Interferência da moxidectina na motivação sexual e ereção peniana de ratos: envolvimento de... por Patricia de Sa e Benevides Rodrigues Alves - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE PSICOLOGIA

PATRICIA DE SÁ E BENEVIDES RODRIGUES ALVES

INTERFERÊNCIA DA MOXIDECTINA NA MOTIVAÇÃO SEXUAL

E EREÇÃO PENIANA DE RATOS: ENVOLVIMENTO DE

NEUROTRANSMISSORES HIPOTALÂMICOS E ESTRIATAIS.

São Paulo

2007

PATRICIA DE SÁ E BENEVIDES RODRIGUES ALVES

Interferência da moxidectina na motivação sexual e ereção peniana de ratos: envolvimento de neurotransmissores hipotalâmicos e estriatais.

Tese apresentada ao Instituto de Psicologia da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor

Área de Concentração: Neurociências e Comportamento

Orientadora: Profª. Dra. Helenice de Souza Spinosa

São Paulo

2007

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na publicação

Serviço de Biblioteca e Documentação

Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo

Rodrigues Alves, Patricia de Sá e Benevides.

Interferência da moxidectina na motivação sexual e ereção peniana de ratos: envolvimento de neurotransmissores hipotalâmicos e

estriatais / Patricia de Sá e Benevides Rodrigues Alves; orientadora Helenice de Souza Spinosa. -- São Paulo, 2007.

72 p.

Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Psicologia.

Área de Concentração: Neurociências e Comportamento) – Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo.

1. Moxidectina 2. Gaba 3. Motivação sexual (animal) 4.

Ereção peniana 5. Neurotransmissores 6. Ratos I. Título.

RM412

FICHA DE APROVAÇÃO

Patricia de Sá e Benevides Rodrigues Alves

Interferência da moxidectina na motivação sexual e ereção peniana de ratos: envolvimento de neurotransmissores hipotalâmicos e estriatais.

Tese apresentada ao Instituto de Psicologia da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor.

Área de Concentração: Neurociências e Comportamento

Aprovada em:__________________________

Banca Examinadora

Prof.Dr. ____________________________________________________________________

Instituição_________________________________Assinatura_________________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________________

Instituição_________________________________Assinatura_________________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________________

Instituição_________________________________Assinatura_________________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________________

Instituição_________________________________Assinatura_________________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________________

Instituição_________________________________Assinatura_________________________

“What you do make a difference and you have to decide

What kind of difference you want to make”

JANE GOODALL

Aos meus pais, Adélia e Marcello,

com amor, admiração e gratidão

por seu incansável apoio ao longo da minha vida.

Homenagem

Ao meu tio Sérgio José de Sá e Benevides,

sempre presente em minha lembrança

AGRADECIMENTOS

À minha filha Dora, pela ajuda e incentivo, desculpe pelos momentos que deixamos de compartilhar.

Ao meu marido, José Eduardo, pelo apoio e por sua compreensão da importância deste trabalho.

À Profª. Helenice de Souza Spinosa, pela atenção e apoio durante o processo de orientação, obrigada por esta oportunidade.

À Profª. Maria Martha Bernardi, por compartilhar seu precioso conhecimento contribuindo muito para meu crescimento científico e intelectual, obrigada por manter sua porta sempre aberta.

Aos

Professores

Dra.

Emma

Otta,

Dra.

Maria

Helena

Leite Hunziker,

Dra. Maria Teresa Araujo Silva, Dr. André F. Kohn, Dr. Luiz Eduardo Ribeiro do Valle, Dr. Luiz Roberto G. de Britto, e Dr. Luiz Silveira Menna Barreto, que tive o prazer de conhecer, reencontrar e conviver durante a realização do Doutorado, muito obrigada pela amizade, incentivo e colaboração.

Ao Dr. Ivo Lebrun, meu muito obrigado pela valiosa colaboração na dosagem dos aminoácidos.

Ao Prof. Jorge Camilo Flório, obrigada pela ajuda inestimável na dosagem das aminas e para

“decifrar” os resultados da neuroquímica.

Ao Prof. Luciano Freitas Felício, por sua amizade e ótimas sugestões em todas as etapas, certa de seu apoio lamento sua ausência por ocasião da defesa desta tese.

À Dra. Mônica Andersen, pela atenção e carinho ao aceitar o convite para participar da banca e pelas ótimas sugestões apresentadas por ocasião do exame de qualificação.

Aos Professores Dra. Célia Paulino, Dra. Gladys Nasello, Dr. Newton Sabino Canteras, pela atenção e carinho ao aceitar participar da banca da defesa desta tese.

À Beth (Elisabeth Teodorov) amiga muito querida, obrigada pela inestimável ajuda para a realização da neuroquímica.

À Soraya, por sua amizade e pelas dicas na cirurgia das ratas.

À Aline, obrigada pela ajuda nos experimentos, sinto estarmos tão longe À Amanda, Bel, Márcia, e todo pessoal do laboratório do Prof. Luciano, pelo carinho e amizade.

À Dra. Cláudia, Idalina, Rosires, Herculano, Luiz, Nelsinho, do Biotério do VPT – FMVZ –

USP, pelo carinho, amizade e principalmente pelo cuidado com os ratos.

À Magali, Priscila e Ricardo, do Laboratório do VPT – FMVZ – USP, pela amizade e colaboração nos experimentos.

À Cássia Medea, pelos sensacionais desenhos.

Aos colegas dos cursos de pós-graduação em Neurociências e Comportamento, em Psicologia Experimental, e em Patologia Experimental e Comparada, pelo privilégio de sua amizade e convívio.

Às secretárias do NeC e PSE – IP e VPT – FMVZ, Cláudia, Cristina, Idalina, Marguiti, Silvia, e Sônia, pela amizade e colaboração.

À Ana Laura, Moisés e Gustavo, do IP – USP, pela atenciosa ajuda, principalmente por ocasião da qualificação.

À Clarisse e equipe da Secretaria de Pós-graduação do IP – USP, pela atenção e apoio ao longo destes quatro anos de Doutorado.

Aos Funcionários das Bibliotecas do IP, FMVZ, e ICB – USP, pelo atendimento carinhoso e auxílio na compilação das referências.

Ao Instituto de Psicologia – USP, pela oportunidade de realização do curso de doutorado.

Ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP, por colocar a disposição o biotério e o laboratório para a realização dos experimentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de doutorado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.

Aos meus irmãos Manoel, Flávia, Renata e Marcello, cunhados e sobrinhos, pelo incentivo e apoio.

À minha prima Ana Lúcia Ferreira, pelo auxílio com o texto em inglês.

E, a todos que direta ou indiretamente colaboraram na realização deste Doutorado, o meu muito obrigado.

“A amizade consiste em esquecer o que a gente dá e lembrar o que a gente recebe”

Alexandre Dumas.

Os experimentos desta tese foram realizados

no Departamento de Patologia

da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

da Universidade de São Paulo

RESUMO

RODRIGUES-ALVES, P.S.B. Interferência da moxidectina na motivação sexual e ereção peniana de ratos: envolvimento de neurotransmissores hipotalâmicos e estriatais. 2007.

72 f. Tese (Doutorado em Neurociências e Comportamento) – Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

A moxidectina (MOX) é um antiparasitário utilizado na clínica veterinária. Em mamíferos seu mecanismo de ação envolve o ácido γ-aminobutírico (GABA), um neurotransmissor que tem papel relevante na regulação dos comportamentos sexual e motor. Dados anteriores por nós obtidos mostraram que a MOX prejudicou o comportamento sexual e a coordenação motora de ratos machos avaliados na trave elevada. Assim, dando continuidade a esse estudo, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da administração da dose terapêutica de MOX

(0,2 mg/kg) na motivação sexual e ereção peniana de ratos machos, bem como estudar seu envolvimento em diferentes sistemas de neurotransmissão central. Em todos os experimentos os ratos do grupo experimental receberam a MOX por via subcutânea (SC); e os ratos do grupo controle receberam 1 ml/kg de óleo de amêndoas pela mesma via, e foram avaliados após 72 h. A motivação sexual foi avaliada em um aparelho constituído de uma arena e dois compartimentos separados desta por tela de arame; num compartimento foi colocado um rato macho experiente e no outro uma fêmea sexualmente receptiva. Neste aparelho foi medido o tempo que o rato permaneceu nas proximidades de cada compartimento. Os resultados obtidos neste experimento não mostraram diferenças significantes entre os grupos. A ereção peniana foi induzida pela administração SC de 80 µg/kg de apomorfina, sendo avaliadas a latência e a freqüência de ereção. Os resultados mostraram aumento da latência e redução da freqüência de ereção peniana dos animais tratados com MOX, enquanto que a administração dos antagonistas GABAérgicos (biculina e faclofen) não alterou estes parâmetros. Por outro lado, observou-se que a biculina (antagonista GABAA) reverteu os efeitos da MOX na ereção peniana, enquanto o faclofen aumentou a freqüência de ereção peniana em ratos tratados com a MOX. Quanto aos níveis hipotalâmicos e estriatais de neurotransmissores e metabólitos, observou-se que a MOX reduziu os níveis estriatais de dopamina e de seu metabólito ácido homovanílico (HVA) e também os níveis hipotalâmicos de GABA. Estes dados sugerem que a MOX embora não interfira na motivação sexual, prejudica o desempenho sexual avaliado pela ereção peniana. Esse efeito da MOX pode ser atribuído a sua ação em receptores GABAA, os quais modulam receptores tipo B, aumentando a liberação de GABA, e 72 h depois, conseqüente redução dos níveis deste neurotransmissor no hipotálamo (uma das áreas centrais envolvidas com o comportamento sexual) e também dos níveis de dopamina e seu metabólito HVA no estriado, área do sistema nervoso central relacionada com a função motora e na qual neurônios GABAérgicos modulam a atividade de neurônios dopaminérgicos.

Palavras-chave: moxidectina, GABA, receptores GABAérgicos, motivação sexual, ereção peniana, neurotransmissores, hipotálamo, estriado, ratos.

ABSTRACT

Rodrigues-Alves, P.S.B. Moxidectin interference on sexual motivation and penile erection: involvement of hypothalamic and striatal neurotransmitters. 2007. 72 f. Thesis (Doctoral) – Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

The moxidectina (MOX) is an antiparasitic drug used in veterinary clinic. In mammals its mechanism of action involves GABA, neurotransmitter that has an important role in the regulation of the sexual and motor behaviors. Previous data showed that MOX impair male rat’s sexual behavior and motor coordination observed at wooden dowel. The objective of the present work was to evaluate the effects of therapeutic dose of MOX (0.2 mg/kg) in sexual motivation and penile erection of male rats, as well as to study its involvement in different central systems of neurotransmission. In all experiments the rats of experimental groups received MOX subcutaneous (SC), and the rats of control groups received 1.0 mL/kg of almonds oil (SC), and were observed after 72h. Sexual motivation test was performed in an arena with two cages, separate from the arena with a wall of wire screen; in one cage was put an intact male rat and in the other one, a sexually receptive female. In this test was measured the time that the rats stayed near of each cage. The data obtained in this experiment didn't show any significant differences among the groups. The penile erection (PE) was induced by 80 µg/kg of Apomorphine (SC), being evaluated the latency to and frequency of PE. The results showed increased latency and reduction of the frequency of PE of animals treated with MOX, while the GABAergic antagonists' administration (Biculline and Phaclofen) didn't change these parameters. On the other hand, it was observed that the Biculline (GABAA antagonist) reversed the effects of MOX in PE, while the Phaclofen increased the frequency of PE in rats treated with MOX. About Hypothalamic and Striatal neurotransmitters levels and their metabolites, was observed that MOX reduced Dopamine (DA) and its metabolite homovanillic acid (HVA) striatal levels and hypothalamic GABA levels. These data suggest that MOX although doesn't interfere in sexual motivation, impair sexual performance evaluated by penile erection. This effect of MOX can be attributed to its action in GABAA receptors, which modulate type B receptors, increasing GABA release, and consequent reduction of its levels in the Hypothalamus (one of the central areas involved with sexual behavior) and also, reduction of the DA and its metabolite HVA striatal levels. Striatum is a central nervous system area related with motor function in which GABAergic neurons modulate the activity of dopaminergic neurons.

Keywords: Moxidectin, GABA, GABAergic receptors, Sexual Motivation, Penile Erection, Neurotransmitters, Hypothalamus, Striatum, rat.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Ilustração esquemática da arena para avaliação da motivação sexual 26

Figura 2 - Ilustração esquemática da caixa para observação da ereção peniana 27

Figura 3 - Ilustração de um rato em ereção peniana

29

LISTA DE FIGURAS

Efeitos da administração de 0,2 mg/kg de moxidectina em parâmetros Figura 4 - de motivação sexual de ratos observados 72 h após o tratamento 37

Parâmetros de ereção peniana induzida por apomorfina em ratos

Figura 5 - observados 72 horas após o tratamento com moxidectina 40

Efeitos de antagonistas GABAérgicos em parâmetros de ereção

Figura 6 - peniana induzida por apomorfina, em ratos observados 72 horas após o tratamento com moxidectina

44

Efeitos da moxidectina nos níveis de dopamina, serotonina,

Figura 7 - noradrenalina, no Hipotálamo e no Estriado, 72h após o tratamento com moxidectina

47

Efeitos da moxidectina nos níveis de ácido γ-aminobutírico, glutamato Figura 8 - e glicina no hipotálamo e no estriado, 72 h após o tratamento com moxidectina

48

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Escores atribuídos à latência para primeira ereção peniana observadas em minutos, em ratos tratados com apomorfina

30

Tabela 2 - Efeitos da administração de moxidectina em parâmetros de motivação sexual de ratos observados 72 h após o tratamento

36

Tabela 3 - Parâmetros de ereção peniana induzida por apomorfina em ratos observados 72 horas após o tratamento com moxidectina

39

Tabela 4 - Efeitos de antagonistas GABAérgicos em parâmetros de ereção peniana induzida por apomorfina, em ratos observados 72 horas após o tratamento com moxidectina

43

Tabela 5 - Efeitos da moxidectina nos níveis de dopamina, serotonina, noradrenalina, GABA, glutamato e glicina no hipotálamo e no

estriado, 72h após o tratamento com moxidectina

46

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1

2 OBJETIVOS .................................................................................................................... 19

3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 20

3.1 Animais ....................................................................................................................... 20

3.2 Drogas e outros ........................................................................................................... 20

3.3 Procedimento .............................................................................................................. 23

3.3.1 Avaliação da Motivação Sexual .......................................................................... 23

3.3.2 Avaliação do Desempenho Sexual ...................................................................... 27

3.3.3 Avaliações Neuroquímicas .................................................................................. 31

3.3 Análises Estatísticas ................................................................................................... 34

4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS ........................................ 35

4.1 Experimento 1 Efeitos da moxidectina na motivação sexual de ratos ........................ 35

4.2 Experimento 2 Efeitos da moxidectina no desempenho sexual de ratos .................... 38

4.3 Experimento 3 Efeitos de antagonistas GABAérgicos no desempenho sexual de ratos tratados com moxidectina ................................................................................................. 41

4.4 Experimento 4 Efeitos da moxidectina nos níveis centrais de neurotransmissores ... 45

5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 49

6 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 60

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 61

1

1 INTRODUÇÃO

O comportamento pode ser entendido, de uma maneira simples, como a relação entre a fisiologia interna do animal e o ambiente externo; variações específicas na função fisiológica podem produzir comportamentos específicos, definidos e previsíveis (WEBER, 1997). Alterações na natureza físico-química das dicas ambientais ou nas respostas biológicas internas têm o potencial de induzir mudanças no comportamento, as quais podem sutilmente alterar a habilidade da população sobreviver (WEBER, 1997).

Numerosos pesquisadores, utilizando uma gama enorme de animais

invertebrados e vertebrados, inclusive o homem, desenvolveram um importante conhecimento das alterações comportamentais devidas à exposição a doses subletais de contaminantes no meio ambiente. Estes comportamentos incluem movimentos reflexos e avaliações neurocomportamentais, interações sociais, padrões de atividade e alimentação, e aprendizagem. Entretanto, estes trabalhos têm sido realizados sem investigação dos mecanismos fisiológicos que produzem as mudanças observadas (WEBER, 1997).

No outro lado do espectro biológico, fisiologistas, bioquímicos e biologistas moleculares têm apresentado uma riqueza de importantes dados sobre os efeitos de agentes tóxicos nos organismos aquáticos e terrestres, porém sob uma perspectiva inteiramente diferente, isto é, a relação entre os agentes tóxicos e os processos metabólicos, os mecanismos de detoxificação e a atuação como desreguladores neurofisiológicos e endócrinos.

Cada processo pode, através de uma série de vias intermediárias, afetarem o comportamento animal, porém não provêm correlações entre alterações comportamentais e mudanças induzidas pelo agente tóxico (WEBER, 1997).

Estas duas abordagens da toxicologia não são somente úteis, mas cada uma pode contribuir e reforçar a outra. Experimentos que examinam o efeito de substâncias 2

químicas em um simples comportamento de arco reflexo oferecem uma oportunidade única para decifrar o mecanismo básico da toxicologia comportamental, pois um comportamento padrão específico controlado por vias neurais específicas, permite traçar conexões claras entre a exposição ao agente tóxico e a indução de mudanças nos padrões neurocomportamentais (WEBER, 1997).

Neste contexto, nos dias de hoje, cresce a importância da toxicologia comportamental. Esta pode ser definida como o estudo das anormalidades de comportamento induzidas por agentes exógenos como as drogas, as substâncias químicas no ambiente em geral e no lugar de trabalho. Algumas substâncias prejudicam o sistema nervoso central (SNC) de forma permanente, alterando as sensações, o humor, a função intelectual, ou a coordenação motora, mas mesmo alterações de comportamento passageiras são consideradas tóxicas em algumas situações (HENDERSON; HENDERSON, 2003; 2005).

Comparando sujeitos expostos a agentes exógenos e sujeitos controle, os toxicologistas comportamentais procuram identificar os agentes capazes de alterar o comportamento e determinar o nível de exposição no qual os efeitos indesejáveis ocorrem.

Quando o agente a ser estudado é de uso comum, e não há evidência de risco para saúde, podem-se usar seres humanos no experimento, porém é mais freqüente, por motivos de segurança na pesquisa em toxicologia, a utilização de animais de laboratório (HENDERSON; HENDERSON, 2003; 2005).

Se a toxicidade for considerada somente em termos do risco direto para sobrevivência, a toxicidade comportamental pode ter uma importância menor. Entretanto, sobrevivência não o único critério de uma boa saúde; mesmo um pequeno desvio no comportamento é potencialmente perigoso (HENDERSON; HENDERSON, 2003; 2005).

Os praguicidas empregados na agricultura e em medicina veterinária fazem parte do grupo dos agentes neurotóxicos que levam a alterações comportamentais, sendo os 3

primeiros grupos estudados os organoclorados, os organofosforados e os carbamatos. Na década de 1970 foi descoberta uma nova classe de praguicidas, as lactonas macrocíclicas, as quais têm uma ação mais seletiva sobre o parasita, com pouco efeito sobre as células do hospedeiro. Fazem parte do grupo das lactonas macrocíclicas, as milbemicinas, as avermectinas e as espinosinas (SATOR; SANTARÉM, 2006).

O grupo farmacológico das milbemicinas e avermectinas são obtidos partir do processo de fermentação de fungos do solo, actinomicetos, do gênero Streptomyces (BURG et al., 1979; TAKIGUCHI, ET al., 1980; SHOOP; MROZIK; FISHER, 1995; AYRES; ALMEIDA, 2002).

A moxidectina (MOX), em particular, é uma milbemicina utilizada em medicina veterinária no combate aos endo- e ecto-parasitas, isto é, infestações causadas por nematódeos e artrópodes que acometem diversas espécies animais como caninos, eqüinos, ovinos, bovinos, ruminantes silvestres, entre outros (COURTNEY; ROBERTSON, 1995; SHOOP; MROZIK; FISHER, 1995; SATOR; SANTARÉM, 2006).

Estudos farmacocinéticos mostraram que o pico de concentração plasmática (Cmax) da MOX é atingido após 8 h da administração subcutânea (SC) de 0,2 mg/kg (dose terapêutica) em bovinos, e a concentração desta droga na gordura após 28 dias do tratamento é 90 vezes maior do que a detectada no plasma (LANUSSE et al., 1997). Uma grande proporção de MOX acumula-se no fígado e na gordura (MOLENTO et al., 2004); este fenômeno explica o longo tempo de permanência desta droga no plasma, e o pico de concentração precoce seguido por um rápido declínio (fase de distribuição) no perfil da concentração plasmática entre o Cmax e 10 dias pós tratamento (LANUSSE et al., 1997).

Quando administrada por via oral (VO) a ovinos e ratos, este pico é de 10 horas (FAO/WHO, 1995).

4

A MOX mostra moderada toxicidade quando administrada via oral (VO) em ratos e camundongos, e a dose letal 50% (DL50) é de 50 a 100 mg/kg (FAO/WHO, 1995).

Quando a MOX é administrada em altas doses em animais, os efeitos adversos observados são caracterizados por sinais de neurotoxicidade como depressão, ataxia, tremores, ansiedade, dificuldade visual, coma e morte (KHAN; KUSTER; HANSEN, 2002).

Em nematódeos e artrópodes, o efeito endectocida (isto é, combate de endo- e ecto-parasitas) das milbemicinas e das avermectinas resultam da atuação em canais de cloro controlados por GLU, levando a hiperpolarização por aumento do influxo de íons cloro (Cl-) para o interior da célula nervosa. Esta ação leva à paralisia dos nematódeos e artrópodes. Em mamíferos não é encontrado este tipo de canal de cloro controlado por GLU (ARENA, 1994; CLELAND, 1996; CULLY et al., 1996; NJUE et al., 2004; RODRIGUES-ALVES et al., 2007).

Estes endectocidas também se ligam com alta afinidade aos canais de cloro controlados por ácido gama-aminobutírico (GABA) (DUCE, SCOTT, 1985; DAWSON et al., 2000; FENG et al., 2002; LIFSCHITZ et al, 2002; MOLENTO et al.,2004; NJUE et al, 2004).

Nos insetos e artrópodes estas drogas interferem na transmissão dos impulsos nervosos entre células nervosas e musculares, pois é nesta junção neuromuscular que estão localizados os receptores GABAérgicos. Em vertebrados estas lactonas macrocíclicas também interferem com estes receptores, porém sua atuação em receptores de invertebrados é aproximadamente 100 vezes maior (SCHAFFER; HAINES, 1989; TRACY; WEBSTER, 1996), o que reduz o risco de efeitos nocivos em mamíferos.

Sabe-se que em mamíferos as avermectinas têm efeito no sistema nervoso central (SNC) por potenciação da liberação de GABA, cujo receptor encontra-se acoplado a canais de cloro; este neurotransmissor inibitório encontra-se distribuído por todo SNC de 5

mamíferos1 (DUCE & SCOTT, 1985; COURTNEY; ROBERTSON, 1995; SHOOP; MROZIK; FISHER, 1995; DAWSON et al., 2000; FENG et al., 2002; LIFSCHITZ et a l, 2002; MOLENTO et al.,2004; NJUE et al, 2004; RODRIGUES-ALVES et al., 2007).

Acredita-se que o mecanismo de ação da MOX é semelhante ao da ivermectina, do grupo das avermectinas, e ainda, ambas as drogas têm reação cruzada de tolerância (SHOOP; MROZIK; FISHER, 1995).

Em uma visão simplificada, os neurônios centrais mudam sua atividade por causa da influência oposta de impulsos excitatórios e inibitórios. Aumento na descarga neuronal é frequentemente visto como conseqüência de aumento de impulsos excitatórios, enquanto inibição neuronal é conseqüência do aumento de impulsos inibitórios. (WINDELS; KIYATKIN, 2006). GABA é o principal neurotransmissor inibitório do SNC de mamíferos.

Atualmente acredita-se que exista pelo menos três principais classes de receptores GABAérgicos chamados: GABAA, GABAB, e GABAC (BORMANN, 2000; CHEBIB; JOHNSTON, 2000; CHEBIB et al., 2007). Os receptores GABAA e GABAC são membros da superfamília de canais ligados a íons, a qual inclui também os receptores nicotínicos da acetilcolina, de GLI sensível à estricnina e serotoninérgico tipo 3 (BORMANN, 2000; CHEBIB; JOHNSTON, 2000; CHEBIB et al., 2007).

Pelo menos 16 subunidades de receptores GABAA têm sido descritas em seres humanos e classificadas em sete subfamílias de subunidades protéicas: α, β, γ, δ, ε, θ, e π. A combinação destas subunidades possibilita uma grande variabilidade de tipos de receptor GABAA (WHITING, 2003; CHEBIB et al . , 2007), determinando a ação de drogas moduladoras (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002). O receptor GABAA é responsável principalmente pela inibição pós-sináptica; seus agonistas são muscimol, ácido 3-1 RODRIGUES-ALVES, P. S. B.; LEBRUN, I.; FLORIO, J. C.; BERNARDI, M. M.; SPINOSA, H. S. Moxidectin interference on motor activity of rats. Brazilian Archives of Biology and Technology (no prelo).

6

aminopropanesulfônico (APSA) e THIP (4,5,6,7-tetra-hidroisoxazol[5,4-c]piridina-3-ol), e seus antagonistas a bicuculina (seletivo) e a picrotoxina (HILL; BOWERY, 1981; AGMO; GIORDANO, 1985).

O receptor GABAB é um membro da família de 3 classes de receptores ligados à proteína G (receptores trans-membrana), que são acoplados a canais de potássio (K+) e cálcio (Ca2+), isto é, aumentam a condutância de K+ e diminuem a do Ca2+, sendo responsável principalmente pela inibição pré-sináptica. Este receptor existe como heterodímeros, consistindo de subunidades GABAB1 e GABAB2, as quais são requeridas para formar o receptor funcional tanto in vivo como in vitro (WHITE et al, 1998; ONG; KERR, 2000; CRYAN; KAUPMANN, 2005; CHEBIB et al.., 2007). Seu agonista é o baclofen e os antagonistas faclofen e saclofen (BOWERY; HILL; HUDSON, 1983; AGMO; GIORDANO, 1985). Tanto o receptor GABAA como o receptor GABAB são distribuídos ubiqüamente no SNC de mamíferos.

O terceiro tipo, chamado receptor GABAC, forma um canal de cloro; é caracterizado por sua insensibilidade aos moduladores de receptores GABAA (barbitúricos e benzodiazepínicos), bem como ao seu antagonista clássico a bicuculina. O receptor GABAC é também insensível ao agonista de receptor GABAB, o baclofen (CHEBIB; JOHNSTON, 2000; CHEBIB et al, 2007). Por outro lado, este receptor é ativado pelo ácido (+)- cis-2-

(aminometil)-ciclopropanecarboxilico [(+)-CAMP)] e ácido cis-4-aminocrotônico (CACA) (DUKE et al, 2000; CHEBIB et al, 2007). O primeiro antagonista seletivo de receptor GABAC descrito foi o ácido (1,2,5,6-tetra-hidropiridina-4-il)metilfosfinico (TPMPA) (RAGAZZINO et al, 1996; CHEBIB et al, 2007); foram identificados recentemente também como antagonistas o ácido (±)- cis-(3-aminociclopentil)metilfosfínico [(±)- cis-3-ACPMPA] e o ácido (±)- trans-(3-aminociclopentil)metilfosfínico [(±)- trans-3-ACPMPA], que são mais 7

potentes, seletivos e lipofílicos, por isso atravessam a barreira hemato-encefálica, possibilitando a administração sistêmica (CHEBIB et al, 2007).

Comparado ao receptor GABAA, o receptor GABAC tem alta afinidade ao GABA, menor fluxo iônico e não leva a dessensibilização do canal por tempos longos de abertura (BORMANN; FEIGENSPAN, 1995; JOHNSTON, 1996; CHEBIB; JOHNSTON, 1999). O receptor GABAC é constituído somente de subunidades Ro (ρ) indicando uma classe mais simples de receptores. Estudos de clonagem de receptores oriundos de seres humanos, de ratos, de camundongos e de retina de pintos mostraram cinco tipos de subunidades ρ chamadas subunidades ρ1-5; em particular, os ratos possuem as subunidades ρ1-3 (BORMANN, 2000; CHEBIB, JOHNSTON, 2000; CHEBIB et al . , 2007). Estas subunidades formam receptores funcionais homoméricos (subunidades ρ1, ρ2, ou ρ3) (KUSAMA et al, 1993; ENZ; CUTTING, 1998; OGURUSU et al, 1999; CHEBIB et al . , 2007) ou receptores pseudo-heteroméricos (combinação das subunidades ρ1 e ρ2, ou ρ2 e ρ3) (ENZ; CUTTING, 1998; OGURUSU et al, 1999; CHEBIB et al . , 2007).

Foi demonstrado que as subunidades ρ do receptor GABAC existem

predominantemente na retina (ENZ et al, 1995, CHEBIB et al . , 2007). Estudos recentes têm revelado suas expressões em outras regiões do cérebro, como o colículo superior, núcleo geniculado dorsolateral, córtex visual, cerebelo, medula espinhal e hipocampo (ENZ et al, 1995; BOUE-GRABOT et al, 1998; ALAKUIJALA; ALAKUIJALA; PASTERNACK, 2006; CHEBIB et al . , 2007), além da pituitária (BOUE-GRABOT et al, 2000; CHEBIB et al, 2007) e intestino (JANSEN et al, 2000; CHEBIB et al, 2007).

Há na literatura vários trabalhos que avaliam os efeitos do GABA e de drogas GABAérgicas no comportamento sexual de ratos machos. Foi relatado que durante o período refratário pós-ejaculação, a concentração de GABA no fluído cérebro-espinhal aumenta 8

drasticamente, mostrando o papel inibitório deste neurotransmissor na atividade copulatória (QURESHI; SÖDERSTEN, 1986).

Agmo e Paredes (1985) mostraram diminuição na porcentagem e número de montas e intromissões após administração do agonista de receptores GABAA THIP, enquanto o agonista de receptor GABAB, baclofen, promoveu inibição quase completa do comportamento sexual. Por outro lado, a administração sistêmica de bicuculina, antagonista de receptores GABAA, não interferiu em nenhum parâmetro da cópula, porém quando administrada concomitante ao THIP produziu efeito inibitório intenso no comportamento sexual.

Bitran e Hull (1987) levando em consideração que os receptores GABAérgicos são heterogêneos, atribuíram o fato de um antagonista potencializar a ação de um agonista, como conseqüência do bloqueio pré- e pós-sináptico de receptores GABAA. Assim, o bloqueio pré-sináptico resultaria em liberação endógena do neurotransmissor GABA, o qual ativaria, preferencialmente, sítios GABAB, uma vez que os sítios GABAA estariam bloqueados pela bicuculina. Esta hipótese sugere também que o THIP pode ter algum efeito em receptor GABAB, e que a inibição do comportamento sexual de machos pelo GABA é mediada pela ativação de receptores GABAB.

Outros experimentos têm mostrado que o bloqueio estéreo-específico de sítios de ligação dos receptores GABAA da área pré-óptica medial (APOM) promove um potente efeito estimulante do comportamento copulatório (FERNANDEZ-GUASTI; LARSSON; BEYER, 1985, FERNANDEZ-GUASTI; LARSSON, VEGA-SANABRIA, 1986). A administração de bicuculina diretamente na APOM resultou tanto na redução drástica do intervalo pós-ejaculatório, como na eliminação virtual da vocalização ultra-sônica normalmente emitida durante este período refratário (FERNANDEZ-GUASTI; LARSSON, VEGA-SANABRIA, 1986), enquanto a administração intracranial de bicuculina acelerou o 9

início do comportamento sexual de ratos ingênuos, que foram castrados e tratados com testosterona (FERNANDEZ-GUASTI; LARSSON; BEYER, 1986a). Já a administração do agonista GABAA muscimol, na área pré-óptica medial de ratos experientes, que não foram castrados, resultou na supressão do comportamento sexual, expresso pela diminuição na proporção de animais que realizaram montas, intromissões e ejaculação (FERNANDEZ-GUASTI; LARSSON; BEYER, 1986b). Assim, o bloqueio dos supostos sítios dos receptores GABAA na APOM facilitou tanto o início do comportamento copulatório após a ejaculação, bem como o restabelecimento deste comportamento em animais castrados que receberam testosterona.

A influência do GABA no reflexo de ereção peniana (EP) também tem sido investigado. Leipheimer e Sachs (1988) observaram que a administração sistêmica de diferentes doses (1,0 e 2,0 mg/kg) de baclofen promoveu diminuição dose-dependente da proporção de ratos exibindo ereções no teste do reflexo peniano em posição supina; porém, estas mesmas doses não tiveram efeito no comportamento de cópula. Por outro lado, a administração sistêmica de THIP ou bicuculina não afeta o reflexo peniano, nem o comportamento de cópula. Estes dados mostram uma influência maior dos receptores GABAB

no reflexo de EP.

No mesmo sentido, Meisel e Sachs (1994), descrevendo o comportamento sexual de machos como macaco, cão, gato, e inclusive o homem, referem que a estimulação de receptores GABAB inibe os reflexos de ereção, enquanto que os receptores GABAA não têm influência na EP.

Os receptores GABAB estão presentes no corno dorsal da medula espinhal lombo-sacra (BOWERY; HILL; HUDSON, 1984; DAVIDOFF e HACKMAN, 1985) e a influência destes nas respostas do reflexo de EP tem sido estudadas. Bitran e Hull (1987) relataram que a administração de 0,2 µg de baclofen, por via intratecal, visando atuação na 10

medula espinhal lombo-sacra, causou aumento da latência para ereção e redução no número de EP; doses maiores (0,4 e 0,8 µg) diminuíram o número de animais exibindo EP. A maior dose produziu também um leve efeito inibitório no comportamento copulatório, caracterizado por aumento na latência para ejaculação em conseqüência de um maior número de montas sem intromissão. Por outro lado, quando da administração de baclofen, por via intratecal, porém, visando atuação na medula espinhal torácica, não se observaram efeitos nas respostas penianas (BITRAN et al., 1989).

Ativação ou inibição preferencial de receptores GABAA na APOM afetam o comportamento copulatório, enquanto ativação de receptores GABAB inibe EP reflexa (BITRAN et al., 1989). Em outros estudos, administração sistêmica de baclofen impede o comportamento copulatório (AGMO; PAREDES, 1985; PAREDES; AGMO, 1989), entretanto, prejuízo do comportamento sexual está também acompanhado por déficit na execução motora (BITRAN et al., 1989; PAREDES; AGMO, 1989).

Outros autores mostraram que a ativação de receptores GABAA por administração de muscimol no núcleo paraventricular (NPV) de ratos, reduziu EP e bocejo induzidos por apomorfina, NMDA e oxitocina, e este efeito não foi observado após administração de baclofen (MELIS et al., 2000; ARGIOLAS; MELIS, 2005).

Recentemente, em nossos laboratórios, observamos que a MOX foi capaz de prejudicar o comportamento sexual de ratos machos inexperientes, além de provocar incoordenação motora nestes animais quando testados na trave elevada1 (RODRIGUES-ALVES, 2003; RODRIGUES-ALVES et al, 2007).

O comportamento sexual é freqüentemente considerado como parte de uma série de comportamentos padrões que têm um propósito ou função de manter as espécies 1 RODRIGUES-ALVES, P. S. B.; LEBRUN, I.; FLORIO, J. C.; BERNARDI, M. M.; SPINOSA, H. S. Moxidectin interference on motor activity of rats. Brazilian Archives of Biology and Technology (no prelo).

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(AGMO, 1999). Quando se observa o comportamento sexual de machos, são analisados a motivação e o desempenho sexual, mas apesar desta distinção, ambos estão intimamente relacionados (MEISEL; SACHS, 1994). O processo que faz o animal procurar contato sexual com outro animal é usualmente referido como motivação sexual ou libido; e o desempenho sexual ou potência é a eficiência de ereção e orientação penianas.

Os termos “libido” e “potência” são raramente usados no discurso científico, mesmo para homens, e mais raramente ainda para machos não humanos. Os termos mais comumente usados são motivação e desempenho, ou na terminologia etológica clássica, aspectos apetitivos e consumatórios do comportamento sexual. Em relação a este comportamento, uma distinção deve ser feita entre procurar o contato sexual (motivação ou libido) e estar apto para completar o ato copulatório (desempenho ou potência), porém, motivação sexual e capacidade erétil não são usualmente independentes uma da outra (MEISEL; SACHS, 1994).

A motivação sexual é basicamente diferente de outras motivações, como a fome, sede, esquiva da dor, e assim por diante. Enquanto a privação de comida e água ou a inflição de dor é potencialmente perigoso para o organismo, a abstinência sexual não tem, em curto prazo, conseqüências adversas ao indivíduo. Há muito tempo tem sido reconhecido que a motivação sexual, isto é, o desejo para empenhar-se na atividade sexual, é ativada pela presença de um(a) companheiro(a) (MEISEL; SACHS, 1994). Motivação sexual é, portanto, um caso de motivação incentivada (AGMO, 1999; 2003).

No caso de incentivo sexual, tem havido uma grande discussão sobre quais estímulos são incondicionados e quais são efetivos em decorrência de aprendizado prévio.

Vários estudos têm demonstrado que uma rata sexualmente receptiva pode ativar diferentes comportamentos de aproximação em ratos sexualmente experientes (AGMO, 1999; 2003).

Estes machos ficam mais tempo na proximidade da fêmea receptiva do que na proximidade 12

do macho, quando observados numa arena apropriada que impede a ocorrência de comportamento copulatório. Esta preferência pela fêmea não diminui depois de repetidas sessões, mostrando que as propriedades incentivadoras são mantidas mesmo na ausência de execução dos reflexos sexuais (copulação) (AGMO, 2003).

Por outro lado, os dados referentes ao comportamento de aproximação, obtidos com ratos inexperientes são conflitantes. Há autores que relataram que ratos inexperientes não mostraram nenhuma preferência pela fêmea receptiva (VEGA-MATUSZCZYK; APPA; LARSSON, 1994), enquanto outros observaram que estes animais têm tanta preferência pela rata quanto os ratos experientes (ELIASSON; MEYERSON, 1981; MERKX, 1984). Um estudo usando straight runway mostrou que ratos inexperientes correm mais rápidos para uma fêmea tratada com hormônios do que para a não tratada (LÓPEZ; OLSTER; ETTENBERG, 1999). Para auxiliar no entendimento destes achados conflitantes, Agmo (2003) mostrou a necessidade de fazer com que os ratos inexperientes se familiarizem com a arena, sem a presença dos animais iscas, uma semana antes do teste. Este autor mostrou também que a rata receptiva é um estímulo incondicionado para o rato, independente de sua experiência.

O desempenho sexual ou potência, outro aspecto do comportamento sexual, pode ser analisado através dos mecanismos que regulam a ereção e outros componentes penianos da copulação; esta análise pode ser facilitada pela observação destas respostas fora do contexto da copulação ( ex copula) em ratos, cães e gatos. Respostas do pênis de ratos durante testes ex copula são similares, na forma, àqueles que ocorrem durante a cópula (LEIPHEIMER; SACHS, 1988).

A EP resulta da interação neural central e periférica que induz mudanças musculares e vasculares nos tecidos eréteis do aparelho genital masculino (corpo cavernoso, corpo esponjoso e outros músculos perineais, como o elevador do ânus, quando presente) (LEIPHEIMER; SACHS, 1988; ARGIOLAS; MELIS, 2005). O aumento de fluxo sangüíneo 13

para o pênis simultâneo ao relaxamento dos tecidos eréteis do corpo cavernoso e corpo esponjoso é controlado pelo sistema nervoso autônomo (RAMPIN et al., 2004).

Os neurônios motores que inervam os músculos perineais estão localizados em um núcleo específico sexualmente dimórfico na região L5-L6 da medula espinhal. Os músculos perineais e seus neurônios motores espinhais são andrógenos sensíveis (LEIPHEIMER; SACHS, 1988). A compreensão deste processo complica-se pelas influências humorais e endócrinas exercidas principalmente pela testosterona e seus metabólitos tanto a nível periférico quanto central (ARGIOLAS; MELIS, 2005).

Ereções reflexas podem ocorrer em ratos anestesiados eliciadas pelo nervo peniano dorsal (NPD), e conta com um arco reflexo que inclui uma rede de neurônios da medula lombo-sacra, como uma ligação entre o NPD, ou ramo aferente, e a descarga do sistema nervoso parassimpático da região do sacro como ramo eferente. O DPN conduz informações sensoriais do pênis e pele da região Peri genital para a medula lombo-sacra, e esta estimulação ativa uma rede de neurônios lombo-sacrais (RAMPIN et al., 2004). Em ratos, a descarga nervosa parassimpática pró-erétil origina-se no núcleo parassimpático do sacro (NPS), localizado no segmento L6-S1 da medula espinhal. O NPS contém neurônios pré-

ganglionares que inervam o pênis (RAMPIN et al., 2004).

Sabe-se, portanto, que diferentes mecanismos neurais centrais e periféricos e/ou humorais endócrinos participam da regulação da resposta sexual, de maneira muito complexa (ARGIOLAS; MELIS, 2005). Por ouro lado, disfunções do SNC ou sistema nervoso autônomo periférico, ou ambos podem prejudicar a realização da EP, mesmo quando os órgãos efetores chave (músculo liso vascular e corpo cavernoso) estão intactos. Dos mecanismos de controle central e periférico da EP somente foram identificados até agora àqueles que controlam a EP localmente no tecido peniano, em particular, os envolvidos com o relaxamento do corpo cavernoso, o evento chave para a realização de EP. Em contraste, pouco 14

se sabe dos mecanismos através dos quais o SNC exerce este controle. Recentemente algum progresso foi alcançado neste campo, tendo sido identificados vários neurotransmissores e neuropeptídeos no SNC, os quais controlam a função erétil (ANDERSSON; WAGNER, 1995; ARGIOLAS; MELIS, 1995; ANDERSSON, 2001).

Argiolas e Melis (2005) citando vários trabalhos da literatura observaram que os neurotransmissores e neuropeptídeos agem em diversas áreas do cérebro conduzindo informação ao aparelho genital através da medula espinhal, e que entre estas áreas do SNC, as mais estudadas são: a APOM, os núcleos paraventriculares (NPV) do hipotálamo, a amígdala, os núcleos paragigantocelulares da formação reticular ventral e a medula espinhal. Estes autores relataram também que grupos de pesquisadores com diferentes abordagens experimentais (farmacológicas, eletrofisiológicas e neuro-anatômicas) mostraram o importante papel dos NPV do hipotálamo no controle da função erétil. (ARGIOLAS; MELIS, 2005). Por outro lado, a APOM do hipotálamo anterior é uma região cerebral crítica para a iniciação do estímulo e comportamento sexuais (MEISEL; SACHS, 1994).

Melis et al. (2000) obtiveram redução de EP induzida por apomorfina, NMDA e oxitocina, quando administraram no NPV muscimol e não baclofen. Estudos posteriores mostraram que este efeito inibitório do muscimol na EP ocorre concomitante à redução no aumento de produção de óxido nítrico nos NPV hipotalâmicos, que acontece durante a indução de EP por drogas e oxitocina, e que este efeito é bloqueado por bicuculina também administrada nestes núcleos. Baseados nestes achados, os autores sugeriram que o estímulo de receptores GABAA prejudica a EP induzida por drogas, devido diminuição da atividade da enzima óxido nítrico sintase em neurônios oxitocinérgicos que medeiam a EP. (ARGIOLAS; MELIS, 2005).

Apesar da execução da EP ser essencial para o sucesso da reprodução, esta resposta sexual no rato pode ocorrer não só durante a atividade sexual, mas também em outros 15

contextos, como na presença de uma rata receptiva inacessível, ou após tratamento com várias classes de drogas de ação central ou periférica, como por exemplo, agonistas dopaminérgicos, agonistas serotoninérgicos, (α-MSH)-peptídeos relacionadas ao hormônio adrenocorticotrofina-melanócito estimulante, oxitocina, análogos da hexarelina, doadores de óxido nítrico, inibidores da fosfodiesterase, ativadores solúveis da guanilato ciclase, inibidores da RhoA-Rho cinase, etc (SUCCU et al., 2003; ARGIOLAS; MELIS, 2005).

Em particular, a EP pode ser induzida pela administração sistêmica do agonista dopaminérgico, apomorfina. Uma vez que o antagonista dopaminégico central haloperidol, e não a domperidona (antagonista periférico), diminui o efeito indutor de EP da apomorfina, foi proposto então, que a resposta a esta droga é devido a mecanismo(s) dopaminérgico central (PEHEK; THOMPSON; HULL, 1988; ZARRINDAST; FARAHVASH, 1994). Há evidências também que mecanismos GABAérgicos estão envolvidos na EP e na cópula de ratos (LEIPHEIMER; SACHS, 1988; ZARRINDAST; FARAHVASH, 1994).

Na avaliação do comportamento sexual, a motivação pode ser medida pela latência para primeira monta e, em geral, deve ser menor que um minuto. A latência para primeira intromissão freqüentemente é a mesma que a latência para primeira monta, mas às vezes pode ser mais longa. Intromissão requer EP e atividade coordenada dos músculos estriados do pênis e, conseqüentemente, não é inteiramente determinada pela motivação sexual (AGMO, 1997).

O número de montas é bastante variável e, provavelmente, reflete a motivação sexual, mas pode ser confundida com outros fatores, e deve ser interpretada com cautela. O

número de intromissões mostra a facilidade pela qual o reflexo ejaculatório é ativado. A eficiência copulatória representa o desempenho sexual ou potência (AGMO, 1997). O

intervalo inter-intromissão e a freqüência de montas por minuto podem refletir uma mistura de motivação e desempenho sexuais (AGMO, 1997).

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Dados obtidos em nossos laboratórios mostraram que a MOX aumentou as latências para primeira monta e primeira intromissão, e o intervalo inter-intromissões; e também reduziu o número total de montas (RODRIGUES-ALVES et al, 2007). Estes dados não permitiram caracterizar se os efeitos comportamentais da MOX foram causados por alteração na motivação ou no desempenho sexual, ou em ambos. No presente trabalho utilizamos modelos experimentais para avaliar o efeito da MOX separadamente nestes dois aspectos do comportamento sexual.

Nossos resultados anteriores (RODRIGUES-ALVES, et al., 2007) mostraram também prejuízo da coordenação motora de ratos observados na trave elevada. Este achado corrobora outros que mostraram o envolvimento do sistema GABAérgico no controle motor.

Em um estudo do funcionamento da rede neural que controla o comportamento motor em vertebrados, Tegnér et al. (1993) mostraram que ambos os receptores GABAA e GABAB

agem em conjunto na coordenação da locomoção. Kriem et al. (1998) sugeriram que a transmissão GABAérgica na substância nigra pars reticulata (SNr) tem um papel crucial no controle da atividade motora e na regulação dos movimentos.

Semelhante à maioria dos neurônios centrais no neocórtex, tálamo, hipotálamo, hipocampo, amígdala, e mesencéfalo, os neurônios da SNr são células autoativas (WINDELS; KIYATKIN, 2006). O ritmo de descarga in vitro dos neurônios da SNr mostrou-se diferente dependendo de sua localização antero-posterior (HAJOS; GREENFIELD, 1993), da espécie animal e possivelmente da temperatura (YUAN; YAMADA; INAGAKI, 2004), e efeito de bloqueio de receptores GABA pela administração de bicuculina. A liberação do GABA porém inibe tonicamente os neurônios da SNr (WINDELS; KIYATKIN, 2006).

Os neurônios da SNr de ratos têm uma sensibilidade mínima ao GLU, sugerindo que este impulso não é responsável pelo aumento tônico em sua atividade. Em contraste com o limitado impulso e esparsos receptores de GLU, os neurônios da SNr 17

recebem uma densa inervação do estriado e globo pálido e tem uma das maiores densidades de receptores GABAérgicos do cérebro (WINDELS; KIYATKIN, 2006).

Sendo um sítio final para a integração somato-sensória, os neurônios GABAérgicos da SNr disparam em ritmo relativamente estável. Resultados obtidos por Windels e Kiyatkin (2006) sugerem que a modulação pelo impulso GABAérgico, mas não pela influência oposta de GLU e GABA, é o fator primário responsável pela inibição em fases destas células induzidas por estímulo sensorial e pelos ajustes tônicos de sua atividade basal, e uma vez que a dopamina na SNr age via receptor D-1, esta modula os impulsos de GABA nos terminais GABAérgicos pré-sinápticos (YUNG et al., 1995), portanto, a perda de DA pode diminuir a inibição que o GABA exerce nos neurônios da SNr, resultando em sua hiperatividade (WINDELS; KIYATKIN, 2006).

Do exposto acima, temos que as vias GABAérgicas estão intrinsecamente relacionadas com as vias dopaminérgicas presentes nas áreas sensoriais e motoras do SNC, e estão envolvidas no controle dos comportamentos sexual e motor.

Assim, considerando que a MOX pode interferir com a transmissão GABAérgica e que este sistema participa da manifestação do comportamento sexual, dando continuidade ao nosso estudo anterior, propusemos, neste trabalho, a fim de auxiliar no entendimento do mecanismo de ação desta droga em mamíferos, avaliar tanto os efeitos da MOX na motivação e desempenho sexuais, bem como os efeitos de antagonistas GABAérgicos (biculina e faclofen) no desempenho sexual, além de avaliar os níveis de neurotransmissores de ratos expostos a MOX, no hipotálamo e estriado, áreas do SNC

relacionadas com comportamentos sexual e motor, respectivamente.

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2 OBJETIVOS

Estudar os efeitos da moxidectina (MOX) em aspectos do comportamento sexual de ratos machos e o envolvimento de sistemas de neurotransmissão central. Para tanto, avaliou-se em ratos machos expostos à dose terapêutica de MOX (0,2 mg/kg): a motivação e desempenho sexuais;

os efeitos da administração de antagonistas GABAérgicos (biculina e faclofen) no desempenho sexual;

os níveis de neurotransmissores: aminas (dopamina, serotonina, noradrenalina) e seus metabólitos; e aminoácidos (GABA, glutamato e glicina, e aspartato); presentes no hipotálamo e no estriado.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos machos adultos inexperientes, da linhagem Wistar, provenientes do biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os animais com aproximadamente 80 dias de idade foram alojados em caixas de polipropileno com tampa metálica medindo 40 x 50 x 20

cm, em número de quatro ou cinco por caixa. Estas caixas foram mantidas na Sala de Ciclo Invertido, com ciclo claro/escuro (CE) 12:12 h (luz acesa às 22:00 h), temperatura controlada (22 + 2 ºC), água e alimentação (ração comercial balanceada) ad libitum, por um período não inferior a 30 dias antes de serem colocados nas diferentes situações experimentais.

Cada animal foi utilizado em apenas um experimento.

3.2 Drogas e outros

Moxidectina (Cydectin® - Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Campinas).

Óleo de amêndoas (Leclerc Industrial Ltda., São Paulo): usado como veículo da moxidectina.

Xilazina 1% (Rompum® - Bayer): usado como pré-anestésico em ratas submetidas a ovariectomia.

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Cloridrato de Cetamina - 100 mg/ml (Vetaset® - Fort Dodge): usado como anestésico em ratas submetidas a ovariectomia.

Riodeine® iodopovidona tópico (Rioquímica Indústria Farmacêutica): usado para antissepsia da pele das ratas submetidas à ovariectomia.

Vetaglós® pomada (Univet S.A. Indústria Veterinária): usada no tratamento das feridas cirúrgicas das ratas submetidas a ovariectomia.

Paracetamol (Tylenol® gotas - Janssen-Cilag Farmacêutica): usado como analgésico no período pós-operatório das ratas iscas.

Benzoato de 17β estradiol e progesterona (Sigma): usados no tratamento das ratas iscas, conforme descrito abaixo.

Cloridrato de apomorfina (Sigma)

Bicuculina (Serva – Fein Biochemica Heidelberg): antagonista de receptor GABAA

Faclofen (Sigma): antagonista de receptor GABAB

Etanol (Cooperalcool® - Coopersucar Indústria Brasileira): usado para limpeza dos aparelhos utilizados nos experimentos, numa solução a 5 %.

A MOX foi diluída em óleo de amêndoas, obtendo-se a concentração de 0,2 mg/mL. Os animais receberam 1,0 mL/kg desta preparação por via subcutânea (SC).

A xilazina e a cetamina foram administradas, por via intraperitoneal (IP), para a anestesia das ratas submetidas a ovariectomia bilateral. No período pós-operatório foram colocadas seis a sete gotas de paracetamol em 200 mL de água oferecida no bebedouro das ratas iscas, por quatro a cinco dias, sendo trocada diariamente.

O 17β estradiol e a progesterona foram diluídos em óleo de amêndoas, sendo administrados nas doses de 50 µg/kg e 2 mg/kg, respectivamente, por via SC, em volume de 22

1,0 mL/kg nas ratas iscas utilizadas na avaliação da motivação sexual, 54 e 6 horas, respectivamente, antes do início de cada sessão experimental.

A apomorfina foi diluída em solução de cloreto de sódio 0,9% gelada, obtendo-se a concentração de 80 µg/mL, sendo administrado 1,0 mL/kg por via SC. Esta droga foi mantida em gelo e ao abrigo da luz durante toda a sessão experimental.

A bicuculina, droga antagonista GABAA, foi diluída em solução de cloreto de sódio 0,9% com ácido acético glacial (pH 4,0), na concentração de 1,5 mg/mL, e administrada por via intraperitoneal (IP) em volume de 1,0 mL/kg.

O faclofen, droga antagonista GABAB, foi diluída em solução de cloreto de sódio 0,9% na concentração de 1,0 mg/mL, sendo administrado IP em volume de 1,0 mL/kg.

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3.3 Procedimentos

Com 70 a 80 dias de idade, os ratos machos inexperientes foram colocados na Sala de Ciclo Invertido e mantidos em ciclo CE 12:12 h (luz acesa às 22:00 h), para adaptação do ciclo biológico, por no mínimo, 30 dias antes do início dos experimentos. As ratas iscas utilizadas na avaliação da motivação sexual também foram colocadas nesta sala após serem submetidas à ovariectomia e recuperadas da anestesia.

As observações comportamentais foram realizadas na Sala de Ciclo Invertido, iluminada com duas lâmpadas vermelhas (20 W), entre 12:00 h e 18:00 h.

Cada rato, com idade mínima de 100 dias, foi utilizado somente em um experimento.

3.3.1 Avaliação da Motivação Sexual

Para avaliação da motivação sexual dos machos foram utilizadas fêmeas, sexualmente receptivas (iscas), submetidas a uma cirurgia para retirada dos ovários e cio induzido pela administração de hormônios. Sucintamente, as ratas foram anestesiadas com 1,0

mL/kg de uma solução de cetamina e xilazina (1:2) administrada por via intraperitoneal (IP).

Após a constatação da anestesia, procedeu-se à tricotomia e a anti-sepsia da pele (com álcool e Riodeine® tópico), e a incisão no flanco direito para exposição do ovário; fez-se, então, uma ligadura no ligamento meso-ovariano com fio de algodão preto e retirou-se a gônada com auxílio de um bisturi. A seguir, procedeu-se a sutura do peritônio, tecido subcutâneo e pele 24

com pontos contínuos. Repetiu-se o mesmo procedimento para a retirada do ovário esquerdo, e ambas as feridas cirúrgicas foram tratadas com Vetaglós® pomada. No período pós-operatório imediato as fêmeas foram colocadas individualmente em caixas de polipropileno com tampa metálica medindo 30 x 20 x 13 cm forradas com maravalha, sob luz para mantê-

las aquecidas até a recuperação da anestesia quando, então, foram levadas para a Sala de Ciclo Invertido. As quatro ratas foram tratadas com paracetamol, conforme descrito no item 3.2.

Após quatro a cinco dias, uma vez constatada a cicatrização da ferida cirúrgica, estas ratas foram todas transferidas para uma caixa de polipropileno com tampa metálica medindo 40 x 50 x 20 cm, e mantidas nesta sala até o experimento.

Estas fêmeas foram utilizadas como iscas (ou incentivos) após 21 dias, no mínimo, tempo este necessário para a eliminação dos hormônios circulantes e adaptação ao ciclo de luz invertido (AGMO; PAREDES; FERNÁNDEZ, 1987; RODRIGUES-ALVES, 2003).

A receptividade sexual das ratas foi induzida pela administração de 50 µg/kg de 17β estradiol e 2,0 mg/kg de progesterona, 54 e 6 horas, respectivamente, antes do início de cada sessão experimental, e testada colocando-se a fêmea com um macho sexualmente ativo (isca) na caixa para observação de comportamento sexual, permitindo-se a realização de algumas montas e observando-se a presença de lordose nas ratas, ou seja, a presença simultânea de flexão côncava do dorso, desvio lateral da cauda e extensão do pescoço (SÖDERSTEN, 1978; SÖDERSTEN; ENEROTH, 1980; SÖDERSTEN et al., 1986). Estas ratas iscas podem ser reutilizadas somente após um intervalo de duas semanas.

A arena para observação da motivação sexual é redonda, com diâmetro de 80 cm, contornada por uma parede de 30 cm de altura, exceto na região de fronte aos compartimentos dos animais iscas (ou incentivos). Estes compartimentos, diametralmente opostos, medem 30 x 30 x 30 cm; suas paredes laterais e a do fundo são fechadas e sua parede 25

frontal, aberta para a arena, possui uma grade de metal (malha de 12 mm2) que permite apenas contato visual e olfativo entre os animais iscas e teste. Durante a observação foi colocada maravalha de madeira sobre o piso destes compartimentos.

A arena, bem como os compartimentos dos animais iscas, são pintados de branco, com exceção da grade de metal que é de cor cinza; no piso em frente a cada compartimento, é delimitada, com linhas pretas, a zona de incentivo (ZI) com 30 x 20 cm.

Este aparelho fica apoiado sobre pés com 60 cm de altura (Fig. 1).

Uma semana antes do teste, os ratos inexperientes foram familiarizados com a arena de observação, porém sem a presença dos ratos iscas; para tanto foram colocados individualmente para explorá-la, por cinco minutos em três dias consecutivos (AGMO, 2003).

Para o teste da motivação sexual os ratos iscas, uma fêmea receptiva (incentivo sexual) e um macho sexualmente experiente (incentivo social), foram colocados nos compartimentos contíguos à arena 20 min antes do início das observações dos animais testes.

Cada rato a ser testado foi colocado individualmente no centro da arena e observados por 20

min, sendo avaliados os seguintes parâmetros: tempo em segundos de permanência nas zonas de incentivo da fêmea (ZIF), e do macho (ZIM); freqüência de visitas a cada ZI (número de vezes que o animal entra com as quatro patas na ZIF ou ZIM).

A partir destes dados foram calculados a média de duração das visitas à ZIF ou ZIM e o escore de preferência, que consiste na razão entre o tempo de permanência na ZIF e o tempo total de permanência nas duas ZI, ou seja:

tempo de permanência na ZIF

Escore de Preferência =

tempo de permanência na ZIF + tempo de permanência na ZIM

index-42_1.jpg

index-42_2.png

26

30 cm

30 cm

80 cm

20 cm

ZI = Zona de Incentivo

Figura 1 – Ilustrações esquemática da arena para avaliação da motivação sexual

index-43_1.png

27

3.3.2 Avaliação do Desempenho Sexual

O desempenho sexual foi avaliado por meio do teste de ereção peniana induzida pela apomorfina (MELIS; MAURI; ARGIOLAS, 1994; ANDERSEN; TUFIK, 2004). Este teste foi realizado em uma caixa confeccionada em vidro, medindo 30 x 30 x 30

cm, com a parede posterior de espelho. Esta caixa fica apoiada em quatro pés de metal com 10

cm de altura, sobre um espelho plano com 40 x 40 cm. (Fig. 2).

Figura 2 – Ilustração esquemática da caixa para observação da ereção peniana.

28

Os animais foram colocados individualmente na caixa imediatamente após a aplicação SC de 80 µg/kg de apomorfina e observados por uma hora. Considerou-se ereção peniana quando o rato se levantou sobre suas patas posteriores, inclinou-se para frente até alcançar a área genital, manipulou seu pênis em ereção total, com ligeiros movimentos pélvicos (Fig. 3)

index-45_1.png

29

Figura 3 – Ilustração do rato em ereção peniana.

30

Os parâmetros avaliados foram: latência para primeira ereção peniana medida em minutos e freqüência de ereções penianas. Para que as latências de todos os ratos pudessem ser consideradas nos cálculos estatísticos, foram convertidas em escores, conforme descrito na Tab. 1.

Tabela 1 – Escores atribuídos à latência para

primeira ereção peniana (EP) observadas em

minutos, de ratos tratados com 80 µg/kg de

apomorfina.

Escore Latência

(min)

1

0 a 10minutos

2

11 a 20 minutos

3

21 a 30 minutos

4

31 a 40 minutos

5

41 a 50 minutos

6

51 a 60 minutos

7

Ratos que não apresentaram EP

31

3.3.3 Avaliações Neuroquímicas

Para a realização das dosagens neuroquímicas os ratos foram submetidos à eutanásia por decapitação, o cérebro foi retirado do crânio e lavado em solução de cloreto de sódio 0,9% gelada (4ºC), sendo, em seguida, dissecado sobre placa de gelo, rodeado por gelo seco. As amostras encefálicas de interesse (hipotálamo e estriado) foram colocadas separadamente em tubos de polipropileno do tipo eppendorf e estocados em nitrogênio líquido (-80ºC); todo este procedimento foi realizado, no máximo, em 3min.

No final dos sacrifícios os tecidos cerebrais foram pesados e diluídos em uma solução de ácido perclórico 0,1 M (8,68 mL de ácido perclórico, 200 mg de metabissulfito de sódio (Na2S2O5), 200 mg de ácido diaminoetilenotetracético dissódico (EDTA), q.s.p.

1000mL de água MilliQ). Antes da diluição, para cada 50 mL de ácido perclórico são adicionados 10 µL de 3,4 diidroxibenzilamina (DHBA). O DHBA foi escolhido como padrão interno por ter as mesmas características físico-químicas que as monoaminas a serem dosadas.

Isto feito, o material foi homogeneizado por sonicação (caneta sonicadora – Lab Line Instruments), durante 2 ou 3 minutos sob refrigeração com gelo seco.

Os homogenatos obtidos foram conservados em geladeira por toda a noite ( overnight) para a precipitação de proteínas e ácidos nucléicos, interferentes nas amostras. Na manhã seguinte o material foi centrifugado a 11.000 giros por 20 minutos. Os sobrenadantes foram retirados, devidamente acondicionados em tubos tipo eppendorf e mantidos em freezer (–80 ºC) até o momento da análise das aminas, que foram realizadas em uma semana.

As monoaminas, dopamina (DA), seus metabólitos ácido homovanílico (HVA) e ácido 4,4-diidroxifenilacético (DOPAC); serotonina (5-HT) e seu metabólito ácido 5-hidroindol, 3-acético (5HIAA), e noradrenalina (NOR) foram dosadas por Cromatografia 32

Líquida de Alta Eficiência (HPLC), com detector eletroquímico. Posteriormente foram calculadas as relações DOPAC/DA, HVA/DA e 5HIAA/5-HT como indicadores da taxa de renovação ( turnover) de DA e 5-HT, respectivamente.

O método HPLC utilizado foi previamente descrito por Felício et al. (1996).

Utilizou-se um cromatógrafo líquido acoplado a um detector eletroquímico (HPLC-ED; Shimadzu Modelo 6A). O HPLC-ED é composto de um recipiente injetor (válvula) de 20 µl, bombas de fluxo A e B, um sistema controlador (monitoramento de fluxo, pressão e temperatura), uma coluna cromatográfica (C-18 medindo 150 x 4,6 mm com partículas de 5

µm – Shimpak) com filtro de linha, um detector eletroquímico e um integrador modulado Chromatopac. A técnica utilizada é a de cromatografia em fase reserva com pareamento iônico. Esta técnica fundamenta-se na cromatografia de partição ou absorção. As condições de trabalho foram as seguintes: temperatura – 50 ºC; tempo de obtenção dos picos: até 24 min.

Cada amostra foi corrida por 28 min e o limite de detecção foi de 2 pg para DA, DOPAC, 5-HT, e 5-HIAA, e 20 pg para HVA.

A fase móvel para o HPLC utilizada, foi um sistema isocrático formado por um tampão citrato 0,02 M, metanol 92/8 (v/v), 0,12 nM EDTA sódico e 0,0556% de ácido 1-heptanosulfônico (HSA). O pH foi ajustado para 3 com ácido ortofosfórico (H3PO4). A fase móvel foi filtrada com membranas milipore de 0,22 µm em sistema à vácuo e de-aerada por 15 minutos com fluxo constante de um degaseificador a Hélio, antes de ser instalada no HPLC. Em seguida circulou no sistema cromatográfico fechado por 12 horas ( overnight) para estabilização da coluna e da linha de base, operando em fluxo constante de 1,0mL/min. O

detector foi mantido com um potencial de 0,8 V no eletrodo de trabalho.

A caracterização das diferentes substâncias analisadas se dá pelo tempo de retenção, reflexo da polaridade destes compostos. Desta forma, substâncias mais polares se retêm menos na sílica da coluna, apresentando um tempo de retenção menor.

33

Os padrões das monoaminas em concentrações de 1 nM de dopamina e seus metabólitos DOPAC e HVA, serotonina e seu metabólito 5HIAA, e de noradrenalina são diluídos em solução de ácido clorídrico 0,1 M contendo 0,02% de Na2S2O5, distribuídos em tubos de polipropileno do tipo eppendorf de 1,5 ml e em seguida congelados em freezer

–80 ºC por período não superior a 2 meses. No momento da análise os padrões foram descongelados e diluídos 2500 a 10.000 vezes com solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1 M.

Todos os dias antes do início das corridas analíticas, os padrões diluídos foram injetados intercaladamente, e também no final das dosagens dos homogenatos. A curva de calibração é obtida com o auxílio de 3 concentrações diferentes de padrão.

Para a dosagem dos aminoácidos, 100 µL dos homogenatos de cada amostra armazenados em tubos tipo eppendorf foram acondicionados em caixa térmica com nitrogênio líquido e levadas para o Instituto Butantan (Unidade de Bioquímica e Biofísica - Dr.Ivo Lebrun), onde foram liofilizadas e armazenadas. No momento das dosagens dos aminoácidos (GABA, GLU, GLI e aspartato), as amostras foram novamente diluídas.

Para a avaliação dos aminoácidos empregou-se derivação com fenil-isotiocianato e HP LC (HP modelo Chemstation série 1100) com coluna 4,6 x 250 nm Beckman 5µ Ultrasphere ODS-PHT, e um injetor de amostras (válvula para 1,0 mL). O limite de detecção para os aminoácidos foi de 20 pg (HEINRIKSON; MEREDITH, 1984).

34

3.4 Análises Estatísticas

Foi empregado o software GraphPad Instat v2.01© para a realização das seguintes análises estatísticas:

- Teste de Bartlett: foi empregado para avaliar a homocedasticidade dos dados;

- Análise de variância ANOVA mono-caudal, para dados paramétricos, seguida do teste de múltiplas comparações de Tukey-Kramer para comparação entre as médias de três ou mais grupos;

- Método de Kolmogorov e Smirnov para avaliar se as populações seguem a distribuição de Gauss, para comparação entre dois grupos;

- Teste t não pareado mono-caudal, com correção de Welch para comparação das médias entre dois grupos.

- Teste U para dados não paramétricos, comparando-se dados de dois grupos.

O nível de significância crítico admitido para rejeição da hipótese de nulidade foi de uma probabilidade de 5% (p<0,05) em todas as análises empregadas.

35

4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS

4.1 Experimento 1 Efeitos da moxidectina na motivação sexual de ratos Os ratos foram distribuídos em dois grupos: um controle com sete animais e um experimental com oito. Os ratos de ambos os grupos, por serem inexperientes, foram colocados individualmente na arena de observação para exploração do ambiente, por 5 min em três dias consecutivos, na ausência dos animais iscas, conforme descrito no item 3.3.1.

Uma semana depois, os ratos do grupo experimental receberam 0,2 mg/kg de MOX (SC) e os animais do grupo controle receberam 0,1 mL/kg de óleo de amêndoas pela mesma via, sendo avaliada a motivação sexual após 72 h. Para tanto, os animais iscas, isto é, uma fêmea receptiva e um macho sexualmente experiente foram colocados nos respectivos compartimentos, e após 20 min cada animal teste foi colocado individualmente na arena e observado por 20 min, sendo avaliados a freqüência de visitas e o tempo de permanência nas ZI demarcadas em frente aos ratos iscas, posteriormente foram calculados o escore de preferência e a média de duração das visitas a cada ZI, conforme descrito no item 3.3.1.

A Tabela 2 e Figura 4 mostram os efeitos da MOX na motivação sexual dos ratos. Nota-se que não houve diferenças significantes entre os grupos controle e experimental em nenhum dos parâmetros avaliados. Por outro lado, observa-se que tanto os ratos do grupo controle como aqueles do grupo experimental tiveram preferência pelo incentivo sexual, pois o tempo de permanência e a média de duração das visitas na Zona de Incentivo do Macho (ZIM) foram significantemente menores àquelas da Zona de Incentivo da Fêmea (ZIF).

36

Tabela 2 – Efeitos da administração de 0,2 mg/kg de moxidectina (MOX) em parâmetros de motivação sexual de ratos observados 72 h após o tratamento. São apresentadas as médias e os respectivos erros padrões; n = número de animais.

Grupos

Parâmetros

Controle

MOX

(n = 7)

(n = 8)

Tempo de permanência na ZIF (s)

693,86 + 69,17

705,13 + 70,82

Tempo de permanência na ZIM (s)

259,71 + 68,05a 236,00 + 50,72a

Média de duração das visitas à ZIF (s)

40,83 + 3,09

30,49 + 3,78

Média de duração das visitas à ZIM (s)

17,72 + 3,52a

17,21 + 3,40a

Freqüência de visitas à ZIF

18,71 + 1,02

21,25 + 3,28

Freqüência de visitas à ZIM

13,86 + 1,2

16,38 + 3,70

Escore de preferência

0,73 + 0,07

0,74 + 0,06

ap<0,05, teste t de Student, em relação à ZIF; p>0,05 Teste U (escore).Zona de incentivo da fêmea (ZIF); Zona de incentivo do macho (ZIM); segundos (s); 37

Permanência

Visitas às Zonas de Incentivo

nas Zonas de Incentivo

25

800

20

ia

600

)

c

s

n 15

po ( 400

a

m

eqüê 10

e

a

T

Fr

200

5

ZIF

ZIM

ZIF

ZIM

ZIF

ZIM

ZIF

ZIM

0

0

C MOX

C MOX

Grupos

Grupos

Média de duração das visitas

nas Zonas de Incentivo

Escore de preferência

45

1.00

)s 30

0.75

o (

s

a

p

a

re

m

oc 0.50

Te

Es

15

0.25

ZIF

ZIM

ZIF

ZIM

0

0.00

C MOX

C MOX

Grupos

Grupos

Controle

Moxidectina