Mineralização in vitro de matrizes de colágeno aniônico derivadas de tecidos biológicos por Thelma Matuura de Batista - Versão HTML

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MINERALIZAÇÃO IN VITRO DE MATRIZES DE COLÁGENO ANIÔNICO

DERIVADAS DE TECIDOS BIOLÓGICOS

Thelma Matuura de Batista

Tese apresentada ao Instituto de

Química

de

São

Carlos,

da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Doutor em

Ciências (Química Analítica).

Orientadora: Profa. Dr. Ana Maria de Guzzi Plepis

São Carlos

2008

Dedicatória

Aos meus pais, Antonio Carlos e Catarina, pelo apoio e dedicação ao longo de toda

minha vida.

As minhas irmãs Georgea, Gláucia, Carina e a minha sobrinha Giovanna que mesmo

estando longe me apoiaram.

Agradecimentos

À minha orientadora, Profa. Dr. Ana Maria de Guzzi Plepis, pelo apoio à pesquisa e

pela confiança em mim depositada.

À Virginia Conceição Amaro Martins, pela amizade, incentivo, otimismo e pelo

auxílio na elaboração deste trabalho.

À Cláudia Bernal e à Profa. Dr. Janice Perussi pelas análises de citotoxicidade in

vitro.

À Oxetil e à Acecil pela esterilização das matrizes utilizadas nas análises de

citotoxicidade in vitro.

Aos amigos de laboratório em especial à Fabiana e Marília pela amizade, paciência e

incentivo.

A CAPES pela bolsa concedida.

Ao pessoal do CAQUI em especial ao Carlos Bento e ao Márcio.

A todo pessoal da biblioteca e da seção de alunos em especial à Sílvia e a Andréia.

A todos aqueles que, porventura, não tenham sido citados nominalmente, e que

tenham, de alguma forma, contribuído para este trabalho.

“Que os esforços desafiem as impossibilidades.

Lembrai-vos de que as grandes proezas da

história foram conquistadas do que parecia

impossível”.

Charles Chaplin

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 18

1.1. Biomateriais e engenharia de tecido ósseo .................................................................... 19

1.2. Tecido ósseo .................................................................................................................. 22

1.3. Hidroxiapatita (HA)....................................................................................................... 23

1.4. Colágeno ........................................................................................................................ 24

1.5. Matrizes de colágeno (MC) ........................................................................................... 30

1.5.1. Tecidos biológicos como fonte para matrizes de colágeno .................................... 31

1.5.1.1. Pele Porcina (PP) ............................................................................................. 31

1.5.1.2. Pericárdio Bovino ............................................................................................ 32

1.5.1.3. Serosa Porcina ................................................................................................. 34

1.6. Mineralização do colágeno ............................................................................................ 36

2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 39

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................... 40

3.1. Materiais ........................................................................................................................ 40

3.2. Limpeza dos tecidos utilizados...................................................................................... 40

3.3. Preparação de matrizes de colágeno aniônico (hidrolisadas) ........................................ 41

3.4. Mineralização das matrizes ........................................................................................... 42

3.5. Caracterização das matrizes........................................................................................... 46

3.5.1. Calorimetria Exploratória diferencial (DSC) ......................................................... 46

3.5.2. Termogravimetria (TG) .......................................................................................... 46

3.5.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ........................................................ 46

3.5.4. Difração de raios X (DRX)..................................................................................... 47

3.5.5. Espectroscopia por energia dispersiva (EDS) ........................................................ 47

3.5.6. Espectroscopia no infravermelho (FTIR) ............................................................... 47

3.5.7. Avaliação do potencial de citotoxicidade in vitro .................................................. 48

3.5.7.1. Cultura Celular ................................................................................................ 48

3.5.7.2. Método de difusão em ágar ............................................................................. 50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 52

4.1. Mineralização – Ensaio Piloto....................................................................................... 52

4.2. Avaliação Macroscópica das matrizes........................................................................... 55

4.2.1. Pele Porcina (PP) .................................................................................................... 55

4.2.2. Pericárdio Bovino ................................................................................................... 57

4.2.3. Serosa porcina ........................................................................................................ 58

4.3. Caracterização das matrizes........................................................................................... 60

4.3.1. Potencial de citotoxicidade in vitro ........................................................................ 60

4.3.2. Calorimetria Exploratória Diferencial .................................................................... 65

4.3.3. Termogravimetria ................................................................................................... 72

4.3.3.1. mresíduo/morgânica................................................................................................. 76

4.3.4. Dispersão de Raios X (EDS) .................................................................................. 77

4.3.5. Raios X ................................................................................................................... 79

4.3.5. FT-IR ...................................................................................................................... 81

4.3.7. Microscopia Eletrônica de Varredura..................................................................... 86

5. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 96

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 97

Apêndice 1- Curvas DSC ....................................................................................................... 106

Apêndice 2 – Curvas Termogravimétricas ............................................................................. 109

Apêndice 3 – Espectros no infravermelho.............................................................................. 112

Anexo I ................................................................................................................................... 115

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Organização hierárquica do osso. ............................................................................ 22

Figura 2. Arranjo atômico da hidroxiapatita. .......................................................................... 23

Figura 3. Estrutura da molécula de colágeno. ......................................................................... 25

Figura 4. Formação da fibrila de colágeno. ............................................................................. 26

Figura 5. Representação da formação intramolecular e intermolecular do colágeno.............. 27

Figura 6. Esquema de agregação das moléculas de tropocolágeno para a formação da

microfibrila. .............................................................................................................................. 28

Figura 7. Hidrólise alcalina dos grupos carboxiamidas dos resíduos de Asn e Gln................ 29

Figura 8. Resultante de carga líquida para o tropocolágeno para colágeno nativo (pontilhado)

e colágeno aniônico (preto) ...................................................................................................... 29

Figura 9. Pele porcina.............................................................................................................. 32

Figura 10. Pericárdio bovino. .................................................................................................. 33

Figura 11. Diagrama da seção transversal do intestino delgado de suínos. ............................ 34

Figura 12. Aspecto macroscópico: (A) SIS desidratada e (B) serosa porcina......................... 35

Figura 13. Fotomicrografia por MEV de SIS (A) e serosa porcina (B). ................................. 35

Figura 14. Fluxograma da preparação das matrizes. ............................................................... 42

Figura 15. Cela dupla utilizada para mineralização das matrizes. .......................................... 44

Figura 16. Método de imersão alternada. ................................................................................ 45

Figura 17. Suspensão das células. ........................................................................................... 49

Figura 18. Câmara de Neubauer. ............................................................................................. 50

Figura 19. Meio de cobertura com corante vermelho neutro (A) e matriz sendo colocada na

placa de petri (B). ..................................................................................................................... 51

Figura 20. Curvas termogravimétricas do método 1,5 SBF () 5 dias e () 10 dias. .......... 52

Figura 21. Curvas termogravimétricas de PP96SC em triplicata, obtida após a mineralização

pelo método II........................................................................................................................... 53

Figura 22. Fotomicrografia por MEV de PP96SC, obtida pelo método da cela dupla

termostatizada (aumento de 500 vezes).................................................................................... 54

Figura 23. Curvas termogravimétricas de PP96SC em triplicata obtida após mineralização

pelo método III. ........................................................................................................................ 54

Figura 24. Fotomicrografia por MEV de PP96SC, obtida pelo método de imersão (aumento

de 500 vezes). ........................................................................................................................... 55

Figura 25. Foto digital das matrizes (A) PPn, (B) PP96S e (C) PP96S mineralizada............. 56

Figura 26. Foto digital das matrizes pré-tratadas com solvente orgânico: (A) PP96 e (B)

PP96C. ...................................................................................................................................... 57

Figura 27. Foto digital das matrizes (A) PBn, (B) PB96 e (C) PB96C................................... 58

Figura 28. Foto digital das matrizes (A) SPn, (B) SP96 e (C) SP96C. ................................... 59

Figura 29. Avaliação macroscópica do controle positivo (A) e negativo (B). ........................ 60

Figura 30. Foto digital das células HEp-2 no controle positivo (A) e negativo (B)................ 61

Figura 31. Foto digital das matrizes derivadas de pericárdio bovino PB24 (A), PB24C (B),

PB96 (C) e PB96C (D). ............................................................................................................ 62

Figura 32. Foto digital das matrizes derivadas de serosa porcina SP24 (A) e SP24C (B),

SP96 (C) e SP96C (D). ............................................................................................................. 62

Figura 33. Foto digital das matrizes derivadas de pele porcina PP24S (A), PP24SC (B),

PP96S (C) e PP96SC (D). ........................................................................................................ 63

Figura 34. Foto digital da avaliação microscópica da matriz PP24S. ..................................... 64

Figura 35. Foto digital da avaliação macroscópica das matrizes derivadas de pele porcina

PP24 (A), PP24C (B), PP96 (C) e PP96C (D). ........................................................................ 65

Figura 36. Desnaturação do colágeno. .................................................................................... 66

Figura 37. Curva representativa da determinação de Td por DSC.......................................... 67

Figura 38. Curvas DSC dos tecidos com ou sem hidrólise alcalina (96h) e mineralizados, (A)

Pele Porcina, (B) Pericárdio Bovino e (C) Serosa Porcina....................................................... 68

Figura 39. Variação da Td de acordo com o tempo de hidrólise das matrizes (A) não

mineralizadas e (B) mineralizadas; derivadas de PP (), PB () e SP ().......................... 69

Figura 40. Curva TG/DTG das matrizes () sem tratamento, () hidrolisadas por 96h e ()

mineralizadas,  TG; ···· DTG. ............................................................................................... 73

Figura 41. Espectro de dispersão de raios X obtido da superfície da matriz PP96C. ............. 78

Figura 42. Difratograma de raios X das matrizes (A) PP96C, (B) PB96C, (C) SP96C.......... 80

Figura 43. Difratograma de raios X de HA sintética não cristalina ........................................ 81

Figura 44. Espectros no FTIR das matrizes PPn (A), PBn (B) e SPn (C)............................... 82

Figura 45. Espectros no FTIR das matrizes PP96C (A), PB96C (B) e SP96C (C)................. 84

Figura 46. Fotomicrografias das matrizes PP24 (A), PP48(B), PP72 (C) e PP96 (D), aumento

de 500 vezes.............................................................................................................................. 86

Figura 47. Fotomicrografias das matrizes PB24 (A), PB48(B), PB72 (C) e PB96 (D),

aumento de 500 vezes............................................................................................................... 87

Figura 48. Fotomicrografias das matrizes SP24 (A), SP48(B), SP72 (C) e SP96 (D), aumento

de 500 vezes.............................................................................................................................. 88

Figura 49. Fotomicrografia da secção transversal de PP96 (A), PB96(B), aumento de 500

vezes e SP24, aumento de (C) 3500 vezes . ............................................................................. 89

Figura 50. Fotomicrografia da matriz PP24C (A), PP48C (B), PP72C (C) e PP96C (D)

aumento de 5.000x.................................................................................................................... 90

Figura 51. Fotomicrografia da matriz PB24C (A), PB48C (B), PB72C (C) e PB96C (D)

aumento de 5.000x.................................................................................................................... 91

Figura 52. Fotomicrografia da matriz SP24C (A), SP48C (B), SP72C (C) e SP96C (D)

aumento de 10.000x.................................................................................................................. 92

Figura 53. Fotomicrografia da matriz PP24C, aumento de: (A) 20.000x e (B) 40.000X. ...... 93

Figura 54. Fotomicrografia do interior da matriz PP96C, aumento de: 200x. ........................ 94

Figura 55. Fotomicrografia do interior da matriz PB96C, aumento de 500x.......................... 94

Figura 56. Fotomicrografia do interior da matriz SP96C, aumento de 1000x. ....................... 95

Figura 57. Curvas DSC para as matrizes derivadas de pele porcina hidrolisadas e

mineralizadas: (A)24h, (B) 48h e (C) 72h. ............................................................................. 106

Figura 58. Curvas DSC para as matrizes derivadas de pericárdio bovino hidrolisadas e

mineralizadas: (A)24h, (B) 48h e (C) 72h. ............................................................................. 107

Figura 59. Curvas DSC para as matrizes derivadas de serosa hidrolisadas e mineralizadas:

(A)24h, (B) 48h e (C) 72h. ..................................................................................................... 108

Figura 60. Curvas termogravimétricas das matrizes derivadas de pele porcina hidrolisadas e

mineralizadas: (A) 24h, (B) 48h e (C) 72h. ............................................................................ 109

Figura 61. Curvas termogravimétricas das matrizes derivadas de pericárdio bovino

hidrolisadas e mineralizadas: (A) 24h, (B) 48h e (C) 72h...................................................... 110

Figura 62. Curvas termogravimétricas das matrizes derivadas de serosa porcina hidrolisadas e

mineralizadas: (A) 24h, (B) 48h e (C) 72h. ............................................................................ 111

Figura 63. Espectros no infravermelho das matrizes derivadas de pele porcina (A) PP24C,

(B) PP48C e (C) PP72C. ........................................................................................................ 112

Figura 64. Espectros no infravermelho das matrizes derivadas de pericárdio bovino (A)

PB24C, (B) PB48C e (C) PB72C. .......................................................................................... 113

Figura 65. Espectros no infravermelho das matrizes derivadas de serosa porcina (A) SP24C,

(B) SP48C e (C) SP72C. ........................................................................................................ 114

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação Ca/P de fosfatos de cálcio. ......................................................................... 23

Tabela 2. Matrizes de colágeno aniônico tipo I obtidas após hidrólise alcalina...................... 41

Tabela 3. Concentração iônica dos sais da solução utilizada .................................................. 43

Tabela 4. Matrizes de colágeno obtidas após mineralização pelo método de imersão alternada

.................................................................................................................................................. 45

Tabela 5. Valores dos diâmetros dos halos formados no controle positivo e negativo ........... 61

Tabela 6. Temperatura de desnaturação do colágeno presente nos tecidos e nas matrizes ..... 71

Tabela 7. Porcentagens de perda de massa das matrizes obtidas através de TG/DTG............ 73

Tabela 8. Relação massa inorgânica por massa orgânica das matrizes mineralizadas ............ 77

Tabela 9. Razão Ca/P dos sais depositados nas matrizes mineralizadas e hidrolisadas .......... 78

Tabela 10. Relação Ca/P dos principais tipos de fosfato de cálcio ......................................... 79

Tabela 11. Principais valores de d para as matrizes mineralizadas ......................................... 80

Tabela 12. Principais freqüências das bandas para o colágeno presente nas matrizes ............ 83

Tabela 13. Principais frequências das bandas para o colágeno mineralizado ......................... 85

Tabela 14 - Composição do meio ISCOVE’S. ...................................................................... 115

LISTA DE ABREVIATURAS

Asn - Asparagina

DSC - Calorimetria Exploratória Diferencial

DRX – Difração de raios X

EDS - Espectroscopia por Energia Dispersiva

EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético

FTIR – Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier.

Gln – Glutamina

Gly – Glicina

HA – Hidroxiapatita

Hyp – Hidroxiprolina

MC – Matriz de Colágeno

MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura

PB – Pericárdio Bovino

PB24 – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 24h

PB24C – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 24h Mineralizado

PB48 – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 48h

PB48C – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 48h Mineralizado

PB72 – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 72h

PB72C – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 72h Mineralizado

PB96 – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 96h

PB96C – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 96h Mineralizado

PBn – Pericárdio Bovino Nativo (não hidrolisado)

PBS – Tampão Fosfato Salino

PP – Pele Porcina

PP24 – Pele Porcina Hidrolisada por 24h

PP24C – Pele Porcina Hidrolisada por 24h Mineralizada

PP24S – Pele Porcina Hidrolisada por 24h sem Pré-Tratamento Orgânico

PP24SC – Pele Porcina Hidrolisada por 96h Sem Pré-Tratamento Orgânico, Mineralizada

PP48 – Pele Porcina Hidrolisada por 48h

PP48C – Pele Porcina Hidrolisada por 48h Mineralizada

PP72 – Pele Porcina Hidrolisada por 72h

PP72C – Pele Porcina Hidrolisada por 72h Mineralizada

PP96 – Pele Porcina Hidrolisada por 96h

PP96C – Pele Porcina Hidrolisada Por 96h Mineralizada

PP96C – Pericárdio Bovino Hidrolisado por 96h Mineralizado

PP96S – Pele Porcina Hidrolisada por 96h Sem Pré-Tratamento Orgânico

PP96SC – Pele Porcina Hidrolisada por 96h Sem Pré-Tratamento Orgânico, Mineralizada

PPn – Pele Porcina Nativa (não hidrolisada)

Pro – Prolina

SBF – Solução Simuladora de Fluido Corpóreo

SIS – Submucosa Intestinal Porcina

SP – Serosa Porcina

SP24 – Serosa Porcina Hidrolisada por 24h

SP24C – Serosa Porcina Hidrolisada por 24h Mineralizada

SP48 – Serosa Porcina Hidrolisada por 48h

SP48C – Serosa Porcina Hidrolisada por 48h Mineralizada

SP72 – Serosa Porcina Hidrolisada por 72h

SP72C – Serosa Porcina Hidrolisada por 72h Mineralizada

SP96 – Serosa Porcina Hidrolisada por 96h

SP96C – Serosa Porcina Hidrolisada por 96h Mineralizada

SPn – Serosa Porcina Nativa (não hidrolisada)

Td – Temperatura de Desnaturação

TG/DTG – Termogravimetria

RESUMO

A reconstrução de defeitos ósseos é um problema que afeta milhões de pessoas, que a

medicina tenta resolver. Uma alternativa para a solução deste problema tem sido o

desenvolvimento de biomateriais que atuem no processo de reparação óssea. O colágeno é um

polímero de origem natural capaz de promover cicatrização e regeneração óssea e juntamente

com a hidroxiapatita são os principais componentes encontrados no tecido ósseo. Vários

trabalhos têm sido reportados com matrizes mineralizadas de colágeno tipo I em diferentes

formas como em géis, membranas e esponjas, mas a mineralização in vitro de matrizes

acelulares com maior teor de mineralização obtidas de tecidos biológicos sem a perda da

estrutura colagênica não tem sido descrito. Este trabalho teve como objetivo a mineralização

in vitro e a caracterização de matrizes de colágeno aniônico obtidas de pele porcina,

pericárdio bovino e serosa porcina. Os tecidos foram tratados em temperatura ambiente com

solução alcalina por períodos variáveis de 0 à 96h e mineralizados pelo processo de imersão

alternada. Os materiais obtidos foram caracterizados pela avaliação preliminar da

citotoxicidade in vitro, termogravimetria (TG/DTG), calorimetria exploratória diferencial

(DSC), microscopia eletrônica de varredura (MEV), dispersão de raios X (EDS), difração de

raios X (DRX) e absorção no infravermelho (FTIR). Não foi observada citotoxicidade em

nenhuma das matrizes avaliadas, contudo foi necessário um pré-tratamento nas matrizes de

pele porcina para remoção de gordura. Os resultados de DSC mostraram a integridade da

matriz colagênica após o tratamento alcalino. O aumento no tempo desse tratamento diminui a

temperatura de desnaturação sendo observado um efeito maior nas matrizes de pele porcina

seguidas por pericárdio bovino e serosa porcina. A mineralização induz a um aumento na

temperatura de desnaturação em todos os casos. As curvas TG apresentaram perdas de massa

relacionadas à água presente no material, decomposição da proteína e carbonização do

material orgânico e um resíduo após 750 °C que foi associado ao material inorgânico presente

na forma de hidroxiapatita, sendo as matrizes de serosa porcina as de maior teor de

mineralização. As matrizes mineralizadas tendem a um aumento na estabilidade térmica do

colágeno quando comparadas com as matrizes hidrolisadas. Os espectros FTIR mostraram a

presença de íons fosfatos e a interação de íons cálcio com o colágeno. As relações Ca/P

obtidas por EDS foram aquelas esperadas em comparação com o valor teórico para

hidroxiapatita (HA) e resultados de DRX confirmaram a obtenção de HA amorfa como

principal produto de mineralização. Pelas fotomicrografias obtidas por MEV pôde-se observar

que as fibras de colágeno tornam-se mais desestruturadas quando há um aumento no tempo de

hidrólise e que a deposição de sais ocorreu de forma heterogênea, disposta em aglomerados

esféricos no formato de agulhas por toda a superfície e interior, exceto para matrizes

derivadas de pele porcina que não são mineralizadas internamente devido a sua espessura. Os

resultados demonstraram que é possível a mineralização in vitro de matrizes de colágeno tipo

I obtidas de diferentes tecidos biológicos em diferentes tempos de hidrólise, produzindo um

material com potencial de uso para regeneração óssea.

ABSTRACT

The reconstruction of osseous defects is still a problem that affects millions of people and

medicine tries to solve it. One alternative to solve these problems has been the development

of biomaterials that can be used as inductors in the osseous repair process. Collagen is a

natural polymer able to promote healing and bone regeneration, and among hydroxyapatite

(HA) is the main component found in bone tissue. Several mineralized collagen scaffolds are

described in literature, in the form of gel, membranes and films, however, in vitro

mineralization of acellular matrices, obtained from biological tissues without the loss of

collagenic structure, has not been reported. The objective of this work was the mineralization

and characterization of anionic collagen matrices obtained from porcine skin, bovine

pericardium and porcine serosa. Biological tissues were treated at room temperature for 0-96h

in alkaline solution and mineralized by alternate soaking method. Materials were

characterized by preliminary assay of in vitro cytotoxicity, differential scanning calorimetry

(DSC), termogravimetric analysis (TG/DTG), scanning electronic microscopy (SEM), energy

dispersive x-ray analysis (EDS), x-ray diffraction (XRD), and Fourier Transform Infrared

Spectroscopy (FTIR). No cytotoxicity was observed in any of the evaluated matrices;

however, a pre-treatment of porcine skin matrices, for fat removal, was necessary. DSC

results showed the integrity of collagen matrices after alkaline treatment. Denaturation

temperature is dependent of time of alkaline treatment, and this effect is greater for porcine

skin matrix, followed by bovine pericardium and porcine serosa. TG/DTG curves showed

weight losses associated with release of water, degradation of protein structure and

combustion of residual organic components. Residues were obtained at 750°C and associated

to hydroxyapatite, being porcine serosa matrix the most mineralized. All mineralized matrices

showed an increase in collagen thermal stability when compared to hydrolyzed matrices.

FTIR spectra showed the presence of phosphate ions and the interaction of calcium ions with

collagen. Ca/P ratios obtained by EDS were as expected when compared with literature values

for HA, and RDX results confirmed amorphous HA as the main mineralization product. MEV

analysis showed that collagen fibers were more affected for longer hydrolysis times, and that

salt deposition was heterogeneous, with crystals grouped in spherical agglomerates in a

needle-like shape throughout surface and inner, except for porcine skin derived matrices that

were not internally mineralized due their width. Obtained results demonstrated that in vitro

mineralization of type I collagen matrices, using different sources of biological tissues and

hydrolysis time was possible, producing a material with potential to be used in bone

regeneration.

Introdução

18

1. INTRODUÇÃO

A perda do tecido ósseo, resultante de doenças ou traumas causados por acidentes

é um dos mais importantes e preocupantes problemas da área ortopédica, atingindo um

número muito significativo de pessoas em todo o mundo.

Entre os métodos tradicionais para reconstrução dos defeitos ósseos estão a

utilização de enxertos autólogos (provenientes do mesmo indivíduo), enxertos homólogos

(provenientes de indivíduos da mesma espécie) e heterólogos (provenientes de espécies

diferentes).

O enxerto autólogo tem sido considerado o melhor substituto, pois contém na sua

estrutura células osteogênicas viáveis e fatores de crescimento adequados à osteogênese

(SALGADO; COUTINHO; RUI, 2004), o que faz com que a osteointegração seja rápida.

Embora este seja o melhor tratamento, sua utilização é limitada devido à morbidade do sítio

doador, que aumenta com a quantidade de osso retirado. Hematoma, infecção e dor crônica

são complicações comuns no local da retirada do osso autógeno (KNESER et al., 2006).

Os enxertos homólogos não apresentam as complicações relacionadas com a área

doadora, como ocorre com o enxerto autólogo. Contudo, têm a desvantagem da resposta

inflamatória que desencadeiam e do alto risco da transmissão de doenças infecto-contagiosas

associadas às respostas imunológicas, responsáveis por altos índices de insucesso (ROSE;

OREFFO, 2002).

Os enxertos heterólogos, especialmente os de origem bovina, vem sendo usados,

pois são de fácil obtenção e disponibilidade, porém oferecem riscos de contaminação e/ou

rejeição.

Introdução

19

Com o intuito de substituir estes enxertos, biomateriais são utilizados no processo

de reparação óssea incluindo os naturais como colágeno, quitosana e os sintéticos, tais como

metais, cerâmicas e polímeros.

1.1. Biomateriais e engenharia de tecido ósseo

Biomateriais podem ser definidos como quaisquer substâncias ou combinação de

substâncias que podem ser utilizados por um período de tempo para melhorar, aumentar ou

substituir, parcial ou inteiramente, qualquer tecido órgão ou função (PARK; BRONZINO,

2003).

Os biomateriais podem ser classificados em dois grupos de acordo com a natureza

química: naturais, que incluem o colágeno, elastina, seda, tecidos biológicos, ou sintéticos que

incluem as cerâmicas, os polímeros sintéticos, metais e compósitos.

De um modo geral os biomateriais devem apresentar as seguintes características

(PARK; BRONZINO, 2003):

• ser biocompatível;

• não ser tóxico ou carcinogênico;

• ter propriedades químicas projetadas para o trabalho de reconstrução;

• estabilidade mecânica apropriada ao uso;

• peso e densidade adequados;

• estimular reações biológicas favoráveis aos processos de

remodelagem.

Introdução

20

O melhor entendimento das interações biomateriais: tecido:células e das respostas

celulares aos implantes tem acarretado em um amplo desenvolvimento dos biomateriais.

Esses novos biomateriais não visam apenas o preenchimento de espaço, mas também

estimular uma resposta biológica quando implantados. Dentre esses se enquadram:

• os materiais inteligentes que são aqueles que usam a analogia com materiais

biológicos sendo capazes de modificar e adaptar sua estrutura, morfologia e

outras propriedades para substituir ou melhorar alguma função biológica,

quando física e/ou quimicamente estimulados (FURTH; ATALA; DYKE,

2007);

• os biomiméticos que são aqueles que mimetizam as propriedades naturais,

tais como estrutura e função dos tecidos ou órgãos que irão substituir

(SHIN; JO; MIKOS, 2003);

• as matrizes extracelulares (MEC) que são aqueles materiais destinados à

engenharia de tecidos visando substituir, manter ou melhorar uma função de

um órgão ou tecido (KIM; MOONEY, 1998).

Para a engenharia de tecido ósseo se propõe que a matriz deva induzir a formação

do osso e tecidos circunvizinhos ou que atue como portadora para células ósseas implantadas

ou outros agentes. A matriz deve conter características particulares como (JONES; LEE;

HENCH, 2006):

• Atuar como modelo para o crescimento ósseo in vitro e in vivo em

três dimensões;

• propriedades mecânicas e físicas apropriadas para aplicação;

• tamanhos médios de poros de 200-400µm;

Introdução

21

• ser passível de esterilização sem a perda de suas propriedades;

• não ter efeito prejudicial ao tecido circunvizinho;

• não promover crescimento de tecido mole na interface osso-implante;

• boa justaposição óssea;

• ser absorvida na mesma velocidade em que o osso é reparado, com

produtos de degradação não-tóxicos que podem ser facilmente

excretados pelo organismo;

• crescimento ósseo máximo através de osteoindução e/ou

osteocondução, promovendo crescimento ósseo interno;

Dentre as várias matrizes que vêm sendo estudadas, as naturais, tais como o

colágeno através de compósitos com fosfatos de cálcio, tem se destacado. Os compostos

contendo hidroxiapatita (HA) e colágeno têm potencial para mimetizar e substituir o tecido

ósseo (WAHL; CZERNUSKA, 2006), pois a combinação destes dois componentes

apresentou osteogênese acelerada (XIE; BAUMANN; McCABE, 2004).

Estudos com compósitos de matrizes de colágeno aniônico com hidroxiapatita

mostraram uma baixa irritabilidade tecidual, permitindo a evolução reparativa do tecido

ósseo. A avaliação biológica em ratos mostrou que após sessenta dias de implante o

compósito encontrava-se incorporado ao processo de ossificação com as cavidades ósseas

quase que totalmente preenchidas por tecido ósseo (MARTINS et al., 1998).

O estudo de nanofibras do compósito colágeno/HA mostrou que este biomaterial

tem potencial para a mineralização por osteoblastos sendo um biomaterial promissor para a

regeneração de tecidos ósseos (VENUGOPAL et al., 2008).

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Introdução

22

1.2. Tecido ósseo

O tecido ósseo é constituído por fibras de colágeno reforçado por partículas

minerais de poucos nanômetros. Da massa total do tecido ósseo cerca de 70% estão sob a

forma de hidroxiapatita (HA) depositadas sobre as fibras colagênicas (Figura 1) e a relação

Ca/P pode variar entre 1,50 a 1,67 (HABRAKEN; WOLKE; JANSEN, 2007). Os 30%

referentes à parte orgânica são quase que exclusivamente compostos por uma única proteína,

o colágeno tipo I, que participa de forma importante no processo de mineralização óssea.

Figura 1. Organização hierárquica do osso. (Adaptada de MEYERS et al., 2008).

Durante a maturação óssea a estrutura cristalina do mineral pode sofrer um

rearranjo contínuo sendo possível encontrar intermediários que apresentam estruturas

cristalinas de compostos que se assemelham a brushita ou monohidrogeno fosfato de cálcio

diidratado, fosfato octacálcico e fosfato tricálcico (KAWACHI, 2002) que têm como relações

Ca/P mostrados na Tabela 1.

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Introdução

23

Tabela 1. Relação Ca/P de fosfatos de cálcio.

Fosfato de cálcio

Fórmula química

Razão Ca/P

Fosfato octacálcico

Ca8H2(PO4)6.5H2O

1,33

Brushita ou DCPD

CaHPO4.2H2O

1,00

Fosfato tricálcico (TCP)

Ca3(PO4)2

1,50

1.3. Hidroxiapatita (HA)

Durante a década de 20 reconheceu-se que o mineral presente nos ossos e dentes

era muito similar em sua estrutura ao mineral hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) (BOSKEY,

1998) (Fig. 2).

Figura 2. Arranjo atômico da hidroxiapatita (SILVA, 2008).

Por ter composição química semelhante à fase mineral dos ossos e possuir

características como biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade (MURUGAN;

RAMAKRISHNA, 2005), a hidroxiapatita sintética tem sido considerada o material ideal

como um implante ósseo em uma variedade de situações e mostrou promover o crescimento

de células mesenquimais e diferenciação osteogênica (ZHAO et al, 2006).

Introdução

24

A HA (sintética ou natural) é um dos poucos materiais bioativos usados em

aplicações dentais, ortopédicas e maxilo-faciais. A HA tem aplicações como revestimento de

biocerâmicas e preenchedores ósseos. Os revestimentos de hidroxiapatita muitas vezes são

aplicados aos implantes metálicos (mais comumente titânio / aços inoxidáveis e de ligas de

titânio) para alterar as propriedades superficiais. Para preencher defeitos ósseos, a HA pode

ser utilizada em várias formas como em pó, blocos ou esferas porosas.

De modo geral a HA é um material frágil e sua resistência mecânica é pobre, não

é bioabsorvível e tem uma baixa taxa de substituição, resultando no afrouxamento ou quebra

de implantes de HA in vivo, não podendo ser utilizada como dispositivo para substituir

grandes defeitos ósseos.

Para melhorar essas características, matrizes de HA com colágeno têm sido

desenvolvidas já que a adição desta proteína produz materiais com boas qualidades como por

exemplo o aumento da resistência mecânica.

1.4. Colágeno

O colágeno é a proteína fibrosa mais abundante no corpo humano, representando

aproximadamente 30% das proteínas do corpo. Tem a função de manter a integridade

estrutural do tecido e conferir resistência mecânica a diversos tecidos e órgãos. Mais de 90%

das proteínas extracelulares no tendão e ossos e mais de 50% na pele são constituídas por

colágeno.

Atualmente, são identificados 29 tipos de colágeno (SÖDERHÄLL et al., 2007),

os quais se diferenciam na composição de aminoácidos, nos domínios de cada molécula e nos

diferentes arranjos estruturais.

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Introdução

25

O colágeno tipo I é o mais conhecido química e estruturalmente. É facilmente

encontrado na pele, tendão, vasos sanguíneos, intestinos e ossos.

A macromolécula de colágeno (Fig. 3) é formada por uma unidade monomérica

denominada de tropocolágeno que é formado por duas cadeias idênticas (α1), possuindo cerca

de 1055 resíduos de aminoácidos cada e uma cadeia diferente (α2), possuindo cerca de 1029

resíduos. Dando origem a uma hélice tripla com 300nm de comprimento e 1,5nm diâmetro.

As extremidades não helicoidais são denominadas de telopeptídeos N- e C-

terminais, que possuem respectivamente 16 e 25 resíduos de aminoácidos (CHAPMAN et al.,

1990).

Figura 3. Estrutura da molécula de colágeno.

A seqüência desses resíduos de aminoácidos é regular, apresentando-se na forma

de unidades repetitivas ou tripletes do tipo: (-Gly-X-Y-), em que cada terceiro resíduo de

aminoácido é glicina (Gly). Na posição X existem diferentes aminoácidos; no entanto, a

prolina (Pro) é típica nesta posição. Na posição Y, existem aminoácidos diferentes, mas

aproximadamente cada sétima posição de Y é ocupada por hidroxiprolina (Hyp), sendo que a

seqüência Gly-Pro-Hyp representa cerca de 10% da molécula.

Prolina e hidroxiprolina são aminoácidos cíclicos e rígidos. A sua presença no

esqueleto da molécula impede um movimento rotativo e, portanto, contribui para a

estabilidade da hélice tripla. A Gly é a menor molécula de aminoácido e sua presença entre os

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Introdução

26

resíduos permite uma maior eficiência da torção da cadeia em uma hélice (KENNEDY;

WESS, 2003).

Nos tecidos biológicos, o colágeno organiza-se em estruturas fibrilares que são

estabilizadas por ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Esta

organização fibrilar tem origem na microfibrila. Através das interações entre cinco moléculas

de tropocolágeno, tem-se a formação das microfibrilas, menor unidade estrutural do tecido

conjuntivo.

A Figura 4 mostra a formação da fibrila do colágeno.

Figura 4. Formação da fibrila de colágeno.

Formadas as microfibrilas, inicia-se o processo de agregação denominado de

fibrilogênese, para formar fibrilas insolúveis, as quais são mantidas por ligações cruzadas

intra (entre a mesma unidade de tropocolágeno) e intermoleculares (entre as unidades de

tropocolágeno) e também por ligações eletrostáticas que lhes conferem estabilidade (NIMNI;

HARKNESS, 1988; VEIS, 1982). A Figura 5 mostra a representação das ligações intra e

intermoleculares no tropocolágeno.

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Introdução

27

Figura 5. Representação da formação intramolecular e intermolecular do colágeno (KOTCH;

RAINES, 2006).

O modelo mais aceito para a organização do tropocolágeno é o quarto alternado

pentafibrilar proposto por Smith (1968). Neste modelo, as moléculas de tropocolágeno estão

deslocadas um quarto de seu comprimento, ou seja, cerca de 67 nm em relação à molécula

adjacente, apresentando também uma região de espaçamento vazio entre duas moléculas

alinhadas longitudinalmente (“gap”), seguidas de uma região de sobreposição (“overlap”)

destas moléculas (Fig. 6). O conjunto “gap:overlap” é o período D da estrutura fibrilar do

colágeno tipo I.

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Introdução

28

Figura 6. Esquema de agregação das moléculas de tropocolágeno para a formação da

microfibrila.

As fibras insolúveis têm uma alta capacidade de tensão elástica, tendo ainda a

função de orientar tecidos em desenvolvimento, que torna o colágeno altamente compatível na

utilização como biomaterial (MAYNE, BURGESON, 1987; HUC, 1985).

Para o colágeno tipo I a formação de fibras ocorre em pH 7,0, sendo este o pH

onde se tem a máxima interação eletrostática entre as moléculas de tropocolágeno, fazendo

com que a resultante de cargas na molécula seja zero (colágeno nativo). A resultante das

cargas no colágeno pode ser modificada resultando em uma matriz colagênica carregada

positiva ou negativamente. Como por exemplo, as reações podem ser de esterificação (REID,

GORHAM, LACKIE, 1993) e succinilação (ZHANG et al., 2007).

Uma outra modificação possível do colágeno é a hidrólise alcalina (Fig. 7) dos

grupos carboxiamidas dos resíduos de aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln)

presentes na cadeia α do tropocolágeno (LACERDA; PLEPIS; GOISSIS, 1998).

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Introdução

29

Figura 7. Hidrólise alcalina dos grupos carboxiamidas dos resíduos de Asn e Gln.

A hidrólise total dos grupos Asn e Gln tem como resultado, a adição de 130

cargas negativas, superpostas em regiões de carga negativa preexistentes na molécula nativa

(BET et al., 2003). Devido à alteração de cargas, há a formação de um centro de carga

assimétrico localizada na região central do tropocolágeno (Fig 8). Esta característica é

importante para o desenvolvimento de materiais dielétricos a qual pode aumentar as

propriedades piezoelétricas existentes no colágeno nativo (PLEPIS, GOISSIS, DAS-GUPTA,

1996).

Figura 8. Resultante de carga líquida para o tropocolágeno para colágeno nativo (pontilhado)

e colágeno aniônico (preto) (BET, 2000).

Introdução

30

As matrizes de colágeno aniônico preparadas a partir de pericárdio bovino

mostraram um aumento na adesão e proliferação celular (BET et al., 2003) e ausência de

resposta inflamatória (ROSA et al., 2003).

1.5. Matrizes de colágeno (MC)

Nas últimas décadas, o uso de MC para reparação tecidual tem demonstrado que

estas podem induzir a remodelagem construtiva de tecidos danificados (LEE, C.; SINGLA;

LEE, Y., 2001; ROCHA et al., 2006), e que podem ser modificadas por processos químicos

ou físicos resultando em matrizes carregadas positiva ou negativamente tornando as

propriedades mecânicas e fisiológicas mais adequadas para as aplicações desejáveis. Elas

atuam como sítios para ancoragem de células, servem como base para o crescimento e o

desenvolvimento do novo tecido. Estas matrizes podem ser utilizadas em diversas formas

como esponjas, filmes, géis e matrizes acelulares sem a perda de sua estrutura tecidual, que

podem ser obtidas pela remoção dos componentes celulares presentes em tecidos biológicos.

Com a ausência de células há pouca inflamação não levando a rejeição do tecido implantado.

Estas matrizes apresentam algumas propriedades como (LEE, C.; SINGLA; LEE,

Y., 2001):

• Biocompatibilidade;

• Bioatividade;

• Biodegradabilidade;

• Capacidade de sustentação celular.

Devido aos excelentes resultados obtidos em uma variedade de aplicações

biomédicas (FENG et al., 2006, CAIONE et al., 2006, BAHARUDDIN et al., 2002), o

Introdução

31

desenvolvimento de matrizes acelulares, que são derivadas de tecidos biológicos submetidos a

tratamento para remoção de células e componentes celulares, mas que conservam a estrutura

nativa, chamou a atenção em diversos estudos. Entre estes tecidos estão a pele, o pericárdio, a

serosa, o tendão e as matrizes ósseas desmineralizadas que podem ser obtidas de fontes

diferentes como bovina, suína e avestruz.

Como exemplo de aplicações das MC tem-se sua utilização como substituintes de

válvulas cardíacas (MIRNAJAFI et al., 2005), pele (METCALFE; FERGUSON, 2007) e

ossos (CUNHA et al., 2008).

1.5.1. Tecidos biológicos como fonte para matrizes de colágeno

1.5.1.1. Pele Porcina (PP)

Anatomicamente a pele mais similar a pele humana é a porcina comparando-se

com outros animais. A epiderme do porco tem espessura que varia de 30 a 140 µm, estando

assim, dentro de um intervalo semelhante ao do homem que varia de 50 a

120 µm e, além disso, a razão derme/epiderme da pele porcina varia 10:1 para 13:1 sendo

estas medidas comparáveis a da pele humana (VARDAXIS et al., 1997).

PP (Fig. 9) começou a ser utilizada na década de 60 (BROMBERG; SONG;

MOHN, 1965) e é atualmente uma das fontes heterólogas mais utilizadas, devido a grande

quantidade de colágeno (95 %), a sua disponibilidade, seu baixo custo e sua estrutura

histológica ser similar a da pele humana (RUSZCZAK, 2003).

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Introdução

32

Figura 9. Pele porcina.

Devido a estas características citadas, os enxertos heterólogos de pele porcina têm

sido utilizados no tratamento de feridas cutâneas (HOYAMA et al., 2005), no tratamento em

incontinência urinária (BARRINGTON et al., 2002), na reparação de fístula rectovaginal

(MOORE et al., 2004) e na reconstrução de defeitos abdominais crônicos (SHAIKH et al.,

2007). Também são utilizados em queimaduras como revestimentos biológicos atuando como

substituintes temporários enquanto ocorre a cicatrização espontânea do tecido (CHIU; BURD,

2005; FENG et al., 2006). Permacol® é um biomaterial comercial derivado de derme porcina

pela remoção de células por processos químicos e enzimáticos e também tem sido largamente

utilizado no tratamento de queimaduras (MACLEOD et al.; 2005).

1.5.1.2. Pericárdio Bovino

O pericárdio bovino (PB) é uma membrana fibro-elástica que envolve o coração

(Fig. 10) e é um dos tecidos que vem sendo utilizados no desenvolvimento de biomateriais. É

um material biológico de baixo custo e de fácil manipulação. A grande vantagem da utilização

de PB é o seu alto teor de colágeno, cerca de 97% (GIGLIOTI, 2005), o qual possui uma

grande quantidade de grupos reativos que possibilitam alterações químicas do tecido. A

modificação química ou fixação, do tecido biológico aumenta sua resistência à degradação

enzimática e diminui a sua antigenicidade (NIMMI et al, 1988).

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Introdução

33

Figura 10. Pericárdio bovino.

PB tem sido utilizado extensivamente como biomaterial na confecção de

bioprótese, durante décadas, especialmente para a reparação de lesões cardíacas (OLMOS et

al., 1997) após tratamento com diferentes métodos de reticulação (SUNG et al., 1999, SACKS

et al., 2007). As próteses vasculares confeccionadas com PB possuem um bom desempenho

hidrodinâmico e baixa trombogenicidade (MAIZATO, 2003).

Além disso, este tecido tem sido utilizado no tratamento de valvulopatias,

aneurismas e dissecções arteriais, tratamento de hérnias (GAERTNER; BONSACK;

DELANEY, 2007), para o revestimento de implantes orbitais após a enucleação (GAYRE et

al., 2001), em enxerto dural (BAHARUDDIN et al., 2002) e no tratamento e reparo de

ligamento e deficiências do tendão (ROSSOUW; VILLIERS, 2005).

Com a finalidade de reconstituir o diafragma de cão, foi utilizado pericárdio

bovino conservado em solução de glutaraldeído. Os autores verificaram boa vedação do

defeito, sendo histologicamente observada presença de uma camada de tecido conjuntivo

sobre o implante (GALLO et al.,1982).

Os trabalhos realizados com pericárdio bovino mostraram que este material

apresenta baixa antigenicidade e toxicidade, possui grande resistência à tração, ausência de

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Introdução

34

irritação, e sua permanência no interior dos tecidos provoca uma leve reação inflamatória por

tempo limitado (BRAILE et al., 1982).

Alguns estudos também mostram que PB pode ser utilizado no processo de

reparação óssea. Rocha et al. mostraram que as matrizes derivadas de PB hidrolisadas são

osteocondutivas promovendo rápida recuperação do defeito ósseo (ROCHA et al., 2006).

1.5.1.3. Serosa Porcina

O intestino delgado de suínos é composto de 4 camadas, como mostrado na Figura