Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento de mecanismos dependentes de IgE e das fibras... por Alexandre Salgado Basso - Versão HTML

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ALEXANDRE SALGADO BASSO

Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento

de mecanismos dependentes de IgE e das fibras

nervosas do tipo C

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Patologia Experimental e

Comparada da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de

São Paulo para a obtenção do título de Doutor

em Ciências

Departamento:

Patologia

Área de Concentração:

Patologia Experimental e Comparada

Orientador:

Prof. Dr. João Palermo Neto

São Paulo

2004

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FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: BASSO, Alexandre Salgado

Título: Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento de mecanismos dependentes de IgE e das fibras nervosas do tipo C

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Patologia Experimental e

Comparada da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de

São Paulo para a obtenção do título de Doutor

em Ciências

Data:___/___/___

Banca Examinadora

Prof. Dr. _________________________ Instituição:________________________

Assinatura:________________________ Julgamento:________________________

Prof. Dr. _________________________ Instituição:________________________

Assinatura:________________________ Julgamento:________________________

Prof. Dr. _________________________ Instituição:________________________

Assinatura:________________________ Julgamento:________________________

Prof. Dr. _________________________ Instituição:________________________

Assinatura:________________________ Julgamento:________________________

Prof. Dr. _________________________ Instituição:________________________

Assinatura:________________________ Julgamento:________________________

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Admir e Itacy

Dos quais sempre recebo apoio

irrestrito e incondicional, sejam

quais forem os caminhos escolhidos

por mim.

AGRADECIMENTOS

À minha família; em essência, um tanto de italianos reunidos. Rimos juntos, choramos juntos, brigamos um bocado e, acima de tudo, nos gostamos muito e vibramos pela conquista de cada um como se fosse a nossa própria.

À Rita, de quem, desde que nos encontramos, recebo carinho, amor,

amizade e companheirismo. Caminhar ao seu lado torna as coisas mais fáceis e mais prazerosas.

Ao Prof. Dr. João Palermo-Neto, pela orientação, dedicação, confiança,

autonomia e liberdade durante todas as fases de execução deste trabalho.

Condições e atributos que considero fundamentais, não só na realização deste trabalho, como também na minha formação. Obrigado, João.

Ao Prof. Dr. Luiz Carlos de Sá-Rocha, ou como acredito que seja da sua preferência, ao grande Lu. Os meus agradecimentos a quem, apostando em mim juntamente com o João, foi o responsável direto pelos meus primeiros passos dentro de um laboratório de pesquisa. Valeu, chefia!

Ao Prof. Dr. Benjamin Eurico Malucelli, grande Bijo, pelas inúmeras

conversas regadas a boa música que aconteceram em ambiente onde se cultivam os amigos, a ciência e um sax bem tocado. Acho que nesse ambiente, sem

perceber, fui infectado pelo tal vírus da ciência. Valeu, Bijo!

Ao Prof. Dr. Luiz Roberto G. Britto, ao Adilson Alves e a todos do

laboratório de Neurobiologia Celular do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. A participação de vocês foi fundamental na realização do trabalho, mas além disso, e acho que mais importante, considero especial o convívio e os laços cultivados com todos ao longo destes anos. Sempre fui muitíssimo bem recebido por aí. Obrigado a todos!

Ao Prof. Dr. Momtchilo Russo, que além de colaborador é também um amigo de algum tempo. O seu jeito peculiar e único de pensar e encarar as questões científicas, e não só as científicas, favorece o desenvolvimento da curiosidade, da criatividade ao questionar. As conversas são sempre ótimas. Valeu, Momtchilo!

Agradeço também à Eliane Gomes, Dúnia, Daniel e Alex, seja pela colaboração ou pelos bate-papos sempre animados.

À Prof. Dra. Carol F. Elias, ao Prof. Dr. Jackson C. Bittencourt, à Jô e aos demais do Laboratório de Neuroanatomia Química do Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Cheguei aí com o intuito de aprender e realizar a metodologia de hibridização in situ e também fui muito bem recebido por todos no laboratório. Apesar de conviver com vocês há menos tempo, tenho certeza de que este convívio já rendeu e ainda renderá bons frutos. Obrigado pela ajuda e cooperação de vocês.

À Erika e ao Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de

Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo, pela estimada cooperação na dosagem sérica de corticosterona.

À Rosana Pagano, pela não menos estimada ajuda na execução do teste

utilizado para avaliar a eficiência do tratamento neonatal com capsaicina.

À todos os funcionários do Biotério e dos demais setores do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, sem os quais a realização deste trabalho seria impossível.

Às funcionárias do setor de Pós-graduação da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, pela atenção concedida sempre que solicitada.

Aos funcionários das Bibliotecas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pela colaboração durante toda a elaboração deste trabalho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela

concessão da bolsa de doutorado (00/07126-0) e pelo apoio financeiro ao Projeto Temático na área de Neuroimunomodulação (99/04228-7).

À todos os colegas de Pós-graduação, especialmente aqueles que compõem

o grupo de neuroimuno, não só pelo convívio, como também pela contribuição direta ou indireta na realização deste trabalho.

A alguns amigos da 57ª turma da Veterinária/USP: Zé Jensen, Cassiano,

Pavan, Jegão, Marco (Vaca) e, especialmente, Fredão, companheiro no exercício diário de pensar e fazer ciência ao longo de todos esses anos.

RESUMO

BASSO, A. S. Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento de mecanismos dependentes de IgE e das fibras nervosas do tipo C. [Neural correlates of food allergy: role of IgE-dependent mechanisms and sensory C-fibers]. 2004. 151 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004.

Embora alguns estudos tenham considerado a possibilidade da existência de uma relação direta entre alergia alimentar e alterações de comportamento, são escassas as evidências que sustentem esta hipótese. Relatamos neste trabalho que, após desafio oral com o antígeno, camundongos sensibilizados com ovalbumina (OVA) apresentaram maiores níveis de ansiedade, maiores níveis séricos de corticosterona e aumento da imunorreatividade para Fos no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) e no núcleo central da amígdala (CeA), áreas cerebrais relacionadas com emotividade. Os neurônios ativados pela alergia alimentar no PVN e no CeA são capazes de produzir fator liberador de corticotrofina (CRF). Os dados também demonstraram que a alergia alimentar leva à ativação do núcleo do trato solitário (NTS). Além disso, observamos que animais imunizados com OVA desenvolveram aversão à ingestão de uma solução contendo clara de ovo. Um tratamento com anticorpo anti-IgE ou a indução de tolerância oral bloquearam tanto o desenvolvimento da aversão à dieta contendo o antígeno quanto a expressão de c-fos no sistema nervoso central (SNC). Para investigar o modo pelo qual se dá a comunicação entre o cérebro e o intestino de animais com alergia alimentar, tratamos camundongos neonatalmente com capsaicina visando a destruição de fibras sensoriais do tipo C. O tratamento com capsaicina, embora não tenha impedido o desenvolvimento da aversão, diminuiu a sua magnitude. Ademais, este tratamento bloqueou completamente a ativação do PVN e diminuiu a expressão de c-fos induzida pela alergia alimentar no núcleo do trato solitário (NTS). Contudo, o tratamento com capsaicina não modificou a imunorreatividade para Fos no CeA de animais imunizados desafiados por via oral com o antígeno. Estes resultados demonstram claramente que a alergia alimentar influencia a atividade do SNC e o comportamento animal. Além disso, os dados obtidos evidenciam a participação de mecanismos dependentes de IgE e das fibras do tipo C na comunicação entre cérebro e o intestino de animais com alergia alimentar. De modo geral, além de enfatizar a relevância da integração entre os sistemas imune e nervoso na elaboração de respostas adaptativas, este estudo fornece subsídios para uma melhor compreensão de possíveis desordens de natureza psicológica em pacientes alérgicos.

Palavras-chave: Hipersensibilidade. Alimentos. Comportamento. Ansiedade.

ABSTRACT

BASSO, A. S. Neural correlates of food allergy: role of IgE-dependent mechanisms and sensory C-fibers. [Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento de mecanismos dependentes de IgE e das fibras nervosas do tipo C]. 2004. 151 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004.

Although many authors have considered the possibility of a direct interaction between food allergy and behavioral changes, the evidence supporting this hypothesis is elusive. Here we show that after oral OVA challenge allergic mice present higher levels of anxiety, increased serum corticosterone, and increased Fos expression in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) and in the central nucleus of the amygdala (CeA), which are both emotionality-related brain areas. Food allergy-activated neurons in the PVN and in the CeA are able to produce CRF. We found that food allergy also induced enhanced Fos immunoreactivity in the nucleus of tractus solitarii (NTS) of OVA-immunized animals.

Besides that, OVA-immunized animals developed aversion to an antigen-containing solution.

Treatment with anti-IgE antibody, or induction of oral tolerance abrogated both food aversion and the expression of c-fos in the central nervous system. In order to investigate the brain-gut communication in allergic animals, we have employed destruction of sensory C fibers by neonatal capsaicin treatment. Although this treatment did not block development of food aversion, it decreased the magnitude of such aversion. Moreover, we observed that while the degree of Fos staining in the NTS of allergic mice was only diminished by neonatal capsaicin, it was completely blocked in the PVN. However, capsaicin did not modify food alergy-induced c-fos expression in the CeA. Besides establishing a direct relationship between brain function and food allergy, our findings provide evidence showing that IgE-dependent mechanisms and the sensory C fibers play an important role in food allergy signaling to the mouse brain. Finally, this study creates a solid ground for understanding the etiology of psychological disorders in allergic patients.

Key words: Food allergy. Capsaicin. IgE. Behavior. c-fos. Anxiety. C-fibers. PVN. CeA.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -

Disposição dos neurônios aferentes primários intrínsecos e relação

com os neurônios aferentes primários espinhais e vagais que inervam

o intestino..............................................................................................

44

Figura 2 -

Esquema explicativo do delineamento experimental............................

51

Figura 3 -

Desenvolvimento de aversão à dieta contendo o antígeno em

camundongos alérgicos.........................................................................

62

Figura 4 -

Camundongos com alergia alimentar apresentam maiores níveis de

ansiedade...............................................................................................

64

Figura 5 -

Expressão de c-fos em regiões específicas do cérebro de

camundongos com alergia alimentar....................................................

66

Figura 6 -

Representação gráfica de corte de cérebro de camundongo ilustrando

região que corresponde ao núcleo paraventricular do hipotálamo

(PVN)....................................................................................................

66

Figura 7 -

Alergia alimentar leva à expressão de c-fos no PVN............................

67

Figura 8 -

Representação gráfica de corte de cérebro de camundongo ilustrando

região que corresponde ao núcleo central da amígdala (CeA)..............

68

Figura 9 -

Corte histológico de cérebro de camundongo que corresponde à

FIGURA 7.............................................................................................

68

Figura 10 - Alergia alimentar leva à expressão de c-fos no CeA............................

69

Figura 11 - Neurônios ativados pela alergia alimentar no PVN e no CeA são capazes de produzir fator liberador de corticotrofina (CRF)................

70

Figura 12 - Alergia alimentar leva à ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA).......................................................................................

71

Figura 13 - Tolerância oral impede o desenvolvimento de aversão à dieta contendo o antígeno em camundongos alérgicos..................................

73

Figura

14

-

Tolerância oral impede a ativação do PVN e do CeA em

camundongos alérgicos.........................................................................

73

Figura 15 - Tolerância oral impede a ativação do PVN..........................................

74

Figura 16 - Tolerância oral impede a ativação do CeA...........................................

74

Figura 17 - Níveis séricos de IgG1 e IgE específicas para OVA após indução de tolerância oral........................................................................................

75

Figura 18 - IgE é essencial para o desenvolvimento de aversão à dieta contendo o antígeno em animais alérgicos...........................................................

76

Figura 19 - IgE é essencial para a ativação do PVN e do CeA em camundongos alérgicos................................................................................................

77

Figura 20 - IgE é essencial para a ativação do PVN e do CeA em camundongos alérgicos. Seções coronais de cérebro...................................................

77

Figura 21 - Níveis séricos de IgG1 e IgE específicas para OVA após tratamento com anticorpo anti-IgE.........................................................................

78

Figura 22 - Tratamento neonatal com capsaicina diminui a magnitude da aversão à dieta contendo o antígeno em camundongos alérgicos, mas não

impede o seu desenvolvimento.............................................................

80

Figura 23 - Tratamento neonatal com capsaicina diminui a magnitude da aversão à dieta contendo o antígeno em camundongos alérgicos......................

81

Figura 24 - Tratamento neonatal com capsaicina diminui sensibilidade à dor visceral..................................................................................................

81

Figura 25 - Efeito do tratamento neonatal com capsaicina sobre a expressão de c-fos no cérebro de camundongos com alergia alimentar........................

83

Figura 26 - Efeitos do tratamento neonatal com capsaicina sobre a expressão de c-fos induzida pela alergia alimentar no NTS.......................................

84

Figura 27 - Efeitos do tratamento neonatal com capsaicina sobre a expressão de c-fos induzida pela alergia alimentar no PVN......................................

85

Figura 28 - Efeitos do tratamento neonatal com capsaicina sobre a expressão de c-fos induzida pela alergia alimentar no CeA.......................................

86

Figura 29 - Áreas do cérebro contendo neurônios que expressam fator liberador de corticotrofina (CRF).........................................................................

92

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT serotonina

ACTH hormônio

adrenocorticotrófico

BGG

gama globulina bovina

BSA

albumina bovina sérica

CCK colecistoquinina

CeA

núcleo central da amígdala

CRF

fator liberador de corticotrofina

EDTA ácido

dietilenodiaminotetracético

ELISA

enzime linked immunosorbent assay

HPA hipotálamo-hipófise-adrenal

IBS

síndrome inflamatória do intestino

ICV intracerebroventricular

Ig imunoglobulina

IL interleucina

IP intraperitoneal

LCE labirinto

em

cruz

elevado

LPS lipopolissacarídeo

de parede bacteriana

NDGA ácido

nor-dihidroguaarético

NE noradrenalina

NTS

núcleo do trato solitário

OPD ortofenileno-diamino

OVA ovalbumina

PAF

fator de agregação plaquetária

PB tampão

fosfato

PBS salina

tamponada

PVN

núcleo paraventricular do hipotálamo

SNC

sistema nervoso central

TSH hormônio

tireotrófico

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO..........................................................................................

19

2

REVISÃO DE LITERATURA.................................................................

20

2.1

Interações entre os sistemas imune e nervoso......................................... 20

2.2

Alergia alimentar....................................................................................... 30

2.3

Vias sensoriais do trato gastrointestinal.................................................. 38