes etapas

do processamento e armazenamento por até 45 dias................................... 57

Figura 11.

Média das populações de bactérias altamente halotolerantes encontradas

nos charques modelo controle e teste nas diferentes etapas do

processamento e armazenamento por até 45 dias........................................ 57

Figura 12.

Média das populações de bactérias láticas encontradas nos charques

modelo controle e teste nas diferentes etapas do processamento e

armazenamento por até 45 dias. Letras minúsculas distintas, para um

mesmo ponto de análise, indicam diferença estatística entre as contagens

observadas (p≤0,05).................................................................................... 60

v

Figura 13.

Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (poliacrilamida 0,8%

p/v) dos amplicons da região V3 de 16S rDNA da microbiota presente

em amostras de charque modelo fermentado de maneira natural ou com

adição de cultura bacteriocinogênica.......................................................... 63

vi

LISTA DE TABELAS

pg.

Tabela 1.

Principais diferenças entre bacteriocinas e antibióticos, adaptado de

Cleveland et al. (2001)................................................................................ 5

Tabela 2.

Exemplos de bacteriocinas produzidas por bactérias láticas isoladas de

produtos cárneos, adaptado de Castellano et al. (2008).................................... 14

Tabela 3.

Potencial de aplicação de bacteriocinas em produtos cárneos, adaptado

de Gálvez et al. (2008)................................................................................ 15

Tabela 4.

Primers utilizados na PCR-multiplex para confirmação da identificação

das cepas halotolerantes.............................................................................. 22

Tabela 5.

Primers empregados na pesquisa de genes codificadores de lactocinas e

outras bacteriocinas produzidas por Lactococcus lactis subsp lactis no

isolado 69.................................................................................................... 29

Tabela 6.

Identificação, através de sequenciamento da porção 16S de rDNA, dos

micro-organismos

medianamente

halotolerantes

e

altamente

halotolerantes isolados de charque ............................................................. 38

Tabela 7.

Sensibilidade das substâncias antimicrobianas presentes no SLC das

bactérias láticas isoladas de charque à pepsina e à protease....................... 42

Tabela 8.

Sensibilidade das substâncias antimicrobianas presentes no SLC das

bactérias láticas isoladas de charque a diferentes valores de pH................ 42

Tabela 9.

Sensibilidade das substâncias antimicrobianas presentes no SLC das

bactérias láticas isoladas de charque a agentes químicos............................ 42

Tabela 10.

Sensibilidade das substâncias antimicrobianas presentes no SLC das

bactérias láticas isoladas de charque ao tratamento térmico a 37ºC, 45ºC,

60ºC, 80ºC e 100ºC..................................................................................... 44

Tabela 11.

Atividade inibitória das bacteriocinas presentes no SLC dos isolados 69

e 94 contra bactérias halotolerantes isoladas de charque............................ 46

Tabela 12.

Atividade inibitória das bacteriocinas presentes no SLC dos isolados 69

e 94 contra micro-organismos patogênicos e deteriorantes de importância

em alimentos............................................................................................... 48

Tabela 13.

Atividade inibitória das bacteriocinas presentes no SLC dos isolados 69

e 94 contra bactérias láticas isoladas de alimentos.....................................

49

vii

Tabela 14.

Comparação das sequências de nucleotídeos obtidas para o gene

codificador de nisina presente nas cepas Lactococcus lactis subsp. lactis

69, Lactococcus lactis subsp. lactis MS27, Lactococcus lactis subsp.

lactis K213 e Lactococcus lactis subsp. lactis M78.................................. 54

Comparação da cadeia de aminoácidos obtida após a transcrição da

Tabela 15.

sequência de nucleotídeos do gene codificador de nisina presente na cepa

Lactococcus lactis subsp. lactis 69 com as cadeias de aminoácidos

descritas para as nisinas produzidas pelas cepas Lactococcus lactis

subsp. lactis MS27, Lactococcus lactis subsp. lactis K213 e Lactococcus

lactis subsp. lactis M78............................................................................... 55

viii

Resumo

O charque é um produto cárneo tipicamente brasileiro, salgado e seco ao sol, ainda

produzido de maneira artesanal. Durante sua produção há uma etapa de fermentação, realizada

pela microbiota naturalmente presente na matéria-prima, o que dificulta a padronização do

produto, e pode influenciar negativamente em suas características sensoriais e qualidade

microbiológica. O controle da etapa de fermentação do charque seria uma alternativa para

minimizar este problema e, neste contexto, as bactérias láticas produtoras de bacteriocinas se

enquadram de forma interessante. A microbiota autóctone de charque inclui principalmente

bactérias láticas e micro-organismos halofílicos e halotolerantes, sendo assim, este produto

apresenta potencial como fonte para o isolamento de novas bactérias láticas produtoras de

bacteriocinas. Assim, este trabalho teve por objetivo isolar e identificar culturas de bactérias

láticas produtoras de bacteriocinas naturalmente presentes no charque, caracterizar parcialmente

as bacteriocinas produzidas por essas culturas, avaliar seu potencial de aplicação neste produto

para a melhoria de sua qualidade microbiológica e avaliar seu efeito na ecologia microbiana do

charque, nas diferentes etapas de sua fabricação. Através da técnica de tripla camada em ágar foi

isolada uma cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis apresentando o gene codificador para nisina

Z e com capacidade de inibir, in vitro, micro-organismos medianamente e altamente

halotolerantes isolados de charque, além de outros micro-organismos deteriorantes e patogênicos

importantes em alimentos, como Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes e Staphylococcus

aureus. A bacteriocina produzida pela cepa isolada neste estudo também possui características

interessantes para sua aplicação na bioconservação de alimentos, como resistencia ao calor,

presença de agente químicos e altos teores de NaCl, além de não ser afetada pelo pH. A aplicação

dessa cepa em charque modelo resultou na redução de até 2 ciclos log na população de micro-

organismos halotolerantes, indicando apresentar um potencial de aplicação como agente de

bioconservação do produto. Os ensaios de avaliação da ecologia microbiana, empregando DGGE,

indicaram que a fermentação natural do charque ocorreu com a participação de bactérias láticas

dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e de micro-organismos halotolerantes do

gênero Staphylococcus. Além disso, os estudos referentes à dinâmica populacional demonstraram

que a adição da cepa bacteriocinogênica ao charque não influenciou, de forma qualitativa, as

populações presentes no produto.

Palavras-chave: charque; bioconservação; bactérias láticas; bacteriocinas; 16S rDNA; DGGE.

ix

Abstract

Charqui is a Brazilian traditional meat product, salted and sun-dried, still manufactured

without control of the fermentation step, which is performed by the indigenous microbiota. This

fact interferes on the standardization of the product and can negatively affect the sensorial

properties and microbiological quality. The application of a known microbiota would be an

alternative to minimize this problem and the bacteriocin-producing lactic acid bacteria can can fit

in this purpose. The charqui indigenous microbiota mainly includes lactic acid bactéria and

halophilic and halotolerant microorganisms, therefore, this product presents a potencial as a

source for the isolation of new bacteriocin-producing lactic acid bacteria. The aim of the present

work was to isolate and identify bacteriocin-producing lactic acid bacteria from charqui,

characterize the bacteriocins produced by the isolated culture, evaluate its potential as

biopreservative in charqui and its influence on the microbial populations during the manufacture

of the product. A bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis strain was isolated from

charqui through the triple-layer agar technique. This strain produces a nisin-like bacteriocin

capable to inhibit in vitro medium and highly halotolerant bacteria isolated from charqui and

other food-borne pathogenic and spoilage microorganisms. The application of this strain for

charqui manufacturing caused a reduction of up to 2 log in the halotolerant bacteria population,

evidencing its potential application for charqui biopreservation. Studies in the populational

dynamics using DGGE indicated that the presence of the bacteriocinogenic strain did not affect

the microbial populations in the product.

Keywords: charqui, biopreservation; lactic acid bacteria, bacteriocins, 16S rDNA; DGGE.

Introdução

1

___________________________________________________________________________

1. Introdução