Introdução à biocristalografia com o estudo estrutural da quinase dependente de ciclina 2 (CDK2)... por Walter Filgueira de Azevedo Junior - Versão HTML

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INTRODUCAo A BIOCRISTALOGRAFIA COM 0 ESTUDO

ESTRUTURAL DA QUINASE DEPENDENTE DE CICLINA 2 (CDK2)

COMPLEXADA COM INIBIDORES

USP J IFQS(; ,f SB!

111111111111111111111

1111111111 11111 11111 III!!II!

a-2..001~64

Tese apresentada ao Instituto de Fisica

de Sao Carlos, da Universidade de Sao

Paulo, para obtenc;ao do titulo de Doutor

em Ciencias: Fisica aplicada.

Sao Carlos

1997

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Azevedo, Walter Filgueira de, Jr.

Introdu~ao it Biocristalografia com 0 estudo estrutural da

quinase dependente de ciclina 2 (CDK2) complexada com inibidores/

Walter Filgueria de Azevedo Junior. --Sao Carlos, 1997.

148 p.

1. Cristalografia 2. Proteinas.

I. Titulo.

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Av. Dr. Carlos botelho. 1465

CEP 13560-250 - Sao Carlos - SP

Brasil

Fone (016) 274-3444

Fax (016) 272-2218

MEMBROS DA COMISSAO JULGADORA

DA TESE DE DOUTORADO DE WALTER

FILGUEIRA DE AZEVEDO JUNIOR APRESENTADA AO INSTITUTO DE FfslCA DE

SAO CARLOS, UNIVERSIDADE DE SAO PAULO, EM 23/04/1997.

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A realiza980 desta tese foi possivel gra98s ao suporte dado pelas Institui96es de

apoio a pesqwsa: FAPESP. FINEP, CNPq e ao Department of Chemistry, University of California at Berkeley e Departamento de Fislca e Informatica do Instltuto de Fislca de Sao Carlos da Universidade de Sao Paulo.

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Dedico este trabalho ao meu filho

Linus, a minha esposa Elma e

aos meus pais Walter e Marion.

index-6_1.png

-A profa. Ora. Yvonne Primerano Mascarenhas, pela orienta<;8o,ensinamentos,

apoio e amizade, sem os quais este trabalho nao seria possivei.

-Ao Prof. Dr. Sung-Hou Kim (University of California at Berkeley) que tao gentilmente me aceitou em seu laboratorio e meu deu a oportunidade de

aprender e participar de um projeto de pesquisa tao interessante.

-A Ora. Jaru Jancarick ( University of California at Berkeley) pela amizade e valiosos ensinamentos sobre cristaliza<;8o de macromoleculas biol6gicas.

-Ao Prof. Dr. R. K Arni (IBILCElUNESP S. J. Rio Preto) pela a amizade e

confian98 no meu trabalho.

-Aos Professores Dr. Eduardo Ernesto Castellano, Dr. Glaucius Oliva,

Dr. Julio Zukerman-Schpector, Dr. Richard Charles Garratt e Dr. Eduardo

Horjales Reboredo pelos valiosos ensinamentos cristalograficos.

-Ao amigo Fernando Cachucho da Silva pela amizade e companherismo que

compartilhamos durante todos estes anos.

-Aos colegas bolsistas do grupo de cristalografia: Maria Teresa da Silva

Giotto, Valma Martins Barbosa, Dulce Helena Ferreira, Maria Cristina

Comuniam Ferraz, Norma Bianca Sais Cretelli, Marcos Roberto de Mattos

Fontes, Luis Fernando Delboni, Jose Geraldo Nery, Andre Mauricio Brinatti, Paulo

Sergio Lopes de Oliveira, Ezequiel Horacio Panepucci, Jorge lulek e Jose

Dalton

Cruz Pessoa, pelo apoio, estimulo e amizade.

-Aos tecnicos Sr. Carlos A. Trombella, Wanda Dragheta Perussi de Jesus e Jose

Augusto Lopes da Rocha, pela colabora<;8o na parte pratica.

-A secretaria Maria Helena Braga de Carvalho, pela ajuda e amizade.

-Ao halo pelas c6pias.

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LIST A DE FIGURAS

LIST A DE Ti\BELAS

LIST A DE ABREVlA TURAS

RESUMO

ABSTRACT

T~'TRODUCAO

CAPITULO

1- BREVE

INTRODUCAO

As BASES MOLECULARES

DA PROGRESSAO

DO

CleLO CELULAR

4

1.1 - MilOS\: e as fases do cicio celular

6

1.2 - Bases moleculares do cancer

6

1.3 - Comroie da progressao do cicio celular

7

1.4 - /\ rcgulal;ao da divisao cclular

g

1.5 - As dlvcrsas causas do cancer

11

1,(-,- p5:' (1 "Guardi50 do genoma"

P

CAPiTULO:2

INTRODUC;AO

AOS

METODO~

PARA

PURIFICAc;Ao

D~

MACROMOLECUL.\S BIOLOGICAS

1(,

2. i - Imrodw;.:ao a purifica<;:3o de macromolecuias

biologlCas

I b

2.2 - Cromatografia

16

2.2.1 - Cromatografia

de troca ionica

] 7

2.2.2 - FJJtra9ao em gel

23

2.2.3 - CromalOgrafia de afinidade

25

2.3 - Cromatografia

liquida de alto desempenho

26

2.4 - Sistema convencional

para purificarrao de macromoieculas

biologicas

26

2.5 - Detennina<;ao espectrofotometrica

das quantidades de proteinas e acidos nucleico5

..,""'

_/

2.6 - Eletroforeses

28

2.7 - Purificac,:ao da CDrc

CAPITULO ~ - CRISTALIZA('AO DE MACROMOLECULAS BIOLOGICt\S

3.1 - ImrodUl;:au

3.2 - PnnCtplos !!erais

~,I

para cnstaltzacao

de macromolecuiac;; hio!O!!ICaS

_

3.2.1 - Purcz.::lcia macromolccula

biologica

3.2.2 - Solubiiidade e Suoersaturac;ao

3.2.3 - Nuclcadio.

,

. crescimento

e ccssadlo

,

de crcscimento

:;.~ - Conceno;" sobre soiubilidade

3 ...1 - Solubilidade

de macromo16culas

bio16gica.<...

3.5 - ,\U/tlnl!-1Ii C :,,·altlll!.!-oUi

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3.: ; - U meWG,) ill matnz. esparsa fFatoriai!

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3.11.1 - Aplicayao do metoda da matriz esparsa

50

3.12 - 0 metodo da matriz esparsa passo a passo

51

3.12.1 - Regras gerais para a aplicayao do metodo da matriz esparsa

52

3.12.2 - Experimento inicial de cristalizayao usando 0 metodo da matriz esparsa

52

3.12.3 - Melhoria das condiyoes de cristalizayao

53

3.12.4 - Exemplo de cristalizayao de uma macromolecu1a biol6gica

54

CAPITuLO 4 - DIFRACAO DE RAIOS-X

55

4.1- Introduyao

55

4.2- Espalhamento Thomson

55

4.3- Espalhamento Compton

56

4.4- Espalhamento por eletrons

56

4.5- Fater de espalhamento at6mico

57

4.6- Espalhamento de raios-X por uma molecula

59

4.7- Espalhamento de raios- X por urn cristal

. 60

4.8- Espayo reciproco

62

4.9- Lei de Friedel

66

4.10- Densidade eletr6nica

67

4.11- 0 problema da fase

68

CAPITuLO

5 - PREP ARO E COLETA DE DADOS DE DIFRACAo

DE RAIOS X DOS

CRISTAIS DE CDK2 EM COMPLEXO COM INIBIDORES

69

5.1 - Introduyao

69

5.2 - Embebiyao (sooking) e co-cristalizayao de complexos binarios de CDK2 com dois inibidores

69

5.3 - Montagem dos cristais do complexo CDK2-Roscovitine

71

5.4 - Danos por radiayao

72

5.5 - Crio-cristalografia

73

5.6 - Sistema de coleta de dados R-AXIS TIC

78

5.6.1 - Anodo rotat6rio

80

5.6.2 - Cristal monocromador

80

5.6.3 - Espelhos focalizadores

81

5.6.4 - Colirnador

81

5.6.5 - Camara de oscilayao

83

5.6.6 - Placa de imagem

89

5.7 - Coleta e processamento de dados usando 0 R-AXIS IIC

90

5.7. 1 - Alinhamento do cristal

92

5.7.2 - Coleta e processamento das imagens Still

93

5.7.3 - Coleta e integrayao das imagens de oscilayao

96

5.7.4 - Escalonamento das imagens

100

5.8 - Resoluyao

103

5.9 - Informayoes sobre a coleta de dados dos cristais de CDK2-DFP e CDK2-Roscovitine 103

CAPITULO

6 - ESTRUTURAS

DA

CDK2

HUMANA

EM

COMPLEXO

COM

DOIS

INIBID ORE S

104

6. 1 - Introduyao

104

6.2.1 - Substituiyao molecular

104

index-9_1.png

6.2.2 - Detennina~aoda estrutura do complexoCDK2-DFP

111

6.3 - Refinamento

112

6.3.1 - Refinamentoda estrutura do complexoCDK2-DFP

116

6.3.2 - Refinamentoda estrutura do complexoCDK2-Roscovitine

118

6.4 - ConfoI'Ill3¢ogeral da proteinae mecanismocatalitico

120

6.5 - ConfoI'Ill3¢odo inibidorDFP no bolsao de ligayao

125

6.6 - Confonnayao do inibidorRoscovitineno bolsao de ligayao

131

6.7 - Complementaridadegeometrica

131

CAPiTuLO 7 - CONCLUSAO

135

7.1 - Introduyao

135

7.2 - InterayaoCDK2 e DFP

135

7.3 - Intera~aoCDK2 e Roscovitine

137

7.4 - Comparay5esentre os cinco ligantesde CDK2

137

7.5 - Considera~6es~s

142

REFERENCIASBIBLIOGRAFICAS

144

APENDICE 1 - CONDICOESDE CRISTALIZACAODO METODODA MATRIZESPARSA

APENDICE 2 - ARQUIVOSDE TOPOLOGIAUSADOS NO REFINAMENTODO DFP

APENDICE 3 - ARQUIVOS DE

TOPOLOGIA USADOS NO REFINAMENTO DO

ROSCOVITINE

index-10_1.png

Figura 1.1. As fases do cielo celular

4

Figura 1.2. As fases da mitose

5

Figura 1.3. Diagrama simplificado da participayao dos complexos de cielina com CDK nas diferentes fases do cielo celular

7

Figura 1.4. Etapas na ativayao e desativayao do complexo CDK2-Ciclina A

10

Figura 1.5. Etapas na ativayao e desativayao do complexo CDC2-Ciclina B

11

Figura 1.6. Etapas na ativayao e desativayao da p53

14

Figura 2.1. llustrayao da troca i6nica

18

Figura 2.2. Separayao por troca i6nica

19

Figura 2.3. Misturador de gradiente, usado para gerar gradientes lineares

21

Figura 2.4. F6rmula quimica dos trocadores i6nicos baseados em celulose

22

Figura 2.5. Diagrama esquematico mostrando a evoluyao do processo de filtrayao em gel 23

Figura 2.6. Coluna de afinidade

25

Figura 2.7. Diagrama esquematico mostrando os componentes basicos de urn sistema de purificayao de macromoleculas biol6gicas

27

Figura 3.1. Passos envolvidos na resoluyao de uma estrutura tridimensional por difrayao de raios X

33

Figura 3.2. Fen6meno de salting-in

40

Figura 3.3. Contribuiyao dos efeitos eletrostatico e hidrof6bico sabre a solubilidade S

41

Figura

3.4. Descriyao

esquematica

de urn diagrama bidimensianal da solubilidade de uma

macromolecula bio16gica

44

Figura 3.5. Padrao das linhas de convecyao de urn fluido

46

Figura 3.6. Gotas de cristalizayao

48

Figura 3.7. Montagem de uma gota de cristalizayao

50

Figura 4. 1. Espalhamento de raios X por urn eletron

57

Figura 4.2. Composiyao do vetor espalhamento S

57

Figura 4.3. Posiyoes at6micas em uma cela unitana

59

SERVl<~O

Dr:

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I:

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Figura 4.4. Diagrama de Argand mostrando a soma vetorial

60

Figura 4.5. Diagrama de Argand ilustrando 0 espalhamento total de uma molecuIa

61

Figura 4.6. Diagrama de Argand ilustrando a soma vetorial quando a fase e mUltiplode 21t 62

Figura 4.7. Esfera de Ewald

63

Figura 4.8. Diferenr;a de caminho 6tico

66

Figura 5.1. Estrutura dos inibidores de CDK2 estudados nesta tese

70

Figura 5.2. Capilar de quartzo

71

Figura 5.3. Montagem do crista!

73

Figura 5.4. Diagrama esquematico de urn sistema criogenico

75

Figura 5.5. Sistema criogenico instalado na Universityof California,Berkeley

76

Figura 5.6. Sistema criogenico instalado em Brookhaven, USA

77

Figura 5.7. Difrat6metro R-AXIS TIC

78

Figura 5.8. Anodo rotat6rio

80

Figura 5.9. Diagrama esquematico do espelho focalizador de raios X

81

Figura 5.10. Colimador de orificio mostrando 0 angul0 de maior divergencia

83

Figura 5.11. Movimento de ro~o

84

Figura 5.12. Geometria da camara de oscila~o

86

Figura 5.13. Porcentagem do espar;o reciproco

88

Figura 5.14. Espar;o reciproco

89

Figura 5.15. Sistema R-AXIS TIC

90

Figura 5.16. Perfil de integraryaodas reflexoes

99

Figura 6.1. Principais passos do algoritmo de substituiryaomolecular

110

Figura 6.2. Refinamento com X-PLOR

116

Figura 6.3. Mapa de densidade eletr6nica para CDK2-DFP

117

Figura 6.4. Mapa de densidade eletr6nica para CDK2-Roscovitine

119

Figura 6.5. Diagrama topol6gico da CDK2

121

Figura 6.6a. Estrutura da CDK2-ATP

122

Figura 6.6b. Superficie de acessibilidade ao solvente do complexo CDK2-ATP

123

Figura 6.7. Diferen~as conformacionais entre CDK2-ATP e CDK2-ATP Ciclina A

124

Figura 6.8. Estrutura do complexo CDK2-Ciclina A

125

index-12_1.png

Figura 6.9a. Estrutura do complexoCDK2-DFP

126

Figura 6.9b. Estrutura do complexoCDK2-Roscovitine

127

Figura 6.lOa.Bolsao de ligayaode ATP

128

Figura 6.lOb. Superposiyaodas moleculasde ATP e DFP

128

Figura 6.11. Contatos entre CDK2 com ATP (a) e CDK2 com DFP (b)

130

Figura 6.12. Bolsao de ligayaode ATP

132

Figura 6.13. Contatos entre CDK2 e Roscovitine

133

Figura 6.14. Superficiede acessibilidadeao solventepara CDK2-Roscovitine

134

Figura 7.1. Superficiede acessibilidadeao solventepara CDK2-DFP(GRASP)

139

Figura 7.2. Superficiede acessibilidadeao solventepara CDK2-Roscovitine(GRASP)

140

Figura 7.3. Formula moleculardos cincoligantes

141

index-13_1.png

Tabela 2.1. Trocadores ionicos

Tabela 2.2. Materiais comumente usados para filtra<;aoem gel

Tabela 2.3. Lista de tampaes utilizados na purifica<;ao da CDK2

Tabela 3.1. Panlmetros que afetam a cristahza9ao de macromoleculas biologica~

Tabela 3.2. Parametros da matriz de cristaliza<;ao

49

Tabela 5.1. Prob'Tamas usados para controle e processamento de dados

91

Tabela 5.2. Evoluc;ao da completeza dos dados do complexo CDK1-DFP

100

Tabela 5.3. Resumo das infonnac;oes sobre a coleta de dados

103

Tabela 6. ]. Unidades asslmetricas a sercm usadas para a procura rotaclOnaJ

107

Tabela 6.2. Estatistlca do refinamento

114

Tabela 7.1. Superficies de acessibilidade ao soivemc

138

index-14_1.png

ATP - Adenosina Tri-fosfato

CAI<.- CDK activating kinase, quinase ativadora de CDK.

CDC2 - Cell Division Cycle 2, Cido de Divisao Celular 2

CDC25 - Cell Division Cycle 25, Cido de Divisao Celular 25

CDK2 - Cyclin-Dependent Kinase 2, Quinase Dependente de Ciclina 2

CDK4 - Cyclin-Dependent Kinase 2, Quinase Dependente de Ciclina 4

CDKs - eyclin-Dependent Kinases, Quinases Dependentes de Ciclina

Cip - Cyclin inhibitory protein, proteina inibidora de ciclina

CKI - CDK Inhibitor, Inibidores de CDKs (proteinas inibidoras de CDKs)

DFP - Desdoro-flavopiridol

(inibidor de CDK2)

DNA - Deoxyribonucleic acid, acido desoxyribonud6ico.

INK4 - Inhibitory proteinfor CDK4, Proteina inibidora de CDK4.

IP A - Isopenteniladenina (inibidor de CDK2)

Kip - Kinase Inhibitory protein, proteina inibidora de quinases

PKA - cyclic AMP~pendent

protein kinase, quinase dependente de AMP ciclico, onde AMP e a

sigla para Adenosina Monofosfato.

index-15_1.png

RESUMO

o cicIo celular e controlado pela atividade das quinases dependentes de ciclinas ( Ciclin-dependent kinases, CDKs). As CDKs sac inativas como monomeros, e a sua ativa~ao necessita da liga~o as ciclinas, uma familia diversa de prote1nas cujos os niveis oscilam durante 0 cicIo celular, e fosforila~ao pela CAK ( CDK-activating kinase) sobre urn residuo de treonina especifico. As CDKs sac capazes de fosforilar muitas proteinas que estao envolvidas nos eventos do cicIo celular, incIuindo histonas e proteinas supressoras de turnores como pRb. Alem da fun~ao de regula~ao positiva das ciclinas e CAK, muitas proteinas inibidoras de CDKs (CDK inhibitors, CIGs) tern side descobertas, tais como p16, p21 e p28. Visto que, a desregula~o das ciclinas elou altera~o ou ausencia de CIGs tern sido associadas com muitos canceres, ha urn forte interesse em inibidores quimicos de CDKs que possam ter uma fi.m~aoimportante na descoberta de novas familias de agentes anti-tumores.

Visto que, ATP e 0 autentico co-fator da CDK2 este pode ser considerado como urn "pseudo-composto lider" para a descoberta de inibidores de CDK2. Entretanto, ha duas preocupa~5es maiores a serem consideradas: compostos contendo adenina sac ligantes comuns para muitas enzimas nas celulas, desta forma, qualquer derivado de adenina podera inibir muitas outras enzimas nas celulas, segundo, qualquer composto altamente carregado como a ATP MO sera absorvido pelas celulas.

N6s descrevemos aqui as estruturas determinadas por difra~o de raios X da CDK2 em

complexo com dois inibidores diferentes, descIoro-flavopiridol(DFP) e Roscovitine. A estrutura do complexo binano CDK2-DFP foi resolvida por substitui~ao molecular e refinada ate urn Reactor = 20,3

% e a estrutura da CDK2-Roscovitine foi refinada ate urn Reactor = 18,0 %.

o descloro-flavopiridol e uma flavona com uma nova estrutura, comparavel aquelas de flavonas polihidroxiladas. Estudos previos mostraram que flavopiridol, urn flavon6ide, pode inibir canceres de mama e de pulmao. 0 Roscovitine e urn derivado de adenina e urn potente inibidor de CDK2. as dois inibidores sac inibidores competitivos contra ATP e se ligam ao bolsao de liga~ao de ATP da CDK2. A compara~ao das estruturas tridimensionais de CDK2-DFP e CDK2-Roscovitine com a de CDK2-ATP mostraram que 0 bolsao hidrof6bico de liga~ao de adenina tern a abilidade surpreendente de acomodar estruturas moleculares diferentes daquelas da ATP.

index-16_1.png

Cell cycle progression is tightly controlled by the activity of ciclin-dependent kinases (CDKs).

CDKs are inactive as monomers, and activation requires binding to cyclins, a diverse family of proteins whose levels oscillate during cell cycle, and phosphorilation by CDK-activating kinase (CAK) on a specific threonine residue. CDKs are able to phosphorylate many proteins that are involved in cell cycle events, including histones and tumor suppressor proteins like the retinoblastoma gene product pRb. In addition to the positive regulatory role of cyclins and CAK, many negative regulatory proteins ( CDK

Inhibitors, CIGs) have been discovered, such as p16, p21, and p28. Since deregulation of cyclins and/or alteration or absence ofCKIs have been associated with many cancers, there is strong interest in chemical inhibitors of CDKs that could play an important role in the discovery of new family of antitumor agents.

Since ATP is the authentic cofactor of CDK2 it can be considered as a "pseudo-lead compound" for discovery of CDK2 inhibitors. However there are two major concerns: adenine containing compounds are common ligants for many enzymes in cells, thus, any adenine derivatives may inhibit many enzymes in the cells: second, any highly charged compounds such as ATP will prevent them from uptake by cells.

We report here the x-ray structures of CDK2 in complex with two different inhibitors, deschloro-flavopiridol(DFP) and Roscovitine. The structure of the binary complex CDK2-DFP was solved by molecular replacement and refined to Rucwr of20.3% and the structure ofCDK2-Roscovitine was refined to Reactor = 18.0 %.

The deschloro-flavopiridol(DFP) is a flavone with a novel structure, compared to that of polyhydroxylated flavones. Previous studies have shown that flavopiridol, a flavonoid, can inhibit growth of breast and lung carcinoma cell lines. The Roscovitine is a adenine derivative and a potent CDK2 inhibitor. The two inhibitors are competitive inhibitors for ATP binding to CDK2 and bind to the ATP binding pocket ofCDK2. The comparison of the three-dimensional structures ofCDK2-DFP

and CDK2-Roscovitine with the CDK2-ATP shows that the hydrophobic adenine-binding pocket has a surprising ability to accommodate molecular structures that are different from ATP.

index-17_1.png

"I believe that the study of science, the learning of the scientific method by all people, will ultimately help the people of the world in the solution of our great social and political problems"

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BREVE INTRODU(:AO As BASES MOLECULARES DA

PROGRESSAO DO CICLO CELULAR

1. Introdm;ao.

o objetivo principal deste capitulo e apresentar brevemente algumas das proteinas

envolvidas na progressao do ciclo celular, especialmente aque1as envolvidas na transi~ao GdS e G2/M. 0 autor visa, desta forma, destacar a imporHincia das Quinases Dependentes de Ciclina (Cyclin Dependent Kinase) na progressao

do ciclo celular e mostrar

a

motiva~ao biol6gica que levou ao estudo estrutural das CDKs. Sem a ambi~ao de ser

completo

e sim de servir como urn indicativo

da importancia

destas

quinases

na

progressao do ciclo celular. 0 enfoque principal do capitulo esta sobre 0 papel chave das CDKs nos processos de transi~ao das fases do ciclo celular (G1 para S e G2 para M) e como a inibi~ao destas quinases pode ser uma ferramenta util na descoberta de novas drogas contra 0 cancer.

1.1 Mitose e as fases do cicio de divisao celular(Voet

& Voet, 1995).

o cicio celular e a sequencia de eventos que ocorre durante 0 tempo de vida da

ceIula eucari6tica. Ele e dividido em quatro fases distintas (Fig. 1.1).

1. Fase G1 que cobre a maior parte do ciclo celular.

2. Fase

S (para

sintese)

e 0 periodo

onde

ocorre

a sintese

de DNA

(acido

desoxibonucleico ).

3. Fase G2, durante esta fase a agora ceIula tetrapl6ide

com 4N cromossomos1,

se

prepara para a mitose, esta fase e relativamente curta em rela~ao as outras fases do cicio celular.

index-19_1.png

4. Mitose e divisao celular ocorrem no breve periodo da fase M.

A rnitose e dividida em pr6fase, metafase, anafase e tel6fase (Fig. 1.2). A pr6fase e caracterizada pelo espessamento e encurtamento dos cromossomos, e sua divisao em duas cromatides (cada uma delas equivale ao

cromossomo

original).

Na

metafase

0

centriolo

se

desloca

para

cada

p610

celular

e produz

uma

rede

de fibras

Profase

-

Metafase

fusiformes.

Na

anafase

as

fribras

Anafase

Te16fase

fusiformes

separam

as

cromatides

do

equador da celula. Ap6s a separa~ao, as

cromossomos,

reunem-se no interior de

Figura 1.1. As fases do cicio de divisao

urn novo nucIeo antes que 0 citoplasma se

celular.

divida (teI6fase)

e duas novas

ceIulas

sejam formadas. No final temos duas ceIulas-filhas dipl6ides, cada uma com 0 mesmo

numero, 2N, de cromossomos da celula-mae. 0 cicio celular para ceIulas em cultura ocupa tipicamente urn periodo de 16 a 24 horas. Contudo, 0 cicio celular para celulas diferentes de urn mesmo organismo multicelular pode variar de 8 horas a mais de 100 horas. A maior parte desta varia~ao ocorre na fase G1_ Alem disso, ha ainda celulas que nunca se dividem, tais como os neur6nios; estas assumem urn estado quiescente conhecido como fase Go-

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AnaIase

Tel6fase

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Membra.nl plasmatica

Membrana. nuclear

1.2. Bases rnoleculares

do cancer (Voet & Voet, 1995; Murray

et al.,1993).

As ceIulas do corpo normalmente permanencem sob desenvolvimento estritamente

controlado.

Desta

forma,

durante

embriogenesis,

as celulas

devem

se diferenciar,

proliferar, migrar, e mesmo morrer num arranjo espacial preciso e obedecendo

a uma

sequencia temporal para produzir urn organismo normal. Em adultos, as celulas de certos tecidos, tais como 0 epiteIio intestinal e os tecidos formadores

de sangue da medula,

continuam a proliferar. Contudo,

a maioria das celulas adultas do carpo permanecem

quiescentes, isto e, na fase Go do cicIo celular.

CeIulas ocasionamente perdem 0 controle de seu desenvolvimento e iniciam uma

proliferayao excessiva. Os tumares resultantes podem ser de dois tipos:

1. Turnores

benignos, tais como verrugas e sinais, estes crescem pela simples expansao

e geralmente permanecem encapsulados par uma camada de tecido.

2.

Turnores

rnalignos, ou canceres crescem de uma maneira invasiva e se espalham num

processo

chamado

metastase

onde colonizam

novos

locais no corpo.

Tumores

malignos sao quase que invariavelmete ameayas a vida, e sao responsaveis por 20%

das mortes nos Estados Unidos.

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o d'mcer, como urn dos malOres problemas de saude dos seres humanos, tern

recebido uma enorme aten~ao biomedica nas ultimas decadas. Ha aproximadamente

100

tipos diferentes de canceres, estando bem desenvolvidos os metodos para a detec~ao e tratamento,

e a epidemologia do cancer tern sido caracterizada extensivamente. Mas nos

estamos so come~ando a entender as bases moleculares desta cole~ao de doen~as. Como 0

cancer

pode

ser

considerado

como

resultante

de urn cicio celular

anormal,

nos

discutiremos alguns aspectos da progressao do cicio celular.

1.3. Progressao do cicio celular (De Bondt et af., 1993).

A progressao do cicio celular e control ado em dois postos distintos, urn anterior a replica~ao do DNA e outro anterior a mitose, em ambos os pontos 0 controle e exercido por CDKs (eyclin-Dependent

Kinases)

(Fig. 1.3). Estas proteinas sac inativas como

monomeros

e a sua ativa~ao requer a liga~ao de ciclinas, uma vasta familia de proteinas

cujo a concentra~ao oscila durante 0 cicio celular. 0 inicio da replica~ao e controlado pelo complexo

CDK2-Ciclina

A, enquanto 0 inicio da mitose e controlado

pe10 complexo

CDC2( Cell Division Cycle 2 )-Ciclina B. Alem da a~ao das ciclinas sobre as CDKs, e necessario

ainda a fosforila~ao

das CDKs para que as mesmas se tornem

ativas e

possibilitem a progressao

do cicio ce1ular. A fosforila~ao acontece sobre 0 residuo Thr

160 no caso da CDK2 e sobre Thr 161 no caso da CDC2. Os detalhes moleculares desta

ativa~ao serao discutidos adiante.

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Ciclina A +

CDK2

1.4. A regulaf;ao da divisao celular (Voet & Voet, 1995; De Bondt et af., 1993).

Quais sac os eventos moleculares que controlam a inicia<;ao da mitose (divisao

celular)? As primeiras pistas para a elucida<;ao deste processo vieram dos estudos de embri5es

de invertebrados

marinhos,

que revelaram

que uma classe de proteinas,

chamadas de ciclinas, se acumulavam constantemente

por todo 0 ciclo celular e entao

desapareciam

abruptamente,

pouco antes da anafase da mitose (Fig. 1.2). Embri5es de

mariscos tern dois tipos de ciclinas, ciclina A e ciclina B, os quais sac distinguiveis a partir de suas seqiiencias de amino acidos e pelos padr5es de acumula<;ao durante 0 cicio de divisao celular, ou seja, as ciclinas A e B, se acumulam durante diferente partes do ciclo celular (Fig. 1.3.). Proteinas hom6logas a estas ciclinas de mariscos tern sido encontradas em muitos eucariontes,

0 que nao e surpresa,

visto que, todas as ceIulas eucari6ticas

seguem 0 mesmo padrao de cicio celular (Fig. 1.1. e Fig. 1.2.).

A ciclina A se combina com uma proteina de 34-kD chamada quinase dependente

de ciclina 2, CDK2 (Cyclin-Dependent

Kinase 2), cuja a sequencia de amino-acidos indica

claramente

que se trata de uma proteina da familia das Ser/Thr quinases e que sac

altamente conservadas de levedura a humano. Estas quinases sac os reguladores centrais do ciclo celular. Elas agem fosforilando uma variedade de proteinas nucleares, entre elas histonas HI, muitas proteinas de oncogenes, e proteinas envolvidas na desmontagem do

index-23_1.png

nucleo celular e rearranjo do citoesqueleto.

Isto possivelmente inicia uma sequencia de

eventos que culmina com a replicayao do DNA, no caso das CDK2, e com a mitose no

caso da CDC2. Consideraremos estes dois casos independentemente.

A ligayao da cicIina A a CDK2 forma urn complexo parcialmete ativo, to davia,

esta nao e suficiente para a ativayao completa da CDK2. A proteina CDK2 e uma

fosfoproteina tambem, ou seja, ela necessita ser fosforilada para se tomar ativa. A CDK2

pode ser fosforilada nos residuos Thr 14, Tyr 15 e Thr 160. Sua ativayao e completa somente quando Thr 14 e Tyr 15 estao desfosforiladas e Thr 160 esta fosforilada. Os residuos Thr14, Tyr15 ocupam 0 bolsao de ligayao de ATP ( Adenosina Tri-fosfato) na CDK2, conforme foi identificado na estrutura resolvida por difrayao de raios X (De Bondt et ai., 1993). Urn cenario simplificado da participayao da CDK2 no cicIo celular (Fig. 1.4.) esta descrito a seguir:

1. A celula entra na fase G) do cicIo de divisao celular sem a presenya da cicIina A e com CDK2 defosforilada. Uma proteina conhecida com quinase ativadora de CDK, CAK

(CDK Activating Kinase) fosforiliza 0 residuo Thr160 da CDK2.

2.

A celula esta ainda na fase G) e os residuos Thr14 e Tyr15 sac fosforilados. A recem sintetizada ciclina A se liga a CDK2. 0 result ado e 0 complexo binario CDK2-cicIina A triplamente fosforilado. Este complexo e enzimaticamente inativo, pois os residuos Thr14 e Tyr15 evitam a ligayao de ATP ao complexo CDK2-cicIina A. Desta forma, 0

sistema como urn todo parece ser desenhado para manter CDK2 inativa enquanto

ciclina A se acumula durante a fase G) do cicIo celular.

3.

Uma desfosforilayao rapida e especifica dos residuos Thr14 e Tyr15 na fronteira G)/S

e executada pela fosfatase CDC25 (Cell Division Cycle 25). Esta desfosforilayao inicia a replicayao do DNA, a fase S do cicIo de divisao celular, ou seja, a fosfatase CDC25

ativa 0 complexo CDK2-cicIina A.

4. A ciclina A e proteolizada rapidamente num processo mediado por ubiquitina, seguida pela desfosforilayao da Thr160 da CDK2. Isto deixa CDK2 inativa, e 0 cicIo celular

esta agora na fase G2.

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Estes eventos esHio rnostrado na figura 1.4. Urn processo sernelhante ocorre para a mitose:

1. A ceIula entra na fase Gj com ciclina B ausente e a CDC2 (Cell Division Cycle 2) totalrnente desfosforilada. Ocorre entao a fosforizar;ao do residuo Thr161 da CDC2.

2.

A CDC2 e fosforilada tarnbern nos residuos Thr14 e Tyr15 e a recern sintetizada

ciclina B se liga it CDC2. Este complexo e inativo, e ciclina B continua a se acumular durante toda a fase S.

3. A desfosforilar;ao dos residuos Thr14 e Tyr15 na fronteira G2/M ativa 0 complexo CDC2-ciclina B e inicia a mitose.

4.

A ciclina B e proteolizada e CDC2 e desfosforilada no residuo Thr 161. Isto acaba com a atividade da CDC2, a ceIula, agora dividida, retorna a fase Gj do ciclo de divisao celular.

Todos as estapas para a ativar;ao da CDC2, acima descritas, estao ilustradas na

figura 1.5.

1.5. As diversas causas do cancer (Voet & Voet, 1995).

A maioria dos dinceres

sac causados por agentes que danificam 0 DNA ou

interferem

com sua replicar;ao ou reparo.

Estes incluem uma grande

variedade

de

substfmcias feitas pelo homem outras que ocorrem normalmente na natureza, conhecidas como substancias cancerigenas. Outro agente causador de danos ao DNA e radiar;ao que possua energia suficiente para quebrar certas ligar;5es quimicas. Por exemplo, quando uma celula e exposta a radiar;ao ultravioleta (200-300nm), como no caso de celulas epiteliais expostas por longo tempo ao Sol, temos a formar;ao de urn anel de ciclobutil entre os residuos

adjacentes

de timina na mesma fita de DNA.

Tais dimeros de pirimidina

distorcem

localmente os pares de base da estrutura,

de forma que, a replicar;ao e a

transcrir;ao

ficam comprometidas.

Alem destes

agentes,

acima mencionados,

temos

tambem virus que induzem a formar;ao de tumores malignos em seu hospedeiros.

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1.6. p53 0 "Guardiao

do Genoma" (Voet & Voet, 1995; Cho, et al., 1994).

A ideia que 0 gene p53

poderia

agir como

supressor

de tumores

surgiu

primeiramente quando foi descoberto que muta~6es no gene p53 ocorriam invariavelmente em individuos

com uma rara doen~a hereditaria

conhecida

como

sindrome

de Li-

Fraumeni, que causa uma alta susceptibilidade a uma variedade de tumores malignos,

particularmente

cancer de seio, que geralmente

se desenvolve antes dos 30 anos. 0

produto deste gene e uma fosfoproteina nuclear de 53-kD e que e encontrada mutada em aproximadamente

50% dos canceres humanos.

A fosfoproteina p53 se liga especificamente as fitas duplas de DNA. Experimentos

mostraram que a p53 e na verdade urn poderoso ativador de transcri~ao. Na realidade, todas as formas de p53 com muta~6es que estao implicadas no cancer, nao se ligam ao DNA. Entao, por que p53 e urn supressor de tumores? A pista vem da observa~ao de que celulas expostas a radia~ao ultra-violeta ou as substancias cancinorgenicas que danificam 0

DNA induzem a acumula~ao de p53 normal. A proteina p53 age como urn "guardiao do genoma",

monitorando

a integridade do mesmo. Se 0 genoma esta danificado p53 se

acumula, e ativa a trancri~ao do gene, Pic], cujo produto e uma proteina de 21-kD que se liga e inibe CDKs. Tal inibi~ao da atividade de CDK2, leva a celula a ficar presa na fase G\, 0 que da tempo para 0 reparo do genoma, visto que, a replica~ao nao teve inicio. Se 0

reparo do DNA nao e bem sucedido, a p53 pode ativar 0 suicidio da celula, urn processo chamado apoptose, com 0 objetivo de prevenir a prolifera~ao de celulas com 0 genoma danificado. Todos estes passos estao ilustrados na figura 1.6. A estrutura resolvida por difra~ao de raios X do complexo p53-DNA (Cho et aI., 1994) mostrou que dois residuos da proteina p53 que apareciam mutados na maioria dos casos de cancer, os residuos

Arg248 e Arg273, estao em contato direto com 0 DNA, 0 que explica sua importancia,

pois estes residuos sao necessarios para que a p53 se ligue ao DNA e ative a transcri~ao da protein a, p21, inibidora de CDK2.

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Radia~ao,

Agentes,

cancengenos

Prisao da

celula em Gl

Diversas outras proteinas inibidoras de CDKs, alem da p21, tern sido identificadas.

Estas

proteinas

podem

ser divididas

em duas

familias,

levando-se

em conta

as

sirnilaridades de sequencia e fun~ao. A familia das Kip/Cip ( Kinase inhibitOlY protein/

eye/in inhibitOlY protein) que inc1uen p21 (Harper, 1. W. et al., 1993), p27 (Toyoshima & Hunter,

1994) e p57 (Russo, A. A. et al., 1996), se ligam aos complexos CDK-Cic1ina, com preferencia por complexos envolvidos na passagem da fase G1 para S. Estas proteinas inibidoras podem se ligar a CDK ou Cic1ina isoladas, mas possuem mais alta afinidade pelos complexos CDK-Cic1ina. A outra familia denominada INK-I (INhibitOlY protein for cdK4), inc1uem as proteinas p15, p16, p18 e p19, e inibem CDK4 e uma isoforma,

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chamada CDK6, e tambem podem ser ligar it CDK e a Ciclina isoladas, ou ao complexo

CDK-Ciclina D ( Sherr & Roberts, 1995).

Os membros da familia Kip/Cip contem uma regiao de 65 arnino-acidos com boa homologia entre eles ( 38-44% de identidade) no N-terminal, esta regiao e necessaria e suficiente para se ligar e inibir complexos de CDK-Ciclina. Os carboxi-terminais

dos

membros desta familia de proteina inibidoras nao sao conservados entre eles (Sherr & Roberts, 1995).

Visto que, a ausencia de uma proteina inibidora de CDKs pode levar it formayao

de tumores cancerigenos, comeyou-se a procurar inibidores quimicos que pudessem fazer a funyao inibidora das proteinas p21, p57 etc ...

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CAPiTULO 2

INTRODUC;AO AOS METODOS PARA PURIFICAC;AO DE

MACROMOLECULAS

BIOLOGICAS

2.1. Introdu~ao a purifica~ao de macromoleculas biologicas.

No estudo estrutural de macromoleculas biologic as uma etapa muito importante

anterior it cristalizavao e a purificavao. Sendo que, na maioria das vezes, este processo de purificavao da macromolecula tern de ser elaborado e/ou aperfeivoado, ou simplesmente reproduzido

pelo biocristalognlfo.

Para 0 estudo estrutural por difravao de raios X sac

necessarios

muitas vezes, varios miligramas de material puro, 0 que faz com que 0

processo

de purificavao,

uma vez otimizado,

seja executado

repetidamente,

para a

produvao

de relativamente

grandes quantidades da macromolecula

biologica. No meu

estudo da CDK2 eu realizei 0 processo de purificavao da mesma proteina dezenas de

vezes e apos cad a preparavao tinhamos material para novos experimentos de cristalizavao.

Neste capitulo apresentaremos

alguns dos metodos mais utilizados na purificavao de

proteinas e acidos nucleicos. Como exemplo de alguns dos metodos discutidos neste

capitulo apresentamos 0 processo de purificavao da CDK2 humana.

2.2. Cromatografia (Voet & Voet, 1995; Kleinsmith & Kish, 1995).

A

principal