Novos dispositivos de microextração e pré-concentração para eletroforese capilar utilizando... por Osmar Antunes Junior - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

OSMAR ANTUNES JUNIOR

Novos Dispositivos de Microextração e

Pré-Concentração para Eletroforese Capilar

Utilizando Membranas Microporosas ou

Processos Eletroquímicos e sua Potencialidade

na Análise de Aminas e Metais

São Paulo

Data do Depósito na SPG: 10/07/2008

OSMAR ANTUNES JUNIOR

Novos Dispositivos de Microextração e

Pré-Concentração para Eletroforese Capilar

Utilizando Membranas Microporosas ou

Processos Eletroquímicos e sua Potencialidade

na Análise de Aminas e Metais

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Química.

Área de Concentração: Química Analítica

Orientador: Prof. Dr. Ivano Gebhardt Rolf Gutz

São Paulo

2008

1

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

2

“Ainda que eu tivesse o conhecimento de todos os mistérios e de toda a ciência, (...) se não tivesse o amor, eu não seria nada. (...) O amor jamais passará.”

(1ª Epístola aos Coríntios 13, 2abd.8a).

Ao Amor, dedico:

Ao Amor Infinito e Onipotente,

minha fortaleza e meu refúgio, que sempre me

deu forças para superar as dificuldades.

Ao Amor Materno e ao Amor Paterno,

que sempre souberam nutrir e educar, corrigir e

apoiar, mostrando que sacrifício e amor não têm

limites.

Ao Amor Verdadeiro, que sempre

me apoiou, compreensivo e companheiro,

minha serenidade nas horas de desespero e

minha felicidade em todos os instantes de

minha vida.

Ao Amor de Mestre, que, sempre

paciente, soube ouvir e animar, guiar e dar

alento, partilhando seu tempo, saber e

experiência.

Ao Amor Fraterno, que conheci

através de meus amigos, sempre solidários

nas angústias, alegres na diversão, presentes

nos risos e nos choros.

3

AGRADECIMENTOS

Agradeço, em primeiro lugar a Deus, por todas as graças com as quais me

cumulou com Sua infinita bondade e que me permitiram chegar aqui, sempre desviando Seu olhar de minhas faltas.

Aos meus pais, Olinda e Osmar, por todos os ensinamentos, todo o amor, pelos

inúmeros sacrifícios e exemplos, ao longo de toda minha vida que me fizeram tornar-me quem eu sou. A eles gratidão eterna.

À minha amada, Daniela, por trazer alegria e felicidade à minha vida de uma forma muito especial, por todo amor e companheirismo partilhado nos passos que até aqui demos juntos e por me fazer querer continuar nesta caminhada sempre ao seu lado. Te amo.

Ao professor Ivano G. R. Gutz, por toda paciência, retidão e amizade, em sua

condução quase paternal durante este longo período de orientação. E pela ínfima parcela de seu conhecimento que pude apreender, do muito que me pôs a disposição.

Aos professores Claudimir e Lúcio, pelos ensinamentos partilhados, apoio

científico e pelos longos colóquios, por vezes nada científicos.

A todos os colegas do laboratório, aos que nele se encontram e outros tantos que por ele passaram, pelo ótimo ambiente de trabalho, pelo auxílio e discussões científicas e filosóficas, pelos inúmeros momentos de descontração e pela amizade.

Ao Habbib, inestimável irmão que nunca tive. Por sua amizade solícita e sempre

sincera, por todos os momentos de descontração e desespero que partilhamos e pelo muito que pude aprender de sua cultura e inteligência agudas e companhia inigualável.

Por todos os comentários sarcásticos, por seu realismo contundente e por saber ser tão amável mesmo que tenhamos tudo para odiá-lo. És mui amado, mas, ainda assim,

desprezível!

À Lúcia, pelos incontáveis anos de amizade, solidariedade, confissões, lágrimas, risos, brigas, soquinhos no baço, conversas, e tudo mais que esta longa caminhada nos ofereceu. Por ainda conseguir suportar minha presença depois de todo esse tempo.

Pelo privilégio e sinceridade de sua amizade, agradeço.

4

Ao Volnir, pela amizade sempre presente, pelos risos e longas conversas sobre

absolutamente nada de útil e pela inestimável companhia. Como se isso apenas não bastasse, pelos inúmeros reagentes, vidrarias e tudo mais que me forneceu e por todo tempo que dedicou a me ajudar, sempre que precisei.

Ao Thiago, pela amizade sempre constante, nas cervejas, nas pizzas, nos

trabalhos da madrugada, nas conversas e nos cafés. Por todos cigarros que fumamos, por toda simplicidade e honestidade de coração, grato pela sua amizade!

À Maria, por toda honestidade única e amizade única desta criança. Pelas

inúmeras conversas que travamos, por todo apoio que trocamos (se bem confesso que mais recebi), pelas vezes que choramos (se bem que mais ela chorou) e pelas vezes que rimos (com ou de alguém...). Por ainda me suportar depois de tantas mazelas, obrigado amiga.

Aos Moitas e aos Desprezíveis, por toda amizade, companheirismo, carteados e

comilanças, risos e lágrimas, que me deram fôlego nesta jornada e me permitiram conhecer o significado da palavra irmão.

A Lianel, Aramil, Moradan, Miranda, Groo e Otto, por todo apoio e amizade que

deram a Celeb e por tantas vezes que o trouxeram à sanidade ao longo de suas

aventuras através de Oerth.

Ao Beira, mestre eterno, que me trouxe e manteve nesse laboratório e que tanto

me ensinou. Pela luz nos primeiros passos científicos, pelas beirutadas partilhadas e jamais esquecidas (como limpar o ferro de solda), pela herança maligna, pelas técnicas de soquinhos no baço e, principalmente, pela amizade e pelo companheirismo.

Ao Fernando, por todo auxílio e disponibilidade no laboratório, e por todo

conhecimento em eletrônica sem o qual o sistema FIA-CE jamais teria sido montado.

Aos inúmeros colegas, professores e funcionários do IQ por tudo que pude com

eles aprender, pelo auxílio (da amizade, do apoio e dos galhos quebrados, às

elucidações científicas e vidrarias e reagentes cedidos) e por tornarem mais fácil e agradável minha permanência neste local.

A Ivani Batista, pela colaboração no trabalho de determinação de DMAE, pelos

cremes e por todo esforço em conjunto.

À CAPES pelo suporte financeiro durante a realização deste trabalho.

5

“Festina Lente.”

(Apressa-te devagar!)

Caius Augustus

“Vaidade das

vaidades, diz o Eclesiastes,

vaidade das vaidades! Tudo é

vaidade!”

Livro do Eclesiastes 1,2

“Há uma peste no

homem, é a pretensão de saber

alguma coisa.”

Montaigne – Ensaios, 1580.

If you can meet

with Triumph and Disaster

And treat those

two impostors just the same”

Rudyard Kipling - If

6

RESUMO

Antunes Junior, O. Novos Dispositivos de Extração e Pré-Concentração para

Eletroforese Capilar Utilizando Membranas Microporosas ou Processos

Eletroquímicos e sua Potencialidade na Análise de Aminas e Metais. 2008. 130p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Química (Química Analítica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

A eletroforese capilar (CE) é uma técnica de separação eficiente, que tem merecido grande atenção nas últimas duas décadas, e que oferece soluções analíticas alternativas ou complementares à cromatografia líquida num número crescente campos de aplicação, incluindo análises de fármacos, compostos biológicos e biogênicos, dentre outros. Entre as vantagens comparativas da técnica figuram separações mais rápidas com pequeno

dispêndio de amostras, solução tampão (e solvente orgânico, se usado), baixo custo de operação e manutenção. Todavia, a exigüidade de amostra no capilar tem como reflexo, via de regra, limites de detecção menos favoráveis que os da HPLC, uma limitação significativa na análise de traços, suplantável por técnicas e procedimentos de extração/acumulação prévia dos analitos.

Nesta tese concebeu-se e implementou-se a combinação inédita entre a CE e a pré-

concentração eletroquímica de metais. Novos dispositivos para extração líquido/gás/líquido mediada por membranas microporosas também foram propostos e aplicados à analise de aminas voláteis, sempre utilizando detector de condutância medida sem contato direto com a solução (C4D, contactless capacitively coupled conductivity detection). Primeiramente, sem recorrer à preconcentração, definiu-se condições de análise para 16 aminas

(metilamina, dimetilamina, trimetilamina, propilamina, n-butilamina, s-butilamina, t-butilamina, hexilamina, DMAE, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, 1,3-

diaminopropano, 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano e 1,6-diaminohexano) juntamente com íon amônio, e, para análise de de 9 metais (Tl+, Cd2+, Pb2+, Cr3+, Zn2+, Ag+, Cu2+, Co2+

7

e Ni2+). Um método completo para análise de dimetilaminoetanol em formulações

cosméticas por CE-C4D foi desenvolvido e validado.

Os estudos de extração e pré-concentração líquido/gás/líquido foram realizados

utilizando filamento oco de Oxyphan preenchido com solução coletora. Foi construída cela para extração gasosa constituída de recipiente fechado no qual se introduz amostra com analitos voláteis, ou volatilizáveis pela adição de reagente e/ou aquecimento

(pervaporação). A bobina coletora de filamento oco preenchido com solução coletora foi montada na parte interna da tampa da cela. Testes realizados com amostras de tecidos de peixe demonstraram o funcionamento do sistema, que poderá ser aperfeiçoado e aplicado, por exemplo, à análise de aminas biogênicas primárias de baixo peso molecular,

indicadoras de decomposição de certos alimentos.

Criou-se também extrator microvolumétrico em que o filamento de Oxyphan é

montado concentricamente no interior de um capilar de sílica fundida, para realização de estudos de extração líquido/gás/líquido em fluxo. Um sistema em fluxo compreendendo válvulas e microbombas foi montado e colocado sob controle de um programa de

computador (Labview), que, entre outras funções, controla o deslocamento da solução coletora exposta no filamento oco (13 µL) até o ponto exato da interface em que se dá a injeção no capilar da CE.

Pela primeira vez recorreu-se à acumulação eletroquímica (ECPC) de analitos num sistema FIA-CE-C4D – uma configuração baseada inteiramente na eletroquímica –, visando expandir os limites de detecção das determinações e eliminar interferência de matriz por troca de meio. Implementou-se a pré-concentração catódica seguida de redissolução anódica com uma célula eletroquímica especial, em que o capilar da eletroforese é posicionado junto ao eletrodo de trabalho, feito de ouro obtido a partir de CD’s graváveis.

8

Uma célula microfluídica ECPC-FIA-CE-C4D também foi construída. Tomando íons Cu2+

como sistema modelo, demonstrou-se o aumento do sinal referente aos íons cobre(II) no eletroferograma para tempos crescentes de acumulação eletroquímica. Para a solução de alto teor salino contendo mistura dos íons Cd(II), Pb(II), Zn(II) e Cu(II), comprovou-se a eliminação da interferência da matriz por troca de meio antes da redissolução anódica. Os testes iniciais indicam que os novos dispositivos e sistemas propostos nesta tese para uso em conjunto com a CE têm potencialidade para desencadear novas pesquisas,

desenvolvimento de métodos e aplicações, sendo passíveis também de miniaturização e automação.

Palavras-chave: Eletroforese Capilar de Zona; Extração Gás-Líquido; Extração Líquido-Líquido; Voltametria de Redissolução Anódica; Aminas Biogênicas; Análise de Metais.

9

ABSTRACT

Antunes Junior, O. New Devices for Extraction and Preconcentration with Microporous Membranes and Electrochemical Procedures prior to Capillary Electrophoresis and their Potential for the Analysis of Amines and Metals. 2008. 130p. PhD Thesis –

Graduate Program in Chemistry (Analytical Chemistry). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Capillary electrophoresis (CE) is an efficient separation technique that evolved rapidly in the last couple of decades, now offering complementary or alternative analytical solutions to liquid chromatography for an expanding number of application fields including drugs, biological and biogenic compounds. Some comparative advantages of CE are faster separation, very low consumption of buffer solutions and samples (and organic solvents, if any), lower maintenance and operational costs. However, the quantification of a few nanoliters of analyte in a capillary, as a rule, compromises the detection limits attainable by HPLC, a shortcomming in trace analysis, suplantable by extraction/preconcentration of the analytes from the sample.

The combination of electrochemical preconcentration (ECPC) with CE is first

proposed in this thesis and tested with metal ions. New devices for liquid/gas/liquid extraction based on microporous filaments filled with a collector solution were proposed and applied to the analysis of volatile amines, The detector of choice was the C4D (capacitively coupled contactless conductivity detection) and CE-C4D working conditions were defined for the separation and determination of: i) 16 amines (methylamine, dimethylamine, trimethylamine, propylamine, n-butylamine, s-butylamine, t-butylamine, hexilamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, DMAE, 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, 1,5-diaminopentane and 1,6-diaminohexane) plus ammonium, ii) nine metallic ions (Tl+, Cd2+, Pb2+, Cr3+ Zn2+, Ag+, Cu2+, Co2+ e Ni2+). A complete method of 10

analysis for Dimethyl-amino-ethanol (DMAE) in cosmetic formulations was established and validated.

Liquid/gas/liquid extraction studies were based on the use of a polypropylene

microporous filment (Oxyphan® ) filled with the collection solution. A closed cell was devised in which an Oxyphan® coil is installed beneath the cap and volatilization of sample components can be promoted by heating (pervaporation) or addition of a reactant. The device was successfully tested with fish samples by the detection of primary low molecular weight biogenic amines, a procedure of special interest in fast checking of fish or other foods for decomposition.

A microvolumetric version of the liquid/gas/liquid extractor was created with an Oxyphan® hollow fiber mounted concentrically inside a silica capillary. A flow system comprising the micropumps, solenoid valves and the microextrator was designed,

automatically operated under software control (Labview). This FIA-CE system was tested by the extraction/enrichment of volatile amines in the collecting solution (13 μL) followed by accurate displacement to the interface with the CE capillary by the micropumps.

Pioneering work with ECPC-FIA-CE-C4D – an all-electrochemical system – was

conducted in this thesis aiming expanded detection limits and matrix effect reduction. An electrochemical cell for the interface with FIA-CE system was built in acrylic using gold electrodes made from gold-sputtered CD-Rs. A microfluidic version of the cell interfaced with the CE capillary was also conceived. The full system was evaluated by using Cu2+ as a model specie; an increase in analytical signal was observed as a function of the cathodic deposition time before stripping. For a mixture of Cd2+, Cu2+, Zn2+ and Pb2+ in a high saline media, elimination of the matrix interference by medium exchange before stripping was demonstrated. Initial favorable evaluations show that the devices and systems proposed in 11

the thesis have the potential to engender further research of methods and applications as well as miniaturization and automation of procedures.

Keywords: Zone Capillary Electrophoresis, Gas-Liquid Extraction, Liquid-Liquid Extraction, Anodic Stripping Voltametry, Biogenic Amines, Metal Analysis.

12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CE – Eletroforese Capilar ( Capillary Electrophoresis)

C4D – Detecção Condutométrica sem Contato ( Capacitivelly Coupled Conductometric Contactless Detection)

FIA – Análise por Injeção em Fluxo ( Flow Injection Analysis)

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( High Performance Liquid Chromatography)

MS – Espectrometria de Massa ( Mass Spectrometry)

ECPC – Pré-Concentração Eletroquímica ( Electrochemical Preconcentration) DMAE – Dimetilaminoetanol

LLE Extração Líquido-líquido ( Liquid-liquid Extraction)

LLME Microextração Líquido-líquido ( Liquid-liquid Microextraction) GLE Extração Gás-líquido ( Gas-liquid Extraction)

GLME – Microextração Gás-líquido ( Gas-liquid Microextraction)

SLM – Membrana Líquida Suportada ( Suported Liquid Membrane)

HFME – Microextração com Filamento Oco ( Hollow Fiber Microextraction) Aminas: 1,3-DAP – 1,3-Diaminopropano; 1,4-DAB – 1,4-Diaminobutano (putrescina); 1,5-DAP – 1,5-Diaminopentano (cadaverina); 1,6-DAH – 1,6-Diaminohexano; MMA

Metilamina; DMA – Dimetilamina; TMA – Trimetilamina; MEA – Etilamina; DEA

Dietilamina; TEA – Trietilamina; PA – Propilamina; NBA – n-Butilamina; SBA – sec-Butilamina; TBA – terc-Butilamina; HA – Hexilamina; EtolA – Etanolamina; diEtolA

Dietanolamina; triEtolA – Trietanolamina.

13

SUMÁRIO

1- Introdução ........................................................................................................ 18

1.1 – Das técnicas utilizadas ............................................................................ 19

1.1.1 - Eletroforese capilar (CE) ................................................................... 19

1.1.2 - Análise por Injeção em Fluxo (FIA) ................................................... 22

1.1.3 - O acoplamento FIA-CE ..................................................................... 24

1.2 - Pré-concentração e tratamento de amostras ........................................... 26

1.2.1 - Extração líquido-líquido ..................................................................... 27

1.2.2 - Extração gás-líquido .......................................................................... 32

1.2.3 – Microextrações líquido-líquido e gás-líquido acopladas a CE .......... 32

1.3 - Tratamento eletroquímico ........................................................................ 33

1.3.1 – Pré-concentração eletroquímica acoplada a CE ............................... 34

2- Objetivos .......................................................................................................... 37

3- Materiais e Métodos ........................................................................................ 39

3.1 – Reagentes ............................................................................................... 39

3.2 – Equipamentos ......................................................................................... 40

4-Resultados e Discussão ................................................................................... 42

4.1 - Utilização do C4D em FIA ........................................................................ 42

4.1.1 – Resultados ........................................................................................ 44

4.2 – Determinação de aminas ........................................................................ 47

4.2.1 – Determinação de aminas por CE-C4D ............................................. 48

14

4.2.2 – Desenvolvimento de metodologia para determinação de DMAE em

formulações cosméticas .......................................................................................... 54

4.2.2.1 – Determinação de DMAE por CE-C4D ............................................ 55

4.2.2.2 – Determinação de DMAE por Espectrofotometria UV-Vis ............... 59

4.3 – Extração gás-líquido com membrana microporosa ................................. 64

4.3.1 – Construção de dispositivo para extração gás-líquido ....................... 66

4.3.2 – Avaliação do dispositivo proposto ..................................................... 71

4.3.3 – Determinação de aminas voláteis com cela de extração gasosa e

CE-C4D ................................................................................................................... 75

4.3.4 – Extração Espécie Voláteis em Peixes Utilizando Cela de Extração

Gás-Líquido ............................................................................................................. 79

4.3.5 – Construção da Célula Microvolumétrica de Extração líquido-líquido 82

4.3.6 – Sistema HFME-FIA-CE-C4D ............................................................ 83

4.4 – Pré-concentração eletroquímica de íons metálicos e determinação por

CE-C4D ...................................................................................................................... 93

4.4.1 – Determinação de cátions metálicos em CE-C4D .............................. 93

4.4.2 – Comportamento eletroquímico e pré-concentração de alguns cátions

metálicos ................................................................................................................. 97

4.4.3 – Construção de Célula para ECPC em fluxo acoplada a CE-C4D ... 101

4.4.4 – Ensaios iniciais de ECPC-FIA acoplada a CE-C4D para alguns

cátions metálicos ................................................................................................... 109

4.4.5 – ECPC-FIA-CE-C4D ........................................................................ 112

5- Conclusões e Perspectivas ........................................................................... 120

15

6- Referências ................................................................................................... 123

16

1

Introdução

17

1- Introdução

A combinação da análise por injeção em fluxo ( Flow Injection Analysis, FIA) com a eletroforese capilar ( Capillary Electrophoresis, CE) é um campo recente, que vem encontrando rápida expansão, estendendo-se desde a justaposição de equipamentos (total ou parcialmente) comerciais ao verdadeiro interfaceamento direto entre as duas técnicas. Tipicamente, aparelhos comerciais utilizam detectores espectrofotométricos na região do ultravioleta e visível (UV-vis) e efetuam a transferência da amostra do circuito FIA para o capilar da CE por via eletrocinética.

Simonet [1] já indica os limites de detecção mais elevados que os da HPLC como

uma das limitações da CE, devido à pequena quantidade de amostra introduzida,

principalmente, quando associada a detectores mais acessíveis e não-específicos, como os fotométricos, apontando as principais tendências para aumento de

sensibilidade da técnica, como exemplificado na figura 1. O acoplamento FIA-CE

permite associar à CE a grande flexibilidade dos sistemas FIA, que consiste na

facilidade de acoplar uma série de métodos de pré-tratamento e pré-concentração das amostras antes de sua introdução na eletroforese. Neste contexto, escolheu-se estudar as microextrações líquido-líquido e gás-líquido, capazes de efetuar a extração do analito de interesse de amostras mais complexas e pré-concentrar elevada quantidade de amostra em volumes da ordem de μL, suficientes para a injeção em CE, além de permitir amostragem acumulativa, como no caso, principalmente da extração gás-líquido. Também merecem destaque as técnicas de pré-concentração eletroquímicas, 18

aplicáveis principalmente a íons metálicos, que pode ser de grande interesse em análises ambientais.

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Figura 1- Estratégias para aumentar a sensibilidade nas determinações por eletroforese capilar.

(adaptado de Simonet, B. M., Rios, A., Valcarcel, M., Trac-Trends in Analytical Chemistry 2003, 22, 605-614.)

1.1 – Das técnicas utilizadas

1.1.1 - Eletroforese capilar (CE)

O desenvolvimento pioneiro da eletroforese é comumente atribuído a Tiselius,

por volta dos primeiros anos da década de 30, por ter introduzido o método de fronteira móvel para a separação de algumas proteínas presentes no soro sangüíneo, mas foi a 19

partir dos anos 80, com a implementação das técnicas capilares, que a eletroforese passou a integrar com maior freqüência os laboratórios de pesquisa e análises de rotina, sob a égide de eletroforese capilar de zona [2]. Deve-se destacar, contudo, que outras modalidades de eletroforese, principalmente a eletroforese em gel, encontram ainda larga utilização, sobretudo em laboratórios de pesquisa bioquímica na separação de biomoléculas de elevado peso molecular.

O material mais freqüentemente utilizado na confecção dos capilares para CE é

a sílica fundida, sendo preferidos os capilares com diâmetro interno da ordem de algumas dezenas de μm (usualmente entre 25-75 μm), por apresentarem

características bastante interessantes como elevada condutividade térmica, boa

resistência mecânica, resistência a ataques químicos, elevada transmitância óptica e a possibilidade de se induzir fluxo eletroosmótico quando um campo elétrico é aplicado. O

exterior do capilar de sílica é revestido por uma camada de poliimida, principalmente para conferir proteção mecânica ao mesmo (normalmente quebradiço devido à sua

elevada dureza) garantindo-lhe certa flexibilidade.

As paredes do capilar de sílica possuem grupos silanóis que podem ser

facilmente desprotonados em meio aquoso mediante ajuste do pH. Como conseqüência da formação de uma superfície com carga negativa, cátions hidratados tendem a se aproximar da superfície do capilar, gerando uma distribuição destes de acordo com um gradiente de concentração, ao longo da dupla camada elétrica, que decresce com a distância, até que sua concentração seja igual à do âmago da solução[2]. Ao se aplicar um campo elétrico, os cátions tendem a se deslocar no sentido do eletrodo

negativamente carregado, definindo um plano de cisalhamento rente às paredes do 20

capilar, e gerando o fluxo eletroosmótico, que arrasta toda a solução rumo ao pólo negativo. Diferentemente do perfil de velocidades parabólico assumido por uma solução ao fluir no interior de um tubo como, por exemplo, na análise por injeção em fluxo, gerando dispersão da amostra, na CE as velocidades são iguais ao longo de toda

seção transversal, de modo que a movimentação da solução pelo fluxo eletroosmótico não gera semelhante dispersão.

Sob a aplicação de um campo elétrico, espécies carregadas tendem a

apresentar sua própria migração em função de seus coeficientes de mobilidade iônica.

Dessa forma, sobrepondo-se ao fluxo eletroosmótico, a diferente mobilidade de cada íon resulta na separação de misturas de diferentes espécies, possibilitando detecção diferenciada ao passarem pelo detector. Estas características conferem à eletroforese um elevado poder de separação, que também é dependente, dentre outros fatores, do comprimento do capilar utilizado, da alta tensão aplicada, da quantidade de amostra introduzida e do tampão de corrida utilizado [2].

Devido às dimensões internas micrométricas do capilar de sílica fundida, os

volumes utilizados na transferência de amostra para análise, são diminutos (da ordem de dezenas de nanolitros). Entretanto, se o consumo de material é drasticamente reduzido, via de regra, esta pequena quantidade de amostra é responsável pela

deficiente sensibilidade da CE quando se associam os mesmos detectores empregados em HPLC. O detector mais consagrado, baseado em espectrofotometria na região do UV ou visível, tem sua sensibilidade prejudicada pelo reduzido caminho óptico oferecido pelo capilar (salvo quando se recorre a células em forma de Z), freqüentemente

agravada pela necessidade de recorrer à detecção indireta. Detectores eletroquímicos 21

em geral, incluindo os baseados em condutividade, tal como o utilizado neste trabalho, apresentam as mesmas limitações de sensibilidade. Assim, a CE apesar da superior capacidade de separação, não consegue competir com a HPLC na análise de traços de componentes de interesse numa variedade de amostras reais complexas, por exemplo, espécies tóxicas, mutagênicas ou drogas controladas em águas, alimentos ou fluidos biológicos, salvo com detectores muito sofisticados ou caros (p.ex., fluorescência induzida por laser ou espectrômetro de massa) ou caso se proceda à pré-concentração dos analitos, existindo vasta literatura e artigos de revisão sobre este campo[3-5].

1.1.2 - Análise por Injeção em Fluxo (FIA)

A análise por injeção em fluxo pode ser basicamente definida como um sistema

de análises dinâmico, em que se efetua a introdução de um volume de amostra dentro de um percurso específico pelo qual passa um fluxo de solução transportadora. Este fluxo é impulsionado por uma força motriz (bomba peristáltica ou de pistão, diferença de pressão, gravidade, etc.) em direção a um detector, capaz de registrar o sinal

transiente, em geral em forma de um “pico”, cuja altura (ou área) guarda relação com a concentração do analito. Esta aproximação confere extraordinária flexibilidade à implementação e combinação de procedimentos analíticos simples ou complexos como, por exemplo, adição de reagentes e solventes, extrações e separações, resultando em rapidez e reprodutibilidade muito superiores às geralmente conseguidas em

procedimentos manuais[6]. Devido a estas e inúmeras outras vantagens, incluindo 22

facilidade de automação, aumento da freqüência analítica, possibilidade de economia de reagentes e diminuição dos riscos de contaminação (seja do ambiente, seja da amostra), o número de publicações envolvendo procedimentos FIA segue crescendo

tanto na literatura nacional quanto internacional[7, 8].

Em anos recentes, vem sendo pesquisada a miniaturização dos dispositivos

utilizados, visando, em última instância, chegar às dimensões de um "chip"[9, 10], preferencialmente, por técnicas de produção em massa.

Outra vertente é a inclusão de etapas de digestão/solubilização de amostras em

fluxo, com substituição do aquecimento convencional da amostra e reagentes por

irradiação com microondas[11, 12], ultrassom[13] ou UV[14]. Nessa última modalidade, doutorando anterior do orientador desta tese criou um inovador sistema em fluxo em que a aceleração da digestão de matéria orgânica nas amostras por UV é realizada por adição de um fotocatalisador, o TiO2 (anatase em suspensão), e que abrange as etapas de adição de amostra, TiO2, oxigênio, irradiação, remoção de bolhas, retirada de oxigênio, acumulação em gota de Hg, troca de eletrólito e determinação por voltametria de redissolução anódica[15].

Apesar de na prática a FIA compartilhar dispositivos similares ou equivalentes

aos da cromatografia líquida, como bombas, injetores e colunas, a separação dos componentes de misturas complexas não é abrangida na análise em fluxo, tratando-se de domínio da cromatografia e da eletroforese. Na CE, o “bombeamento” da solução como um todo é obtido eletroquimicamente, através do fluxo eletroosmótico, sendo que a separação dos componentes também é eletroquímica, pois se baseia na migração

diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis sob o efeito de um campo elétrico, 23

podendo ser classificada como uma técnica de separação não-cromatográfica (salvo na cromatografia eletrocinética micelar, micellar electrokinetic chromatography, MEKC, e na eletrocromatografia capilar). Naturalmente, em todas elas, também o detector pode ser eletroquímico, p.ex., condutométrico – universal e aplicado tanto na CE como em FIA ou HPLC (cromatografia de íons).

1.1.3 - O acoplamento FIA-CE

A união entre as técnicas FIA e CE surge como um acoplamento bastante

promissor, por reunir a excelente capacidade de separação da eletrofoese com a

facilidade de automação de procedimentos analíticos envolvendo a amostra em

fluxo[16-18], tais como pré-concentração, diluição, extração, transferência de fases, condicionamento do meio para análise e/ou derivatização, entre outros, servindo como exemplo a diálise in vivo para monitoramento da ação de fármacos em ratos[19], a pré-

concentração de metais em coluna C18[20] ou de troca iônica[21], monitoramento de dissolução de medicamentos[22] e a separação de espécies voláteis com unidade de difusão gasosa[23].

Em dissertação de mestrado defendida no IQ-USP em 2002[24], foi demonstrada

a possibilidade de construir no laboratório, com componentes relativamente simples e acessíveis, sistema em fluxo em que se alia a versatilidade da FIA com o poder de separação da CE. A sinergia FIA-CE ainda não foi amplamente investigada e explorada pois a maioria dos trabalhos sobre o assunto surgiram a partir da segunda metade da 24

década de 90, como se verifica em artigos de revisão[16-18]. O número de trabalhos com interfaces FIA-CE diretas é mais reduzido ainda, vez que em grande parte dos trabalhos classificados pelos autores como sendo de FIA-CE, instrumentos (total ou parcialmente) comerciais são justapostos e a transferência da amostra entre os

sistemas se dá via coletor de frações ou injetor mecanizado do equipamento de

eletroforese.

O protótipo desenvolvido neste Instituto[24] apresenta como aspectos atraentes, o injetor multicanal com válvulas de estrangulamento de dimensões reduzidas[25], a interface coaxial simples e efetiva para a transferência eletrocinética ou hidrodinâmica da amostra do circuito FIA para a coluna capilar em que se processa a separação eletroforética dos analitos, culminando com a detecção dos mesmos por

condutometria sem contato ( capacitively coupled contactless conductivity detector, C4D, desenvolvida por da Silva e do Lago[26-30],). Este protótipo é um dos poucos a

possibilitar a transferência (ou injeção) hidrodinâmica (por diferença de pressão) na interface FIA-CE sendo que na literatura se observa preferência na transferência (injeção) eletrocinética, mais simples embora não universal, vez que favorece a introdução no capilar das espécies com maior mobilidade iônica.[18]

Cabe destacar que a transferência deve se dar de maneira bem sincronizada

com o circuito FIA, via de regra, quando o ponto menos disperso da zona de amostra (mistura de analitos ou seus produtos) se encontra frente ao capilar. Em outras palavras, a transferência hidrodinâmica deve coincidir com o “pico” do sinal analítico transiente gerado no sistema FIA. No protótipo mencionado, o tempo exato foi

determinado experimentalmente e mantido fixo no programa de controle executado pelo 25

microcomputador (também responsável pela aquisição de dados, etc.). Esta

metodologia incorre, no entanto, em uma limitação, pois ao se desenvolver novos métodos, ou mesmo à medida que ocorre fadiga das mangueiras acionadas pela

bomba peristáltica, o sincronismo necessita ser reajustado. Desta forma, torna-se conveniente a instalação de um segundo detector (por exemplo, também

condutométrico sem contato) na entrada da interface FIA-CE, de modo a localizar o

“pico” dinamicamente, possibilitando o desenvolvimento de um programa que cuidaria do sincronismo automático das transferências. Também seria mais fácil implementar procedimento para recorrer à diluição controlada (aproveitando o perfil de dispersão do circuito FIA) da amostra.

Entretanto, sempre que se desejar rumar na direção de analitos em

concentrações muito baixas, haverá problemas com o limite de detecção da CE-C4D, via de regra na região de 1 μmol.L-1[26, 27] (sendo tanto menos favorável quanto maior a semelhança entre a mobilidade dos íons do tampão e do analito). Tem, pois, grande relevância, a investigação de métodos de pré-concentração para CE em geral e para FIA-CE-C4D em especial, vez que facilita a automação dos procedimentos envolvidos e possibilita ganho de sensibilidade.

1.2 - Pré-concentração e tratamento de amostras

Apesar do notável esforço e perceptível progresso no desenvolvimento de

técnicas de análise química direta de sistemas materiais a caracterizar, via de regra, a quantificação só é possível após a aplicação de um ou mais procedimentos prévios.

26

Entre os motivos, figuram: a) técnicas restritas a amostras em fase líquida homogênea ou isenta de macromoléculas e partículas; b) técnicas que sofrem interferência de

"matéria orgânica", eletrólito concentrado ou de outros componentes da matriz; c) analitos em concentrações inferiores às alcançáveis pela técnica; d) determinação indireta de analitos não detectáveis; e) especiação de várias formas de um elemento; f) número de constituintes ativos superior ao tratável pela técnica.

Métodos bastante utilizados no preparo e na pré-concentração de amostras são

os processos de extração (p. ex. extração em fase sólida, extrações líquido-líquido e gás-líquido, envolvendo ou não fase orgânica ou fluido supercrítico). No campo da separação de analitos por extração, os sistemas em fluxo são muito atraentes por permitirem eliminar um amplo leque de procedimentos manuais, economia de

reagentes, facilidade de automação e melhor reprodutibilidade no procedimento, sendo que o assunto mereceu detalhada revisão[31-33] bem como menção em livros

especializados em análise em fluxo[9, 34]. Assim sendo, os métodos de extração

líquido-líquido e gás-líquido receberão especial atenção neste levantamento, por se tratar dos principais métodos abordados nesta tese.

1.2.1 - Extração líquido-líquido

Há muito utilizada nos laboratório didáticos e científicos de forma rotineira, a extração líquido-líquido se vale, usualmente, da imiscibilidade de dois solventes e dos diferenciados coeficientes de partição dos analitos nos meios considerados, para 27

promover a separação das espécies. Na extração líquido-líquido em fluxo recorre-se, em geral, à alternância entre segmentos de fase orgânica e aquosa, com diversificados e engenhosos separadores de fase ao final do percurso, que nem sempre são fáceis de colocar em operação, sendo que uma alternativa à confecção e utilização dos mesmos passa a ser a recorrência a membranas que impeçam a mistura das fases aquosa e

orgânica, permitindo, no entanto, a passagem do analito[31].

A utilização de membranas nos processos de extração gás-líquido e líquido-

líquido tem merecido bastante interesse, pois podem incrementar seletividade ao sistema, reduzir o consumo de reagentes (solventes orgânicos) utilizados e dar

versatilidade às montagens, permitindo seu fácil acoplamento em sistemas de extração em fluxo, substituindo vantajosamente os separadores de fase. Via de regra, as

membranas funcionam como uma barreira seletiva entre duas fases, promovendo a

separação do material entre os meios que isola, como indicado na figura 2. Há sempre uma força que promove a passagem do analito através da membrana, levando a cabo a separação. Usualmente, essa força motriz pode ter três origens: 1- gradiente de concentração (promovendo difusão e transporte de moléculas), 2- gradiente de

potencial elétrico (resultando em migração e transporte de cargas) e 3- gradiente de pressão (levando a convecção forçada e ao transporte de volumes).

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Figura 2 - Mecanismo de separação com membrana.

As membranas podem também ser divididas quanto ao seu tipo, sendo as mais

usuais as membranas porosas, que permitem contato entre as fases, proporcionando seletividade limitada à exclusão de tamanho, ou, se hidrofóbicas, possibilitando somente a passagem de moléculas em estado gasoso entre duas fases aquosas, as

membranas de troca iônica, que proporcionam seletividade por repulsão e exclusão de cargas além de exclusão de tamanho e as membranas não-porosas, que

usualmente são polímeros ou filmes líquidos, cuja seletividade se dá com base em propriedades físico-quimicas, como solubilidade, coeficiente de partição, entre outras.

Adicionalmente, uma membrana porosa hidrófoba pode ser utilizada para

absorver e servir de suporte mecânico a um solvente orgânico, definindo um filme fino do mesmo, de modo que se possa fazer a extração da substância de interesse de uma fase aquosa através deste filme, para a fase orgânica ou, consecutivamente, para uma 29

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