O tratamento da nefropatia avançada com losartan-hidroclorotiazida no modelo de ablação renal de 5/6 por Simone da Costa Alarcon Arias - Versão HTML

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Simone da Costa Alarcon Arias

O tratamento da nefropatia avançada com

losartan-hidroclorotiazida no modelo de

ablação renal de 5/6

Tese apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Doutor em

Ciências

Programa de Nefrologia

Orientadora: Dra. Clarice Kazue Fujihara

São Paulo

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

A

r i

a s, Simone da Costa Alarcon

O tratamento da nefropatia avançada com losartan-hidroclorotiazida no modelo

de ablação renal de 5/6 / Simone da Costa Alarcon Arias. -- São Paulo, 2012.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Nefrologia.

Orientadora: Clarice Kazue Fujihara.

Descritores: 1.Losartan 2.Hidroclorotiazida 3.Insuficiência renal crônica

4.Ablação renal 5/6

USP/FM/DBD-206/12

Dedico esta tese aos meus pais, Jorge e

Ivete, meu marido Thiago, ao meu irmão

Murilo e sua esposa Marilene. Vocês são

minhas referências de vida, um exemplo de

dedicação e respeito. Vocês, cada um ao seu

jeito, sempre apoiaram e deram base para

minha formação.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Dra. Clarice Kazue Fujihara, a quem devo

muito de minha formação como bióloga e também como pessoa. Durante

todos esses anos só tenho a agradecer os momentos que você

compartilhou comigo, como orientadora, amiga e conselheira. Muito

Obrigada!

Ao Prof. Dr. Roberto Zatz, cujo entusiasmo com a Ciência

impressiona e instiga todos à sua volta. Você é um exemplo de como uma

pessoa grandiosa pode também ser simples. Obrigada por toda a

paciência e disponibilidade!

À Carla Perez Valente a quem devo muito deste trabalho. Você foi

meu braço direito e esquerdo em muitos momentos desta tese. Você é

parte integrante não só das práticas aqui realizadas, mas também teve

um papel muito especial no meu crescimento. Muito obrigada pela

companhia de cada dia, pelos questionamentos, pela diversão e por me

ajudar em tudo!

À Dra Denise Malheiros por todos os momentos de discussão e

colaboração que foram indispensáveis para a conclusão deste projeto.

À Flavia Gomes Machado que sempre esteve ao meu lado e me

ajudou de todas as formas possíveis, sem palavras para agradecer tudo o

que você fez por mim, colega, amiga e madrinha... Você é uma pessoa

impar! Obrigada por tudo, sempre!

À Camilla Fanelli por todas as sugestões, discussões e

disponibilidade para ajudar nos meus experimentos. Sem contar todos os

momentos de alegria e descontração que passamos. Obrigada!

Ao Prof. Dr. Tales de Brito pela colaboração e por ceder os

anticorpos que permitiram a realização das duplas marcações.

À Dra Daisa David pela colaboração e apoio ao longo do meu

estudo.

À Cristiene Okabe que sempre esteve presente nos momentos em

que precisei de ajuda, paciência ou força. Você esteve disponível com

conselhos e carinho durante toda a minha trajetória. Obrigada!

Aos alunos Neto, Victor, Raquel e Beatriz pelo companheirismo,

força e colaboração durante toda essa fase.

À Claudia Sena que me acolheu durante a iniciação científica e

ensinou grande parte dos conhecimentos que tenho hoje. Sua ajuda foi e

ainda é indispensável.

À Grasiela Barlette por toda a disponibilidade e cuidado com os

cortes e colorações histológicas.

À Janice Pião pela cuidadosa manutenção do biotério e valiosa

ajuda todos os dias!

À Vivian Viana e Ricardo pelo apoio técnico no biotério.

À Luciene dos Reis pela paciência e incansáveis explicações. Seu

amor pela Ciência já me contagiou! Ainda terei muito a aprender com

você!

Ao Wagner Domingues pela disposição em ajudar em

absolutamente tudo que fosse necessário e até mesmo por corrigir os

meus longos cálculos de diluição.

A todos do LIM-16, pela companhia, colaboração e momentos

juntos. Obrigada por poder fazer parte deste ambiente científico,

agradável e familiar.

À Denise, Eliana e Pedro por toda ajuda nos assuntos

administrativos.

Ao meu marido Thiago, que sempre me apoiou, me incentivou e

torceu por mim em cada passo desta trajetória. Você é um exemplo de

caráter e bondade. As minhas conquistas são mais completas por você

estar ao meu lado!

À minha mãe Ivete e a meu pai Jorge, não tenho palavras para

descrever o quanto admiro a força e a perseverança de vocês. Busco

todos os dias fazer valer tudo o que vocês fizeram por mim. Obrigada pelo

apoio e amor durante toda a minha vida e, especialmente, durante a

conclusão deste trabalho!

Ao meu irmão Murilo, sua esposa Marilene e ao meu querido primo

Marcio. Vocês são minha fonte de energia! A torcida, o carinho, o cuidado

e o querer bem, nada no mundo paga esses momentos. Sou privilegiada

por tê-los ao meu lado!

À FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro.

Eterno, é tudo aquilo que dura uma fração de

segundo, mas com tamanha intensidade, que

se petrifica, e nenhuma força jamais o

resgata...

Carlos Drummond de Andrade

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO ................................................................

01

2. OBJETIVOS ....................................................................

08

3. MÉTODOS

................................................................

09

Protocolo 1

........... .....................................................

11

Protocolo 2

.......... ......................................................

15

Procedimentos

........ ..............................................

18

Análise estatística

.......... ............................................

26

4. RESULTADOS ................................................................

27

5. DISCUSSÃO

................................................................

69

6. CONCLUSÕES .............................................................

77

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

......................

78

LISTA DE ABREVIATURA

Abreviaturas

Significado

A

Anlodipina

AII

Angiotensina II

ALB

Albuminúria de 24 horas

ALDO

Aldosterona sérica

APAAP

Fosfatase alcalina anti-fosfatase alcalina PCNA

AQP-1

Canal de água localizado nos túbulos proximais

aRAT1

Antagonista do receptor AT1 da Angiotensina II

DRC

Doença renal crônica

EG

Esclerose glomerular

H

Hidroclorotiazida

Ht

Hematócrito arterial

Hz

Hidralazina

iECA

Inibidor da enzima conversora de Angiotensina II

IEG

Índice de esclerose glomerular

INT

Área intersticial fracional

IRCT

Insuficiência renal crônica terminal

L

Losartan

Infiltração de macrófagos

Nx

Ablação renal de 5/6

OAT1

Transportador de ânions orgânicos

PA

Pressão arterial

PAS

Ácido Periódico-Shiff

PC

Pressão sistólica caudal

PCNA

Antígeno nuclear de proliferação celular

PE

Peso Corpóreo

RFG

Ritmo de filtração glomerular

S

Sham

Scr

Creatinina sérica

SFB

Soro fetal bovino

SRA

Sistema renina-angiotensina

TBS

Solução salina tris-tamponada

Tg

Triglicérides plasmático

TGF-β

Fator de transformação do crescimento beta

NCC

Co-transportador sódio/cloreto

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Peso Corpóreo de 60 a 150 dias de Nx

29

Tabela 02. Peso Corpóreo de 120 a 210 dias de Nx

29

Tabela 03. Pressão caudal de 60 a 150 dias de Nx

32

Tabela 04. Pressão caudal de 120 a 210 dias de Nx

32

Tabela 05. Albuminúria de 60 a 150 dias de Nx

35

Tabela 06. Albuminúria de 120 a 210 dias de Nx

35

Tabela 07. Parâmetros bioquímicos após 60 a 150 dias de Nx

37

Tabela 08. Parâmetros bioquímicos após 120 a 210 dias de Nx 37

Tabela 09. Análise do tecido renal aos 60 e 150 dias de Nx

46

Tabela 10. Análise do tecido renal aos 120 e 210 dias de Nx

46

Tabela 11. Imuno-histoquímica após 60 e 150 dias de Nx

55

Tabela 12. Imuno-histoquímica após 120 e 210 dias de Nx

55

Tabela 13. Imuno-histoquímica após 60 e 150 dias de Nx

62

Tabela 14. Imuno-histoquímica após 120 e 210 dias de Nx

63

LISTA DE FIGURAS

Figura 01.

Sobrevida dos animais do protocolo 1

28

Figura 02.

Sobrevida dos animais do protocolo 2

28

Figura 03

Peso Corpóreo dos animais do protocolo 1

30

Figura 04

Peso Corpóreo dos animais do protocolo 2

30

Figura 05

Pressão Caudal dos animais do protocolo 1

33

Figura 06

Pressão Caudal dos animais do protocolo 2

33

Figura 07

Albuminúria dos animais do protocolo 1

36

Figura 08

Albuminúria dos animais do protocolo 2

36

Figura 09

Glicemia dos animais do protocolo 1 e 2

38

Figura 10.

Triglicérides dos animais do protocolo 1 e 2

39

Figura 11

Creatinina sérica do protocolo 1 e 2

41

Figura 12.

Potássio sérico dos animais do protocolo 1 e 2

42

Figura 13.

Aldosterona sérica dos animais do protocolo 1 e 2

44

Figura 14

Hematócrito arterial dos animais do protocolo 1 e 2 45

Figura 15

Microfotografias da morfologia glomerular

48

Figura 16

% de glomeruloesclerose do protocolo 1 e 2

48

Figura 17

Índice de glomeruloesclerose do protocolo 1 e 2

50

Figura 18

Distribuição das lesões glomerulares do protocolo 1 52

Figura 19

Distribuição das lesões glomerulares do protocolo 2 52

Figura 20.

Microfotografias da Área intersticial fracional

54

Figura 21.

Área intersticial fracional

54

Figura 22.

Microfotografias dos macrófagos intersticiais

57

Figura 23.

Infiltração de macrófagos do protocolo 1 e 2

57

Figura 24.

Microfotografias da marcação para AII intersticial

59

Figura 25

Expressão de células positivas para AII

59

Figura 26

Microfotografias da α-actina intersticial

61

Figura 27.

Marcação positiva para α-actina intersticial

61

Figura 28.

Microfotografias da marcação para PCNA

64

Figura 29.

Proliferação glomerular, tubular e intersticial

64

Figura 30.

Microfotografias da marcação para PCNA+AQP1

66

Figura 31.

Proliferação celular nos túbulos proximais

66

Figura 32.

Microfotografias da marcação para PCNA+NCC

68

Figura 33.

Proliferação celular nos túbulos distais

68

RESUMO

Arias, SCA. - O tratamento da nefropatia avançada com losartan-

hidroclorotiazida no modelo de ablação renal de 5/6. [Tese]. São Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2012.

A doença renal crônica (DRC) é hoje um sério problema de saúde

pública no Brasil e no mundo. Apesar de um número crescente de

publicações abordando os mecanismos que levam à DRC e à sua

progressão, são raros os estudos experimentais cujos resultados podem

ser transpostos para a prática clínica. Um dos motivos para essa

desproporção é o fato de que, em geral, o tratamento é iniciado em

concomitância com a instalação da doença, o que aumenta artificialmente

a eficácia da terapêutica, uma vez que os fatores patogênicos envolvidos

podem ser mais facilmente neutralizados. Resultados bem menos

animadores são obtidos se o tratamento é iniciado em fases mais tardias,

quando a interação entre esses fatores, muito mais complexa, exige

terapêutica mais vigorosa e a associação de dois ou mais fármacos.

No presente estudo, examinamos a evolução das lesões renais em

um modelo estabelecido de DRC – a nefrectomia de 5/6 (Nx) - e o efeito

de uma associação entre um bloqueador do receptor AT-1, o losartan (L),

e a hidroclorotiazida (H) – até agora, a mais eficaz manobra terapêutica

para o modelo em questão. Cento e noventa e seis ratos Munich-Wistar

machos e adultos foram submetidos a Nx e divididos em quatro grupos:

Nx, sem tratamento; L, recebendo monoterapia com L; LH, recebendo a

associação L + H; e AHHz, tratados com uma associação entre um

bloqueador de canais de cálcio, a anlodipina, um relaxante da

musculatura lisa, a hidralazina, e H. Este último grupo serviu para baixar a

pressão arterial (PA) independentemente do sistema renina-angiotensina

e assim funcionar como controle para esse parâmetro. Um grupo de ratos

submetidos a nefrectomia simulada (Sham) foi também estudado. Dois

protocolos de estudo foram seguidos. No primeiro (Protocolo 1), os

tratamentos foram iniciados 60 dias após Nx, visando simular uma fase

relativamente precoce da DRC, com comprometimento funcional e dano

estrutural ainda limitado. No segundo (Protocolo 2), os mesmos

tratamentos foram iniciados 120 dias após Nx, procurando mimetizar uma

DRC humana em estágio mais avançado.

Conforme esperado, a DRC progrediu para estágios mais

avançados em ambos os protocolos. No entanto, a gravidade da DRC e a

mortalidade no Protocolo 2 foram muito maiores do que no Protocolo 1.

Apesar dessas diferenças, a eficácia dos tratamentos foi comparável nos

dois protocolos. O tratamento com L promoveu proteção apenas parcial

contra os danos observados no Grupo Nx. A associação com H propiciou

proteção muito mais eficiente, logrando, em ambos os protocolos, trazer a

PA, a albuminúria, a taxa de proliferação celular tubular/intersticial e os

níveis plasmáticos de aldosterona a níveis inferiores aos observados

antes dos tratamentos. Apesar de não reverter a progressão da

glomeruloesclerose e da expansão/inflamação intersticial, a associação

LH deteve completamente, em ambos os protocolos, a progressão dessas

lesões. Por outro lado, a associação AHHz, embora também tenha

normalizado a PA, não impediu a progressão da nefropatia nem a da

albuminúria, indicando que o efeito protetor da associação LH não se

deveu a uma ação hemodinâmica sistêmica.

Conclusões: 1) os presentes resultados não apoiam o conceito

segundo o qual os tiazídicos deixam de funcionar em fases muito

avançadas da DRC, em que a maior parte da função renal já foi perdida;

2) a associação LH é eficiente mesmo em fases avançadas da nefropatia

no modelo Nx, detendo sua progressão e mantendo as lesões no nível

pré-tratamento, sem, no entanto, fazê-las regredir; 3) essa renoproteção

não pode ser explicada somente pelo efeito anti-hipertensivo observado,

embora não se possa descartar uma ação sobre a pressão

intraglomerular; 4) os mecanismos do efeito renoprotetor da associação

LH ainda não estão claros, embora seja provável que envolvam uma

combinação de efeitos hemodinâmicos e antiinflamatórios, além de uma

notável redução da produção de aldosterona.

SUMMARY

Arias, SCA. - Treatment of advanced nephropathy with a losartan-

hydrochlorothiazide association in the 5/6 renal ablation model. [Thesis].

São Paulo: Faculty of Medicine, University of São Paulo; 2012.

Chronic kidney disease (CKD) is a serious public health problem in

Brazil and worldwide. Despite a growing number of publications on the

mechanisms that lead to CKD and its progression, few experimental

studies can be translated into clinical practice. One possible reason for

this is that, in general, treatment is initiated in concomitance with the onset

of the disease, artificially increasing the effectiveness of therapy, since the

pathogenic factors involved are more easily neutralized. Far less

encouraging results are obtained if treatment is initiated at later stages,

when the much more complex interaction between these factors would

require more vigorous therapy and the association of two or more drugs.

In the present study, we examined the evolution of renal injury in an

established model of CKD - 5/6 nephrectomy (Nx) - and the effect of an

association between a blocker of the AT-1 receptor, losartan (L), and

hydrochlorothiazide (H) - so far, the most effective therapeutic regimen for

the Nx model. One hundred ninety-six adult male Munich-Wistar rats were

subjected to Nx and divided into four groups: Nx, no treatment; L,

receiving L monotherapy; LH, receiving the L+H association, and AHHz,

treated with a combination of the calcium channel blocker, amlodipine, the

smooth muscle relaxant, hydralazine, and H. This latter group was used to

lower blood pressure (BP) independently of the renin-angiotensin system,

thus functioning as a control for this parameter. A group of rats subjected

to sham nephrectomy (Sham) was also studied. Two study protocols were

followed. In the first (Protocol 1), the treatments were initiated 60 days

after Nx, aiming to simulate a relatively early stage of CKD, when

functional and structural damage is still limited. In the second protocol

(Protocol 2), the same treatments were started 120 days after Nx, to mimic

advanced human CKD.

As expected, CKD progressed to more advanced stages in both

protocols. However, mortality and the severity of CKD were much higher in

Protocol 2 than in Protocol 1. Despite these differences, the effectiveness

of treatments in the two protocols was comparable. L treatment promoted

only partial protection against the renal damage observed in Group Nx.

The association with H provided much more efficient protection: in both

protocols, BP, albuminuria, the rate of tubular/interstitial cell proliferation

and plasma aldosterone regressed to lower levels than those observed

before

treatment.

Although

glomerulosclerosis

and

interstitial

expansion/inflammation were not reversed, LH treatment completely

detained the progression of renal injury in both protocols. On the other

hand, the AHHz association, despite normalizing BP, failed to prevent the

progression of albuminuria and renal injury, indicating that the protective

effect of the LH association was not due to a systemic hemodynamic

action.

Conclusions: 1) the present results do not support the contention

that thiazides have no effect in very advanced stages of CKD, in which

most of the kidney function has been lost, 2) the LH association is

effective even in advanced stages of nephropathy in the Nx model,

arresting progression and keeping injury at pretreatment levels, although it

promotes no regression of the renal lesions; 3) LH-induced renoprotection

cannot be explained simply by its antihypertensive action, although an

effect on intraglomerular pressure cannot be excluded, 4) the mechanisms

of LH renoprotection remain unclear, although they are likely to involve a

combination of anti-inflammatory and hemodynamic effects, besides a

remarkable reduction in the production of aldosterone.

1. INTRODUÇÃO

A doença renal crônica (DRC) foi inicialmente descrita, em 1827,

por Richard Bright, que associou a presença de albuminúria e edema às

alterações renais observadas em autópsias e acabou emprestando seu

nome a essa condição clínica, que durante mais de um século foi

conhecida como “Doença de Bright”. Uma das principais características

morfológicas da Doença de Bright era o aspecto “contraído e granular” do

rim, resultante da esclerose dos glomérulos associada à fibrose do

parênquima renal, levando à perda quase total da função renal. Desde a

primeira descrição da doença de Bright até os dias de hoje, houve grande

avanço na compreensão e tratamento da DRC. No entanto, o número de

pacientes com insuficiência renal crônica terminal (IRCT) e em

necessidade de diálise crônica ou transplante renal vem aumentando em

todo o mundo (1) em grande parte como resultado do envelhecimento da

população mundial, associado ao aumento da incidência de diabetes tipo

2 (2). No Brasil, a IRCT faz com que anualmente cerca de 30.000 novos

pacientes sejam incluídos em programas de diálise e 4.000 a 4.500

pacientes recebam um enxerto renal (3). Nesse contexto, torna-se

necessária uma melhor compreensão dos mecanismos que levam à

progressão das nefropatias crônicas progressivas à fibrose do tecido

renal, não só em vista do interesse acadêmico e científico que o assunto

suscita, como também para possibilitar o desenvolvimento de terapias

capazes de retardar ou impedir a evolução desses processos para IRCT.

1

Mecanismos de lesão renal na DRC

Os mecanismos envolvidos na progressão da DRC ainda estão

longe de serem esclarecidos e o desenvolvimento de terapias eficazes

parece ainda mais longínquo. No entanto, alguns mecanismos básicos

parecem bem estabelecidos. Um deles é a agressão mecânica aos

glomérulos, que consiste em um aumento da tensão imposta às paredes

de suas alças capilares por uma ação combinada da elevação da pressão

hidráulica e da hipertrofia do tufo glomerular. A hipertensão/hipertrofia

glomerular acompanha um grande número de nefropatias progressivas,

como resultado da perda crônica de néfrons e da sobrecarga aos néfrons

remanescentes, ou até mesmo precedendo as lesões renais, como no

caso da nefropatia diabética (4-7). Um segundo grupo importante de

mecanismos de lesão renal crônica é o das alterações inflamatórias do

tecido renal, representadas por eventos tais como a produção de citocinas

e quimiocinas, o influxo de células inflamatórias, a proliferação celular e a

infiltração do interstício renal por miofibroblastos, eventos esses que

terminam por levar ao acúmulo de matriz extracelular e ao

desenvolvimento de fibrose renal (8, 9).

Diversos estudos clínicos (10, 11) e experimentais (12, 13) indicam que a Angiotensina II (AII), o principal componente do sistema renina-angiotensina (SRA), bem como seu receptor AT1, estão envolvidos na

patogênese da DRC. A inibição farmacológica da AII através do uso de

inibidores da enzima conversora de AII (iECA) ou de antagonistas dos

receptores AT1 (aRAT1), atenua a hipertensão sistêmica e glomerular

2

associada à diminuição das lesões renais. Além desse efeito

hemodinâmico, a AII participa de um grande número de eventos celulares

envolvidos na patogênese da DRC (8, 9) e da produção de citocinas (8,

9), fatores de crescimento, incluindo o TGF-β (14, 15) e moléculas de adesão (16, 17), além de influenciar a proliferação de linfócitos (17) e fibroblastos, favorecendo assim o desenvolvimento de fibrose renal (18).

Por outro lado, o tratamento com iECA ou aRAT1 diminui a expressão de

TGF-β (19-21), atenua a proliferação de macrófagos e miofibroblastos (9,

22) e diminui a expressão de fatores de crescimento (23, 24) e moléculas de adesão (25, 26).

O modelo de ablação renal de 5/6

A ablação renal de 5/6 (Nx), um dos modelos de DRC mais

frequentemente utilizados, caracteriza-se pelo rápido desenvolvimento de

proteinúria maciça, glomeruloesclerose e fibrose intersticial, em

associação com hipertensão sistêmica e glomerular (6, 27), além de intensa

inflamação

do

parênquima

renal,

especialmente

no

compartimento intersticial (13, 27-29). Como em outros modelos de DRC, a AII tem participação fundamental na patogênese da nefropatia

associada à Nx. Coerentemente, o tratamento com iECA e aRAT1,

mesmo em monoterapia, previne com eficiência essas lesões renais

quando iniciado nas primeiras 2 semanas após a ablação renal (6, 13, 21,

30). No entanto, quando o tratamento é iniciado em fases mais tardias, quatro semanas ou mais após a ablação renal, a inibição da AII já não

3

exerce um efeito renoprotetor tão eficiente ou duradouro (31-35), mesmo

quando as doses utilizadas são muito altas (36). Esses achados indicam

que os eventos hemodinâmicos e/ou celulares que ocorrem logo após a

nefrectomia de 5/6 são cruciais para a evolução da nefropatia, e que,

quando o processo atinge um certo estágio de desenvolvimento, seu

controle torna-se muito mais difícil (37).

Efeito renoprotetor dos tiazídicos: droga antiga, evidências novas

Uma vez que o uso de supressores do SRA não oferece

renoproteção completa ou duradoura contra a progressão da DRC, tem

havido inúmeras tentativas de aumentar sua eficiência associando-os a

outras drogas (38, 39). Em estudos desenvolvidos neste Laboratório,

administramos a ratos Nx (a partir de 30 dias após a remoção de massa

renal) uma associação de um aRAT1, o losartan, com o imunossupressor

micofenolato mofetil (32) ou com um inibidor inespecífico da ciclo-

oxigenase, o nitroflurbiprofen (35). Em ambos os casos, a associação

revelou-se mais eficaz do que as monoterapias, mas a proteção conferida

foi ainda incompleta. Embora tenham auxiliado a avançar nosso

conhecimento sobre a patogênese da DRC, esses estudos são de difícil

aplicação clínica, tendo em vista o alto custo e a toxicidade das drogas

associadas.

Os tiazídicos têm sido amplamente utilizados na terapêutica de

estados edematosos e da hipertensão leve ou moderada (40). No entanto,

predomina o conceito de que o uso de tiazídicos não é indicado na DRC

4

avançada, com RFG inferior a 30 ou 40 ml/min/1,73 m2, que dificultaria o

acesso dos tiazídicos aos túbulos renais. No entanto, as evidências em

apoio a esse conceito são escassas (41, 42). Na verdade, sabe-se que embora o RFG esteja realmente diminuído na DRC avançada, o RFG e o

fluxo plasmático renal por néfron estão aumentados (6, 30, 31, 43). Além disso, outros estudos indicaram que, tanto quanto os diuréticos de alça,

os tiazídicos são secretados pelos túbulos proximais através de um

transportador de ânions orgânicos, o OAT1, podendo assim facilmente

alcançar o cotransportador sódio-cloreto no túbulo convoluto distal, ali

exercendo seu efeito natriurético (44). Em consonância com esses

achados, estudos clínicos mais recentes (45-47) trouxeram evidências de

que os tiazídicos continuam agindo mesmo após a função renal haver

caído a níveis muito baixos. Além disso, o efeito anti-hipertensivo (48), antiproteinúrico e renoprotetor (47, 49) dos supressores do SRA é amplificado quando essas drogas são associadas a um tiazídico, mesmo

em pacientes com DRC avançada.

Outra objeção ao uso contínuo de tiazídicos em pacientes

hipertensos e/ou portadores de DRC são seus efeitos metabólicos

adversos: hiperuricemia, resistência à insulina com intolerância à glicose

e dislipidemia (50). Esses efeitos têm sido descritos em diversos estudos

clínicos, embora sua intensidade e relevância sejam motivo de

controvérsia (40, 48). Um estudo experimental (51) trouxe evidência de que o uso crônico de tiazídico em ratos normais provoca hiperglicemia,

resistência

à

insulina,

hipertrigliceridemia,

hiperaldosteronismo,

5

hipocalemia e até mesmo lesões renais, com isquemia glomerular,

espessamento da membrana basal tubular, além de inflamação intersticial

e proteinúria discreta. No entanto, o efeito adverso do uso dos tiazídicos

sobre a mortalidade e a morbidade cardiovasculares pode ser menor do

que se esperaria tendo em vista as alterações metabólicas que provocam.

Examinando um subgrupo do estudo ALLHAT, Wright e colaboradores

(40) mostraram recentemente que o risco relativo de desenvolver

insuficiência cardíaca ou IRCT foi menor em pacientes com síndrome

metabólica tratados com clortalidona, apesar das alterações metabólicas

associadas, do que naqueles que receberam bloqueador de canal de

cálcio, iECA ou um alfa-bloqueador (52).

Com o objetivo de avaliar o efeito da combinação dessas drogas no

tratamento tardio da nefropatia associada ao Nx, examinamos, em estudo

anterior, o efeito do tratamento com losartan (L) e hidroclorotiazida (H) por

um período de 7 meses, inusitadamente longo para esse modelo (53). A

associação LH promoveu efeitos que chegaram a surpreender, com a

prevenção da mortalidade, da albuminúria, da hipertensão e da

insuficiência renal de uma maneira completa e prolongada, não

observada com as respectivas monoterapias, indicando a ocorrência de

um eficaz sinergismo entre L e H. Os mecanismos responsáveis por esse

efeito não estão claros. É possível que a normalização da pressão arterial

sistêmica e da pressão glomerular tenha tido um papel relevante nesse

sentido. No entanto, não sabemos se esse efeito hemodinâmico foi devido

simplesmente à ação natriurética da H, ou se houve alguma possível ação

6

vascular da droga (54). De qualquer forma, o efeito renoprotetor

observado com a associação losartan/hidroclorotiazida foi o maior já

obtido com o modelo Nx neste laboratório e, acreditamos, em toda a

literatura, uma vez que não há outros relatos de sobrevivência de ratos Nx

por tanto tempo, livres de hipertensão ou progressão significativa da DRC.

Apesar desses resultados surpreendentes, cabem duas críticas

importantes em relação a esse estudo experimental: 1) Em pacientes com

DRC avançada, a perda acentuada de néfrons decorre de um longo

processo de inflamação e fibrose, enquanto no modelo Nx a redução do

número de néfrons resulta de uma intervenção cirúrgica e, mesmo depois

de 30 dias, o grau de inflamação do tecido renal ainda é relativamente

limitado. 2) Não ficou claro o possível papel protetor da queda da pressão

arterial sistêmica (PA) promovida pelo tratamento LH. Há pesquisadores

que defendem a ideia de que a renoproteção associada a um tratamento

anti-hipertensivo é decorrente exclusivamente da redução na PA

sistêmica e independente de outros fatores intrarenais (55, 56). O

tratamento mais utilizado como “controle pressórico sistêmico” é a

associação entre drogas com atividade diurética, vasodilatadora e beta

bloqueadora. Embora essa associação de drogas seja eficiente na

normalização da PA quando o tratamento é iniciado precocemente (13,

36), o mesmo resultado não foi observado quando o início do tratamento

foi tardio (40).

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2. OBJETIVOS

I)

Verificar se a associação de Losartan e Hidroclorotiazida é capaz

de deter a progressão da glomeruloesclerose em fases muito mais

avançadas do modelo Nx, já com a presença de fibrose renal extensa,

mimetizando assim o observado na DRC humana avançada.

II)

Avaliar o papel do efeito pressórico da associação LH na

nefroproteção obtida com esse tratamento no modelo Nx.

III)

Examinar os efeitos metabólicos do tratamento prolongado com

hidroclorotiazida no modelo Nx.

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3. MÉTODOS

Utilizamos 234 ratos Munich-Wistar machos e adultos (2-3 meses

de idade), pesando entre 230 e 260 gramas. Os animais foram obtidos de

uma colônia de linhagem de ratos estabelecida no biotério do Laboratório

de Fisiopatologia Renal, com temperatura ambiental de 231oC, umidade

relativa de 605% e ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Todos os ratos do

estudo foram mantidos em dieta obtida comercialmente (Nuvilab, Curitiba,

PR, Brasil), acrescida de 15% de caseína. Os procedimentos

experimentais utilizados seguiram as normas da Comissão de Ética do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo (CAPPesq, protocolo No. 0689/08).

Obtenção do modelo experimental:

Os animais foram anestesiados com uma solução de ketamina

(Cristália®, 50 mg/kg) e rompun (Bayer®, 10 mg/kg), intramuscular. Após

assepsia, foi realizada a laparotomia mediana e ligadura de 2 a 4 ramos

da artéria renal e infarto de 2/3 do rim esquerdo. O rim direito foi

removido, obtendo assim a redução de 5/6 da massa renal total (Grupo

Nx). Após a cirurgia os animais foram mantidos em gaiolas aquecidas por

24 horas e medicados com antibiótico e analgésico.

Um grupo adicional de animais foi utilizado como grupo controle

(Grupo S), onde os ratos foram anestesiados e o pedículo renal foi

apenas manipulado, sem a retirada da massa renal. Os animais desse

grupo foram acompanhados durante todo o período de estudo e os

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resultados estão apresentados nas tabelas e nos gráficos abaixo.

Considerando que esses animais, ao contrário dos demais grupos,

apresentam os dois rins, os resultados foram utilizados somente como

referência e não sendo incluídos nas análises estatísticas.

Um dos objetivos do estudo foi verificar a possibilidade de

regressão ou prevenção das lesões renais em animais com nefrectomia

em fases tardias. Com esse intuito, iniciamos o tratamento em fases

distintas da nefropatia: avançada, iniciando os tratamentos após 60 dias

de Nx e outra muito mais avançada, iniciando os tratamentos após 120

dias de Nx. Desta forma, apresentamos os resultados em 2 protocolos