O papel do biofilme na rinossinusite crônica com polipose nasossinusal por Thiago Freire Pinto Bezerra - Versão HTML

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Métodos

19

4.2.2 Pacientes do grupo controle

4.2.2.1 Coleta de Amostras

A coleta das amostras ocorreu durante a cirurgia de septoplastia e/ou

turbinectomia inferior parcial, imediatamente após vasoconstricção da

mucosa da cavidade nasal e do meato médio através da colocação por um

período de 10 minutos de cotonóide com adrenalina 1:100.000 (Hamilos,

1995). Coletamos no transoperatório amostra de tecido ósteo-mucoso da

bula etmoidal para posterior preparo e análise através da microscopia

eletrônica de varredura.

4.2.2.2 Pós-operatório

Todos os pacientes foram acompanhados segundo o protocolo do grupo

de nariz pelo médico residente sob supervisão do médico assistente no

ambulatório do HC-FMUSP através de visitas mensais.

4.2.3 Preparo e Análise das amostras de ambos os grupos

Os fragmentos de aproximadamente 1,0 x 1,0cm extraídos durante a

cirurgia realizada por um dos médicos-residentes do serviço foram fixados

por 2 horas com glutaraldeído a 2% em tampão fosfato 0,15M (pH 7,2), à

temperatura ambiente. Submeteu-se as amostras a agitação contínua

durante os primeiros 5 minutos para remover o excesso de muco (Davis,

1988).

Lavou-se por três vezes a peça em solução de lavagem contendo

NaCl (1,2 g), Sacarose (14,6 g) e água destilada (200 ml), e realizou-se uma

pós-fixação em OsO4 a 1% por 1 hora. As amostras foram então

desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico a partir de 70%

até 100%, secadas ao ponto crítico em CO2 e montadas em suportes para

MEV. Realizou-se metalização com platina e observação com o microscópio

eletrônico de varredura Quanta 600 FEG, com uma voltagem de aceleração

Métodos

20

de 10kV. Fotomicrografias foram capturadas no formato TIFF com a

magnificação de 1000 a 12000. Determinou-se a presença de biofilme

bacteriano através da avaliação por um patologista com experiência em

ultraestrutura (P.H.N.S) cego para o estado clínico do paciente através das

fotomicrografias com visualização da estrutura tridimensional com estruturas

esféricas envolvidas por uma matriz amorfa e os canais de água conectando

estas estruturas esféricas (Bezerra, 2009).

4.3 Tamanho mínimo amostral

Uma análise previu que uma amostra mínima de 25 pacientes com

RSCcPN e 25 pacientes no grupo controle seria necessária para alcançar

um poder de 80% (Beta=20%) com um erro alfa de 5%. Estimamos uma

perda de até 25% dos pacientes com RSCcPN no preparo das amostras e

seguimento pós-operatório por 1 ano e determinamos uma amostra de 33

pacientes neste grupo. Como não haveria seguimento pós-operatório nos

pacientes do grupo controle, arbitramos uma perda de até 10% no preparo

das amostras, e determinamos uma amostra de 28 pacientes neste grupo.

4.4 Análise estatística

O programa SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilzado para

análise estatística. Um alfa de 5% foi considerado significativo para todos os

testes.

Métodos

21

4.4.1 Estudo transversal do tipo caso-controle

O teste de Kolgmorov-Smirnov mostrou uma distribuição não

paramétrica dos valores das variáveis. Todos as variáveis quantitativas

foram caracterizadas por mediana [intervalo interquartílico]. A razão de

chances (odd ratio, OR) e a razão de verossimilhança (likelihood ratio, LR),

com um intervalo de confiança de 95% foram determinadas. Um alfa de 5%

foi determinado e um p<0.05 considerado significativo para todos os testes.

4.4.2 Avaliação dos preditores clínicos pré-operatórios e do

prognóstico pós-operatório após 1 ano segundo a presença do

biofilme intraoperatória

O teste de Kolgmorov-smirnov mostrou uma distribuição não

paramétrica dos valores. Todos as variáveis quantitativas foram

caracterizadas por mediana [intervalo interquartílico].

Os 33 pacientes submetidos a FESS para tratamento de RSCcPN

foram acompanhados por 12 meses, apenas 4 pacientes perderam o

seguimento pós-operatório por mudança de domicílio, e 29 pacientes

completaram o período do seguimento.

Os pacientes foram avaliados no pré-operatório segundo a presença

de biofilmes nos seguintes itens: SNOT-20 (a pontuação total, a pontuação

nos 5 itens mais importantes para cada paciente, a pontuação em cada

subgrupo do questionário); NOSE; Endoscopia Nasal, segundo Lund-

Kennedy; TCSF, segundo Lund Mackay. (Piccirillo, 2002; Stewart, 2004;

Bezerra, 2011; Bezerra, 2011, Fokkens, 2007).

Os pacientes foram avaliados após doze meses de pós-operatório

segundo a presença dos biofilmes conforme a diferença entre o valor pós-

operatório e pré-operatório nos seguintes itens: SNOT-20 (a pontuação total,

a pontuação nos 5 itens mais importantes para cada paciente, a pontuação

em cada subgrupo do questionário, e uma melhora significativa na

pontuação maior que 0.8); NOSE; Endoscopia Nasal, segundo Lund-

Métodos

22

Kennedy; TCSF, segundo Lund-Mackay. (Piccirillo, 2002; Stewart, 2004;

Bezerra, 2011; Bezerra, 2011, Fokkens, 2007; Browne , 2007).

4.4.3 Testes estatísticos

As diferenças entre as médias de duas amostras independentes

foram analisadas pelo teste U de Mann-Whitney; e a correlação entre as

variáveis quantitativas, pelo teste de correlação de Spearman. O teste do

Chi-quadrado ou o teste exato de Fisher, para as variáveis qualitativas ou

dicotômicas. Para todos os testes estatísticos um alfa de 5% foi

determinado e um p<0.05 foi considerado estatísticamente significativo.

Resultados

23

5 Resultados

A mediana da idade dos pacientes com RSCcPN e controles foi de 33

[IIQ=15] e 46[18], respectivamente; e a razão entre sexo feminino/masculino

foi 1.08 (14:13) e 0.5 (11:22). Os biofilmes foram identificados em

72.7%(24/33) dos pacientes com RSCcPN em 48.1%(13/27) dos controles.

A razão de chances ( Odds ratio, OR) para a presença do biofilme foi de 2.89

(IC 95%: 0.98-8.42) e a razão de verrossimilhanca ( Likelihood ratio, LR) foi

de 1.51 (IC 95%: 0.97-2.35, p = 0.051).

A maioria das imagens dos biofilmes mostrou elementos esféricos

assemelhando-se bactérias do tipo cocos dentro de uma matriz amorfa

(Figuras 1,2,3,4,5,6,7). Os biofilmes também foram encontrados dentro de

uma área de epitélio ciliado sadio. (Figura 8). Os pacientes com biofilmes

comumente mostraram uma marcante destruição do epitélio, perda de

epitélio ciliado e metaplasia epitelial (Figura 9 a 11).

O avaliação do seguimento após 12 meses foi completada por 87.9%

(29/33) dos pacientes. Os biofilmes haviam sido identificados em 72.4%

(21/29) destes. Três pacientes com biofilme e um paciente sem biofilme

perderam o seguimento. Os resultados pré-operatórios e pós-operatórios

segundo a presença do biofilme estão descritos nas tabelas 1 e 2.

index-39_1.jpg

index-39_2.jpg

Resultados

24

Figura 1. Biofilme bacteriano (12.000x)

Figura 2. Biofilme bacteriano (Aumento 5.000x)

index-40_1.jpg

index-40_2.jpg

Resultados

25

Figura 3. Biofilme bacteriano (Aumento 12.000x)

Figura 4. Biofilme bacteriano (12.000x)

index-41_1.jpg

index-41_2.jpg

Resultados

26

Figura 5. Biofilme bacteriano (12.000x)

Figura 6. Biofilme bacteriano (2.500x)

index-42_1.jpg

index-42_2.jpg

Resultados

27

Figura 7. Biofilme bacteriano (1.000x)

Figura 8. Biofilme dentro de uma área de epitélio ciliado saudável

index-43_1.jpg

index-43_2.jpg

Resultados

28

Figura 9. Metaplasia escamosa do epitélio respiratório (5000x)

Figura 10. Paciente com RSCcPN apresentando uma área de transição de

epitélio ciliado para uma área de epitélio destruído e metaplasia. (600x)

index-44_1.jpg

Resultados

29

Figura 11. Paciente do grupo controle sem biofilme, mas com o mesmo

padrão de imagem (200x)

Resultados

30

Tabela 1. Dados pré-operatórios segundo a presença do biofilme

Biofilme

Biofilme

p

ausente

presente

Sexo (M/F)

27.3% (9/33)

72.7% (24/33)

0.167

Idade

51.00 [16]

45.50 [19]

0.686

NOSE

60 [47]

82 [35]

*0.044

SNOT-20 total

1.75 [2.50]

1.75 [2.01]

0.530

SNOT-20 (5+)

3.80 [1.90]

4.08 [1.95]

0.536

Sintomas nasais

13.00 [11.50]

13.75 [9.75]

0.478

Sintomas em ouvido ou face

3.00 [11.00]

4.50 [8.75]

0.903

Problemas no sono

3.00 [10.50]

7.04 [9.50]

0.339

Problemas psicológicos

6.00 [23.00]

11.50 [16.00]

0.557

Lund-Mackay pré-operatório

16.00 [7.00]

15.00 [6.00]

0.776

Lund-Kennedy pré-operatório

7.00 [6.00]

10.00 [3.00]

*0.047

Todos os valores expressos em mediana [intervalo interquartílico]. Lund-

Kennedy– pontuação da avaliação endoscópica; Lund-Mackay – pontuação

da avaliação tomográfica das cavidades paranasais; NOSE- Questionário de

qualidade de vida doença-específico para avaliar obstrução nasal; SNOT-20

- Questionário de qualidade de vida doença-específico para avaliar

rinossinusites; SNOT-20 (5+) – as 5 queixas mais importantes para cada

paciente no questionário.

Resultados

31

Tabela 2. Dados dos resultados pós-operatórios segundo a presença do

biofilme

Biofilme

Biofilme

P

ausente

presente

Sexo (M/F)

27.6% (8/29)

72.4% (21/29)

0.167

Idade

52.50 [13]

47.00 [22]

0.686

Resultado no NOSE

-41.3 [38.8]

-60.0 [45.0]

0.135

Resultado no SNOT-20

-1.05 [1.24]

-0.80 [1.30]

0.981

Melhora significativa no SNOT-20

63% (5/8)

33% (7/21)

0.218

Sintomas nasais

-7.00 [7.25]

-10.00 [7.50]

0.524

Sintomas em ouvido e face

-2.50 [7.50]

-2.00 [5.00]

0.209

Problemas no sono

-0.50 [5.25]

-3.00 [7.00]

0.855

Problemas psicológicos

0.00 [7.25]

-4.00 [9.00]

0.557

Resultado do SNOT-20 (5+)

-2.68 [2.75]

-2.60 [3.00]

0.695

Resultado do Lund-Mackay

-5.00 [5.25]

-4.00 [4.50]

0.491

Resultado do Lund-Kennedy

-2.00 [2.50]

-5.00 [4.50]

*0.026

Todos os valores expressos em mediana [intervalo interquartílico]. Lund-

Kennedy– pontuação da avaliação endoscópica; Lund-Mackay – pontuação

da avaliação tomográfica das cavidades paranasais; Melhora significativa no

SNOT-20 – definida como uma diminuição maior que 0.8 entre a pontuação

pré-operatória e pós-operatória; NOSE- Questionário de qualidade de vida

doença-específico para avaliar obstrução nasal; SNOT-20 - Questionário de

qualidade de vida doença-específico para avaliar rinossinusites; SNOT-20

(5+) – as 5 queixas mais importantes para cada paciente no questionário.

Uma correlação estatisticamente significativa foi encontrada entre o

Resultado no NOSE e o Resultado no SNOT-20 no subgrupo de pacientes

com biofilme(r=0.463, p=0.01) e na amostra total de pacientes (r=0.470,

p=0.03). Não existiu qualquer outra correlação estatisticamente significativa

detectada entre o SNOT-20, SNOT-20 (5+), Lund-Kennedy e Lund-Mackay.

Discussão

32

6 Discussão

A

RSCcPN

representa

um

verdadeiro

desafio

para

os

otorrinolaringologistas, com muitas questões não elucidadas sobre a

fisiopatologia desta doença (Fokkens, 2007). É mais provável que a

RSCcPN não represente um única doença, mas sim uma manifestação

nasal de diferentes doenças ou da interação de múltiplos fatores do

ambiente e do hospedeiro com vários microorganismos. Os dados da

literatura sugerem que influências epigenéticas podem predispor o

desenvolvimento da doença(Zuliani, 2006). Por outro lado, pesquisas

recentes têm indicado que a presença do biofilme bacteriano pode predispor

os pacientes à piores resultados após FESS(Psaltis, 2008; Bendouah, 2006;

Foreman, 2010)

Encontramos biofilmes nos pacientes com RSCcPN, como

evidenciado por estudos anteriores. Os biofilmes foram encontrados em

72.7%(24/33) dos pacientes com RSCcPN e em 48.1%(13/27) dos pacientes

do grupo controle no presente estudo. Os resultados deste estudo não

mostram uma forte associação entre a presença do biofilme e a RSCcPN

(OR = 2.89, IC 95%, 0.98-8.42; LR = 1.51, IC 95%, 0.97-2.35; p = .051).

Embora a diferença da prevalência dos biofilmes no grupo de pacientes com

RSCcPN não tenha sido estatísticamente significativa dos controles, o

intervalo de confiança de 95% extremamente amplo, que estava

imediatamente abaixo da unidade, sugere que uma diferença clinicamente

significativa pode ter sido perdida por causa do baixo poder estatístico do

pequeno tamanho da amostra. Apesar da diferença não ser estatísticamente

significativa ( p = .051).

A prevalência de biofilmes nos pacientes com RSCcPN foi similar à

encontrada por Foreman e cols. (70%) (Foreman, 2011); contudo este

estudo utilizou FISH/CSLM, um método mais sensível e específico

Discussão

33

(Foreman, 2010). Isto sugere que nosso método não superestimou uma alta

prevalência de biofilmes na mucosa nasossinusal, embora nós não

tenhamos identificado quais espécies estavam dentro dele.

Existem muitas técnicas para investigar a presença dos biofilmes na

RSC, com uma ampla variedade de precisão nos seus resultados conforme

o método escolhido. Os estudos anteriores de MEV demonstraram uma

prevalência de biofilme entre 25 a 100% (Cryer, 2004; Sanclement, 2005;

Ramadan, 2005). A CLSM sem hibridização in situ fluorescente mostrou uma

prevalência de 44 a 50% (Psaltis, 2008), enquanto com hibridização foi de

cerca de 70% (Sanderson, 2006; Foreman, 2011). A demonstração indireta

da formação in vitro encontrou biofilmes em cerca de 28.6% dos pacientes

em um estudo (Zhang, 2011), mas era esperada uma baixa positividade

neste método (Prince, 2008; Zhang, 2011). Diferentes critérios de inclusão,

diferentes acurácias dos métodos e diferentes tamanhos de amostra podem

ser dois importantes motivos para a baixa reprodutibilidade dos estudos.

Uma outra razão é que apenas um dos métodos acima pode ser aplicada à

mesma parte da amostra, aumentando a positividade dos resultados de

análises de amostras por mais de um método apenas somando resultados

ao invés de avaliar a precisão de diferentes métodos em diferentes amostras

de estudos com pequeno tamanho de amostra. Recentemente, Foreman e

cols. mostraram uma prevalência de biofilmes de 90% em pacientes com

RSC quando combinaram os resultados da CLSM e FISH/CSLM com

resultados similiares em cada um dos métodos (65% vs 70%), mas

reprodutíveis em apenas 55% dos pacientes (Foreman, 2010).

A presença do biofilme em metade dos indivíduos sem RSC deve nos

suscitar a revisão do papel dos biofilmes na RSCcPN. Este papel pode estar

sendo provavelmente exagerado, uma vez que o dano epitelial e a

metaplasia associados estiveram presente também em alguns indivíduos

sem RSC. Galli e cols. sugeriram que precisaria existir uma destruição

marcante do epitélio ciliar no desenvolvimento do biofilme, mas no presente

estudo, nós também encontramos biofilmes em um epitélio ciliado sadio

apesar de ser mais frequente encontrar o biofilme sobre um epitélio

Discussão

34

metaplásico (Galli, 2008). De forma similiar ao presente estudo, no estudo

de Galli e cols. o pequeno tamanho amostral também foi um incoveniente.

A presença do biofilmes em pacientes de grupo controle foi relatada entre 0

a 40% em estudos anteriores, com as mesmas dificuldades dos resultados

para os pacientes com RSC biofilmes mencionadas anteriormente

(Sanclement, 2005; Psaltis, 2008; Sanderson, 2006).

Recentemente,

Mladina

e

cols.

publicaram

resultados

em

concordância com os resultados dos estudos anteriores, mas também

encontraram biofilmes em paciente sem RSC. O viés de observação que

poderia existir no presente estudo foi minimizado através da análise “cega”

de todas as imagens, sem conhecimento do quadro clínico do paciente.

(Mladina, 2010)

Nosso estudo também mostrou que os pacientes com biofilme têm

uma pior pontuação pré-operatória no questionário NOSE (60 [47] vs. 82[35],

p=0.044) e na endoscopia nasal segundo Lund-Kennedy (7.00 [6.00] vs.

10.00 [3.00], p=0.047). Provavelmente, os biofilmes presentes nos pólipos

nasais podem ser um dos responsáveis para uma pior morbidade pré-

operatória desta doença demonstrada pela pior qualidade de vida doença-

específica relacionada à obstrução nasal e por uma pior endoscopia nasal.

Zhang e cols. avaliaram fatores clínicos associados com a demonstração de

biofilme bacteriano por um método indireto em pacientes com RSCsPN e

RSCcPN (Zhang, 2011). Embora eles não tenham encontrado qualquer

associação significativa com a presença de pólipos nasais, o método

utilizado para demonstrar o biofilme é de baixa sensibilidade. A amostra do

presente estudo, composta apenas por pacientes com RSCcPN e sem

cirurgias anteriores, também é diferente. O estudo de Zhang e cols. incluiu

paciente com RSCcPN e RSCsPN; e pacientes reoperados.

Nós esperávamos que os pacientes com biofilmes apresentassem uma

pior qualidade de vida doença-específica relacionada com a rinossinusite no

pré-operatório. Este fato não foi confirmado pela pontuação total do SNOT-20

(1.75 [2.50] vs. 1.75 [2.01] p=0.530), nos 5 items escolhidos por eles como mais

importantes no SNOT-20 (+3.80 [1.90] vs. 4.08 [1.95], p= 0.536) e na

Discussão

35

avaliação da pontuação nos subdomínios do SNOT-20. Um outro resultado

inesperado foi a pior pontuação de Lund-Mackay antes da cirurgia nos

pacientes sem biofilme (16.00 [7.00] vs. 15.00 [6.00], p=0.776), embora também

sem uma diferença estatísticamente significativa.

Muitos estudos tem sugerido que o biofilme pode influenciar a

evolução clínica e pode ajudar a explicar a persistência da doença na RSC.

Contudo, estudos anteriores que avaliaram a associação do biofilme com o

prognóstico dos pacientes não analisaram os pacientes com pontuação

padronizada para questionários de qualidade de vida doença-específica,

como o NOSE e o SNOT-20; ou para endoscopia nasal, como o Lund-

Kennedy(Bendouah, 2006; Psaltis, 2008; Foreman, 2010). Bendouah e cols.

mostraram que a presença de Staphylococcus aureus e Pseudomonas

aeruginosa com capacidade para formar biofilme em pacientes submetidos à

cirurgia em um ensaio in vitro influenciou negativamente a evolução clínica

dos pacientes(Bendouah, 2006) . Ressalta-se o fato de todos os pacientes

terem sido submetidos a cirurgia nasossinusal tecnicamente bem

sucedidada prévia e que o autor não analisou os resultados conforme a

presença de RSCcPN. Um achado muito importante deste estudo é o fato

dos estafilococos coagulase-negativos formadores de biofilme não estiveram

relacionados a piores resultados. Estes estafilococos são os agentes mais

frequentemente encontrados em cavidades paranasais de pacientes

assintomáticos após FESS (Singhal, 2011).

No presente estudo, nós encontramos melhores resultados na avaliação

endoscópica segundo a pontuação de Lund-Kennedy nos pacientes com

biofilme (-2.00 [2.50] vs.-5.00 [4.50], p=0.026). Nossos achados podem refletir a

importância da remoção dos biofilmes durante a FESS em pacientes com

RSCcPN e a consequente diminuição da sua quantidade sobre a mucosa no

pós-operatório; mas também pode ser reflexo de uma maior pontuação pré-

operatória estatisticamente significativa. Por outro lado, Psaltis e cols.

encontraram piores resultados pós-operatórios em pacientes com biofilmes

(Psaltis, 2008), mas a sua amostra de pacientes foi diferente da nossa, e incluiu

pacientes com ou sem histórico de cirurgia prévia.

Discussão

36

A média dos resultados na pontuação do questionário NOSE após

FESS foi melhor nos pacientes com biofilmes (-41.3 [38.8] vs. -60.0 [45.0].

p=0.135), mas este fato pode ser o resultado de uma pior e estatísticamente

significativa pontuação pré-operatória NOSE (60 [47] vs. 82[35], p=0.044)

neste grupo.

Embora sem significância estatística, os pacientes sem biofilmes

mostraram melhores resultados na pontuação total do SNOT-20 (-1.05 [1.24]

vs. -0.80 [1.30], p=0.981) e um maior percentual de pacientes com uma

melhora significativa do SNOT [63% (5/8) vs. 33% (7/21), p=0.218]. Por

outro lado, quando realizamos a análise dos subdomínios do SNOT-20

separadamente, encontramos uma melhora mais importante nos pacientes

com biofilmes nos sintomas nasais, psicológicos e nas alterações do sono.

Contudo, essa melhora pode ter sido devido a pontuação pré-operatória e

uma diferença estatísticamente significativa não foi encontrada.

Psaltis e cols. indicaram que a presença dos biofilmes bacterianos

poderia predispor os pacientes para piores resultados relacionados aos

sintomas pós-operatórios (Psaltis, 2008). Contudo, a amostra composta de

60% dos pacientes com FESS prévia suscita uma importante questão:

“Os biofilmes já estavam na mucosa antes da primeira cirurgia ou a

cicatrização alterada na região da mucosa submetida a cirurgia proporcionou

que eles se estabelecessem como biofilmes?”

Ao contrário de Psaltis e cols., que encontrou uma pior avaliação

tomográfica pré-operatória estatisticamente significativa nos pacientes com

biofilmes (Psaltis, 2008), nosso estudo não encontrou uma pior pontuação

pré-operatória (p=0.776) ou uma diferença nos resultados da pontuação

segundo Lund-Mackay (p= 0.491). Psaltis e cols. não realizaram avaliação

tomográfica pós-operatória.

Nós encontramos uma correlação da melhora na pontuação NOSE

com a melhora na pontuação SNOT-20 no subgrupo de pacientes com

biofilmes e em toda a amostra de pacientes. O resultado da pontuação

NOSE foi também maior em pacientes com uma melhora significativa no

SNOT-20. Estes dados sugerem a importância da percepção de obstrução

Discussão

37

nasal para a apresentação clínica destes pacientes e o quanto isto é

relacionado com a QV doença-específica.

Os biofilmes encontrados nos pacientes do presente estudo eram em

sua grande maioria compostos por cocos. Foreman e cols. encontraram

biofilmes compostos principalmente por Staphylococcus aureus em

pacientes com RSCcPN (Foreman, 2011). Contudo, Bendouah e cols.

encontraram biofilmes de Staphylococcus coagulase-negativo sem

implicação significativa no prognóstico, enquanto que a presença dos

biofilmes de Staphylococcus aureus (SAB) interferia significativamente com

o prognóstico (Bendouah, 2006). Avaliando os pacientes com RSCsPN e

RSCcPN, Sanderson e cols. reportou a presença de Haemophilus influenza

em aproximadamente 80% dos pacientes da sua amostra, mas demonstrou

que a cultura intra-operatória das cavidades paranasais não se correlacionou

com as bactérias identificadas nos biofilmes (Sanderson,2006). O presente

estudo não utilizou nenhum método de cultura para caracterizar as espécies

de bactéria encontrada na MEV e acreditamos que o ideal em estudos

futuros seja a realização de CLSM com FISH para saber quais os tipos de

bactéria encontrados no biofilme e realizar uma correlação mais estreita com

o prognóstico, uma vez que os métodos de cultura podem detectar bactérias

sobre a mucosa que não estão estabelecidas como biofilmes no paciente.

A conexão entre os biofilmes e a resposta inflamatória da mucosa

nasossinusal é pobremente compreendida. Embora Heikert e cols. sugeriram

que a presença do biofilme estava relacionada ao perfil inflamatório Th1, o

pequeno tamanho amostral assegurou uma posterior investigação para

avaliar estes resultados (Heikert, 2009). Apesar do fato da RSCcPN ser

relacionada com a resposta inflamatória Th2, alguns estudos demonstram a

necessidade de estudos posteriores para elucidar a resposta inflamatória na

RSCcPN (Bachert, 2002; Cheng, 2007). Posteriormente a publicação do

primeiro artigo resultante da presente tese, Foreman e cols. confirmaram os

dados do presente estudo e mostraram SAB nos pacientes com RSCcPN e

resposta inflamatória do padrão Th2(Foreman, 2011).

Discussão

38

A bactéria mais comumente associada com a RSCcPN na literatura é

o Staphylococcus aureus (Kern, 2008). A hipótese do Superantígeno na

RSCcPN é amplamente suportada pela literatura, mas o mecanismo de ação

do SAg local na geração de pólipos permanece especulativo(Winstead,

2003). A alta taxa de Staphylococcus aureus secretor de enterotoxina

cultivado da cavidade nasal e a recente evidência desta bactéria vivendo

como biofilme nos pacientes com RSCcPN aumentam a evidência de um

papel importante nesta doença. Eles também são capazes de viver dentro

de células e dentro da mucosa nasossinusal (Fokkens, 2007). Talvez, isto

justifique o fato que alguns SAB não são encontrados em associação com

uma resposta Th2.

Hipotetizamos na publicação da primeira parte desta tese que os SAB

produzindo Sag poderiam estar significativamente associados com a

RSCcPN (Bezerra, 2011). Foreman e cols. haviam publicado um estudo que

mostrou que os paciente com RSC, e não apenas com a RSCcPN, em que

foram encontrados SAB apresentavam um pior prognóstico do que os

pacientes em que foram encontradas outras bactérias, como o Haemophilus

influenza (Foreman, 2010). Eles mostraram que o SAB estava associado

com sintomas mais graves e uma piores imagens tomográficas.

Posteriormente a primeira publicação desta tese, Foreman e cols.

publicaram uma evidência da ligação entre os biofilmes de Staphylococcus

aureus e um desvio da resposta de células T em direção ao tipo Th2,

independentes do estado do pólipo e das atividades de superantígeno

(Foreman, 2011). Eles sugeriram que outros mecanismos deveriam ter um

papel se os SAB ainda interage com o hospedeiro na RSC na ausência do

SAB e IgE específica para Superantígenos combinada na maioria dos

pacientes com SAB. Talvez o modo de ação do SAg e do SaB possa ser

independente como os resultados de Foreman e cols. sugerem, mas

acreditamos que estudos com amostras maiores mostrem no futuro alguma

interrelação entre essas duas variáveis.

O motivo de não termos encontrado uma diferença estatísticamente

significante na pontuação dos questionários pode ter ocorrido porque alguns

Discussão

39

biofilmes identificados pela MEV podem não ter sido compostos por SA, mas

por Staphylococcus coagulase-negativo. A resposta inflamatória desviada

pela presença de Sab independente do grau da polipose poderia ser o real

problema da RSCcPN. Outra importante observação é que, a avaliação clínica

dos pacientes a partir da quantificação isolada de cada sintoma dos pacientes

realizadas por estudos anteriores, ao invés de questionários de qualidade de

vida previamente validados podem mostrar resultados menos consistentes

(Bendouah, 2006; Psaltis, 2008). Os questionários nos permitem uma

avaliação mais ampla da morbidade da doença para estes pacientes.

Atualmente, a mais importante pergunta a ser respondida talvez seja:

o Staphylococcus aureus predisposto a formar biofilme ao encontrar uma

mucosa com uma resposta inflamatória previamente desviada para o padrão

Th2 e metaplásica ativaria o seu fenótipo de biofilme para se estabelecer; ou

a presença do SAB na mucosa é que induziria o desvio da resposta para

uma resposta inflamatória padrão Th2 e consequente agressão e metaplasia

da mucosa (Bezerra, 2011; Foreman, 2011). O estudo de Foreman e cols.

mostrou que estes dois fatores agem de forma indepentente (Foreman,

2011). Outra questão importante seria analisar como este modelo se encaixa

na RSCcPN associada à intolerância à aspirina.

A primeira limitação deste estudo foi o método escolhido para identificar

os biofilmes, embora vários estudos anteriores também escolheram esses

método(Cryer, 2004; Sanclement,2004; Ramadan, 2005). Alguns autores têm

criticado esta técnica de identificação do biofilme, mais outros autores tem

concordado que este método é consistente e confiável como a CSLM,

considerado o melhor método para avaliar o biofilme na RSC, mas que pode

produzir muita interferência de fundo (Post, 2001; Zuliani, 2006; Perloff, 2004;

Cryer, 2004; Ferguson , 2005; Sanclement, 2005; Psaltis, 2008; Hekiert,

2009). Estávamos cientes da possibilidade de alguns artefatos poderem se

parecer com biofilmes na MEV, como coágulos e muco, por causa de

desidratação e ligações cruzada protéicas. Outra dificuldade sugerida, é que a

desidratação ao ponto crítico poderia murchar e distorcer a arquitetura, mas

os artefatos são ainda facilmente reconhecidos. O muco foi removido da

Discussão

40

superfície da mucosa através da agitação das amostras em glutaraldeído por

5 minutos, logo após a coleta (Biedlingmaier, 1998). Ao comparar os

resultados do presente estudo com os do considerado o melhor método, o

percentual de pacientes com biofilme detectado sugere que o nosso método

não reduziu a precisão e nos ajuda a encontrar algumas imagens que são

similares à outros estudos (Foreman, 2010).

Os pacientes escolhidos como controle são outra limitação do

presente estudo. Eles não tinham fossas nasais completamente saudáveis,

embora não tivessem o diagnóstico de RSC. O fato da obstrução nasal

crônica poder ter afetado a mucosa nasossinusal e presumivelmente

justificar em parte os resultados nos controles. Psaltis e cols. escolheram

como controles pacientes que seriam submetidos acesso cirúrgico

trasfenoidal e que provalvemente teriam uma mucosa mais saudável do que

os do nosso estudo (Psaltis, 2008). Por outro lado, os nossos resultados

foram similares à Sanderson e cols., que também escolheram pacientes que

seriam submetidos a septoplastia e relataram resultados similares à Psaltis e

cols. (Sanderson, 2006; Psaltis, 2008)

Os pacientes no presente estudo não foram submetidos a cirurgia

endoscópica prévia, embora o hospital seja um unidade terciária de

atendimento. Nossa amostra composta apenas de pacientes submetidos a

FESS pela primeira vez para RSCcPN após falha do tratamento clínico pode

nos ajudar a avaliar a relação primária entre a mucosa sinusal não

submetida à agressão cirúrgica e remodelamento pós-operatório; e os

biofilmes na via aérea superior.Algumas discrepâncias entre os resultados

apresentados aqui e outros previamente publicados podem pode ter sido

resultado de diferentes modalidades para detecção utilizadas, diferentes

amostras de pacientes estudadas ou erros de amostragem ou analítico.

O presente estudo concorda com os estudos anteriores que os

biofilmes estão associados com a RSC, embora não tenhamos encontrados

uma associação forte. Os biofilmes podem desempenhar um papel na

fisiopatologia da RSCcPN, como já foi previamente demonstrado, mas a

presença consistente dos biofilmes nos tecidos nasossinusais dos pacientes

Discussão

41

com RSC e também dos controles nos conduz a acreditar que não apenas a

presença destas estruturas possam desempenhar um papel na patogênese

ou na persistência da RSC, mas também o tipo de espécie de cepa

bactériana que está presente dentro dele pode unir-se a outros fatores

desconhecidos do hospedeiro responsáveis pela recalcitrância desta

doença. No futuro, as opções de tratamento podem ser direcionadas em

muitas formas para remover esses prováveis ninhos produtores de biofilmes

da mucosa nasossinusal dos pacientes com RSCcPN, porque os

procedimentos cirúrgicos não tem provado ser uma alternativa de sucesso

para todos os pacientes. Talvez alguns procedimentos cirúrgicos mais

agressivos possam eliminar a RSCcPN, mas no futuro, opções de

tratamentos mais conservadores como a terapia de substituição bacteriana

contra estas cepas de estafilococcus podem ajudar a resolver esta doença.

Embora a presença do biofilme possa não ser o problema em alguns

pacientes, as espécies dentro deles podem ser a parte do problema, como

demonstrado pela presença de biofilmes nos pacientes do grupo controle

que não tinham RSCcPN.

Este estudo foi o primeiro estudo publicado que analisou a presença

do biofilme em um grupo de pacientes com o diagnóstico exclusivo de

RSCcPN. Esta também é a primeira vez que os resultados foram analisados

estatisticamente com um estudo do tipo caso controle, ainda que amostra

precisaria sem bem maior para um estudo adequado deste tipo. Estudos

futuros com um tamanho amostral aumentado nos dará poder estatístico

suficiente para avaliar esses resultados. Nós acreditamos que não

alcançamos um resultado estatísticamente significativo em algumas dessas

análises devido ao pequeno tamanho amostral.

No momento da submissão, este estudo aparenta ser a primeira

publicação a analisar o prognóstico relacionado com a presença do biofilme

em um grupo de pacientes compostos unicamente por pacientes com

RSCcPN através de questionários de QV.

Conclusões

42

7 Conclusões

Mostramos a presença de biofilmes em pacientes submetidos a

cirurgia endoscópica para rinossinusite crônic com polipose nasossinusal e

também em pacientes do grupo controle. Este fato sugere que apenas o

biofilme pode não ser suficiente para causar rinossinusite crônica sem outros

co-fatores e que fatores relacionados ao hospedeiro podem ser

responsáveis pela patogênese do biofilme. A presença de biofilmes nos

pacientes do grupo controle pode implicar que os biofilmes, possam

simplesmente ser colonizadores em uma parcela dos pacientes e, talvez,

não sejam a chave para essa doença. Acreditamos que possam ser

responsáveis em parte por esta doença em alguns pacientes, ou possam

agir como agravantes em outros casos, mas que não sejam a única chave

para esta doença.

A presença dos biofilmes relacionou-se no pré-operatório dos

pacientes com rinossinusite crônica com polipose nasossinusal com pior

qualidade de vida doença-específico para obstrução nasal e pior avaliação

endoscópica; e no pós-operatório com melhores resultados endoscópicos.

Nosso estudo concorda com as publicações anteriores que os

biofilmes estão associados com a RSCcPN, mais o papel da presença deste

“ninho” e da sua interação com a mucosa nasossinusal, que pode ser

independente da resposta inflamatória, necessita ser determinado por

estudos de coorte à longo prazo com SaB documentados por CLSM/FISH

em pacientes com histórias clínicas semelhantes, preferivelmente sem

cirurgia prévia.

index-58_1.png

Anexos

43

8 Anexos

index-59_1.png

Anexos

44

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