Percepção neural da alergia alimentar: envolvimento de mecanismos dependentes de IgE e das fibras... por Alexandre Salgado Basso - Versão HTML

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OBJETIVOS............................................................................................... 49

3.1

Objetivos específicos.................................................................................. 49

4

MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 50

4.1

Animais....................................................................................................... 50

4.2

Procedimentos............................................................................................ 50

4.2.1

Imunização com ovalbumina (OVA)........................................................... 50

4.2.2

Teste de preferência..................................................................................... 51

4.2.3

Protocolo de indução de tolerância oral..................................................... 52

4.2.4

Tratamento neonatal com capsaicina para destruição das fibras do tipo C............................................................................................................

52

4.2.5

Teste de contorção abdominal para a avaliação da eficiência do

tratamento neonatal com capsaicina...........................................................

52

4.2.6

Tratamento com o anticorpo anti-IgE......................................................... 53

4.2.7

Análise Comportamental.............................................................................. 54

4.2.8

Marcação de ativação celular em núcleos específicos do SNC por meio da avaliação da expressão de c-fos.............................................................

55

4.2.9

Hibridização in situ para o Fator Liberador de Corticotrofina (CRF)..... 57

4.2.10 Dosagem de corticosterona no soro............................................................ 58

4.2.11 Determinação dos níveis de IgG1 específica para OVA no

soro...............................................................................................................

59

4.2.12 Determinação dos níveis de IgE específica para OVA no

soro...............................................................................................................

60

4.2.13 Análise Estatística........................................................................................ 61

5

RESULTADOS........................................................................................... 62

5.1

Qual é o comportamento de animais alérgicos frente à possibilidade de

ingerir um alimento contendo o antígeno (alérgeno)? ................................

62

5.2

Outras e quais outras alterações de comportamento poderiam ser

ocasionadas pela alergia alimentar? ...........................................................

63

5.3

Que alterações no sistema nervoso central (SNC) acompanham as

mudanças de comportamento observadas em camundongos com alergia

alimentar? ....................................................................................................

65

5.4

O desenvolvimento da aversão e a ativação do SNC podem ser

bloqueados pela indução de tolerância oral? ..............................................

72

5.5

Qual o envolvimento da IgE no desenvolvimento da aversão e na

ativação do SNC em animais com alergia alimentar? ................................

75

5.6

De que modo a informação gerada a partir da reação alérgica chega ao

SNC? Participação das fibras do tipo C......................................................

79

6

DISCUSSÃO............................................................................................... 87

7

CONCLUSÕES.......................................................................................... 111

REFERÊNCIAS......................................................................................... 112

ANEXO....................................................................................................... 127

Introdução 19

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1 INTRODUÇÃO

A entrada de macromoléculas no organismo através do tubo digestivo pode ter várias repercussões imunológicas. O estudo realizado por Cara (1995) utilizando antígenos presentes na dieta mostrou, de forma interessante, que o sistema imune interfere com o comportamento animal induzindo o desenvolvimento de aversão a uma dieta contendo o antígeno. Desta forma, frente à opção de ingerir água ou uma solução adocicada de clara de ovo, animais não imunizados preferem beber a solução doce, enquanto animais imunizados com ovalbumina (OVA) passam a preterir a solução doce que contém o antígeno, ingerindo preferencialmente água.

Trabalhos como esse remetem, naturalmente, a algumas perguntas: de que forma uma resposta imune desencadeada por antígenos presentes na dieta é capaz de modular o comportamento de um animal? Que tipo de informação é gerada por essa resposta imune?

Uma vez gerada esta informação, de que modo ela chega ao sistema nervoso central (SNC) e o que lá ocorre para alterar o comportamento do animal?

O modelo experimental utilizado por Cara (1995) e respostas às perguntas acima formuladas permitem uma discussão conceitual não apenas do papel do sistema imune na fisiologia animal como, também, da relevância da integração dos diferentes sistemas orgânicos na elaboração de respostas adaptativas frente a estímulos provenientes do meio externo. O presente trabalho privilegiará uma abordagem com ênfase nas interações entre os sistemas imune e nervoso com o objetivo de investigar os efeitos da alergia alimentar no sistema nervoso central (SNC) e, deste modo, avançar na tentativa de responder às questões acima delineadas.

Revisão de Literatura 20

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Interações entre os sistemas imune e nervoso

As interações entre mecanismos endócrinos e nervosos e a conseqüente

regulação/modulação de várias funções orgânicas são bem conhecidas e amplamente estudadas. Maior atenção tem sido concentrada nos últimos anos à análise das complexas relações existentes entre o sistema imune e o sistema neuro-endócrino. Na verdade, desde o trabalho pioneiro de Selye (1936) sabe-se que o SNC, pela mediação que exerce sobre funções neurovegetativas durante o estresse, é capaz de influenciar respostas orquestradas pelo sistema imune. Este autor, como se sabe, analisou as alterações ocasionadas durante o estresse, entre outras, no tamanho do timo, do baço e dos linfonodos, sabiamente chamadas por ele de síndrome de adaptação geral. No entanto, segundo Ursin (1994), apenas em 1977

surgiu o primeiro trabalho mostrando, de forma inequívoca, que uma situação de estresse de natureza psicológica é capaz de produzir alterações da função imune de maneira independente de hormônios (BARTROP et al., 1977). Nesse trabalho, os autores reportaram a ocorrência de uma redução na função de linfócitos após uma situação de luto (BARTROP et al., 1977).

Nesse sentido, em 1979, um grupo de cientistas responsáveis por grande parte dos avanços de conhecimento na área de neuroimunologia, liderado por Branislav D. Jankovic, demonstrou a existência de uma correlação antigênica entre timócitos, linfócitos B e vesículas sinápticas do cérebro de ratos. Especificamente, os autores mostraram nesse trabalho, por intermédio do uso de um soro produzido em coelhos contra vesículas sinápticas de ratos, que este reagia contra timócitos e linfócitos B em ensaios de citotoxicidade e imunofluorescência (JANKOVIC; HORVAT; MITROVIC, 1979). Segundo Blalock (1984) há uma razão bioquímica lógica para Revisão de Literatura 21

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que haja interações entre os sistemas imune e neuro-endócrino. De fato, os sistemas nervoso, endócrino e imune compartilham de receptores para citocinas, neurotransmissores, hormônios e neuropeptídeos. Além disso, produtos originalmente tidos como específicos de cada um destes sistemas coexistem em tecidos linfóide, endócrino e nervoso. Assim, por exemplo, há citocinas sendo produzidas no SNC e também hormônios, tais como ACTH e TSH, sendo sintetizados em células linfóides (BESEDOVSKY; DEL REY, 1996). A partir destas observações, começa-se a delinear o conceito de que há comunicação e relações entre os sistemas neuro-endócrino e imune que ocorrem em dois sentidos, isto é, tanto mecanismos neuro-endócrinos podem modular a atividade do sistema imune, quanto este pode influenciar a atividade do sistema neuro-endócrino (MADDEN; FELTEN, 1995).

É de se acreditar, portanto, que estímulos elétricos aplicados em áreas específicas do SNC interfiram com diversas respostas do sistema imune. Seguindo essa linha de raciocínio, ratos com eletrodos implantados no hipotálamo lateral e na área tegmental ventral, condicionados à aplicação de uma corrente elétrica por meio do ato de pressionar uma barra, e que tiveram essas áreas do cérebro estimuladas por quatro dias antes da imunização, apresentaram um incremento na resposta humoral específica a hemácias de carneiro (VLAJKOVIC et al., 1993). Esse parâmetro também foi analisado em animais imunizados com albumina sérica bovina (BSA) que tiveram eletrodos implantados nas mesmas regiões do cérebro, as quais foram estimuladas por 21 dias (3 vezes por semana) após a imunização; estes ratos também apresentaram maiores títulos de anticorpos contra BSA do que aqueles observados nos grupos controle e falso estimulado (VLAJKOVIC et al., 1993).

Outra forma de abordagem usada para o estudo das relações entre o SNC e o sistema imune se vale de modelos que envolvem lesões de estruturas específicas do SNC e da avaliação das alterações ocasionadas por estas lesões em parâmetros ligados à atividade do sistema imune (para revisão veja FELTEN et al., 1991). Dessa forma, ratos que tiveram o Revisão de Literatura 22

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locus ceruleus lesionado apresentaram uma menor produção de anticorpos contra BSA e uma redução no tamanho do timo e da população de linfócitos CD4+ no sangue periférico (NIKOLIC; JOVANOVA-NESIC; JANKOVIC, 1993). Além disso, em animais com lesão nessa mesma região verificou-se uma supressão das reações de hipersensibilidade tardia e de Arthus à BSA (JOVANOVA-NESIC; NIKOLIC; JANKOVIC, 1993). Lembra-se, nesse momento, de que o locus ceruleus é o núcleo onde se encontra a maior concentração de corpos celulares dos neurônios noradrenérgicos do SNC, situando-se no assoalho do IV

ventrículo (FRANKLIN; PAXINOS, 1996). As alterações observadas em fenômenos relacionados à ativação do sistema imune após a lesão deste núcleo sugerem uma estreita relação entre o sistema nervoso simpático e o funcionamento do sistema imune. De fato, há dados anatômicos que sustentam esta sugestão; já se verificou, por exemplo, que órgãos linfóides tais como timo, baço e linfonodos são intensamente inervados por fibras simpáticas (FELTEN, 1993).

Dados obtidos em nosso laboratório também fortalecem a noção de que o SNC

influencia parâmetros relacionados ao sistema imune. Assim sendo, foi demonstrado que não apenas estímulos estressores de natureza psicológica (MORGULIS et al., 2004; PALERMO-NETO; DE OLIVEIRA MASSOCO; ROBESPIERRE DE SOUZA, 2003), mas também

aqueles de natureza física (PALERMO-NETO; DE OLIVEIRA MASSOCO; ROBESPIERRE

DE SOUZA, 2003), são capazes de promover uma redução da fagocitose realizada por macrófagos e de tornar camundongos mais susceptíveis ao desenvolvimento do tumor de Ehrlich. Já em estudo no qual utilizou-se uma reação alérgica pulmonar como modelo experimental, verificou-se que um estressor de natureza física foi capaz de aumentar o número total de células no lavado bronco-alveolar de ratos imunizados e desafiados com OVA (PORTELA et al., 2001). De modo interessante, também verificou-se que a aplicação de estímulos estressores de natureza física em fêmeas prenhes, além de diminuir a resistência da Revisão de Literatura 23

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prole ao tumor de Ehrlich (PALERMO NETO; MASSOCO; FAVARE, 2001), reduziu a capacidade de fagocitar de macrófagos obtidos destes animais (FONSECA; MASSOCO; PALERMO-NETO, 2002; PALERMO NETO; MASSOCO; FAVARE, 2001).

Passaremos agora a explorar o outro sentido das relações entre o SNC e o sistema imune. Nesse aspecto, respostas imunes e modelos utilizados no estudo da inflamação são capazes de modular ou influenciar a atividade de áreas do sistema nervoso central e, dessa forma, o comportamento animal.

Em estudo conduzido no laboratório de Hugo Oscar Besedovsky, outro pesquisador de grande importância para o estabelecimento deste campo de estudo, demonstrou-se que após a imunização de ratos ocorria um aumento na atividade elétrica de neurônios do hipotálamo ventromedial que correspondia ao momento de pico da produção de anticorpos contra o antígeno (BESEDOVSKY et al., 1977). Posteriormente, outros estudos confirmaram estes achados, contribuindo para o conceito de que a atividade do sistema imune pode influenciar a atividade de áreas específicas do cérebro. Assim sendo, Saphier et al. (1987) realizaram um estudo no qual também avaliaram a atividade elétrica de determinadas regiões do SNC, tais como a área pré-óptica (hipotálamo anterior) e o núcleo paraventricular do hipotálamo, após a imunização de ratos com hemácias de carneiro. A atividade elétrica foi avaliada por meio da implantação de eletrodos nas áreas citadas. Na área pré-óptica registrou-se um aumento da atividade elétrica basal cujo pico ocorreu cinco dias após a imunização, de forma concomitante com o aparecimento de anticorpos específicos no soro. No terceiro e no oitavo dia após a imunização, os autores verificaram uma redução da atividade elétrica nessa área. Já no núcleo paraventricular, observou-se uma redução da atividade elétrica basal nos três primeiros dias após a imunização; a seguir, notou-se o restabelecimento da atividade basal e um aumento de atividade apenas no sexto dia após a imunização. Entre o nono e o décimo dia a atividade em ambas as regiões já se encontrava normal. Em uma re-exposição às hemácias, Revisão de Literatura 24

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verificou-se um aumento da atividade elétrica na área pré-óptica entre o quarto e o nono dia, com pico no sexto dia (SAPHIER et al., 1987).

Dados do grupo de Besedovsky parecem indicar que o aumento da atividade elétrica em áreas hipotalâmicas que se segue à imunização com hemácias de carneiro está relacionado à alterações no metabolismo de noradrenalina. Deste modo, observou-se que houve um decréscimo no conteúdo de noradrenalina no hipotálamo que, mais uma vez, ocorreu de modo concomitante ao pico da produção de anticorpos (BESEDOVSKY et al., 1983). De forma interessante, este trabalho também demonstrou que a redução no conteúdo de noradrenalina no hipotálamo podia ser reproduzida por mediadores solúveis liberados por células do sistema imune ativadas in vitro (BESEDOVSKY et al., 1983). Esta última observação fortaleceu o conceito de que alterações no cérebro podem ser provocadas pela ativação do sistema imune.

O trabalho de Carlson et al. (1987) relatado pouco depois, além de confirmar os achados do grupo de Besedovsky, chamou a atenção para alterações em um núcleo específico do hipotálamo: o paraventricular. Os resultados demonstraram uma redução na quantidade de noradrenalina, apenas e tão somente no núcleo paraventricular do hipotálamo, no quarto dia após a imunização com hemácias de carneiro. De fato, dois dias antes e oito dias após a imunização não foram verificadas quaisquer alterações no conteúdo deste neurotransmissor.

(CARLSON et al., 1987).

Desde 1975, o grupo de Besedovsky já tinha o conhecimento do fato de ser uma resposta imune capaz de alterar os níveis séricos de determinados hormônios, especialmente dos glicocorticóides. Nesse sentido, havia demonstrado que a imunização de ratos e de camundongos com diferentes antígenos levava a um aumento de até três vezes na concentração de corticosterona no sangue (BESEDOVSKY et al., 1975). Dados obtidos um pouco mais adiante reforçaram esta idéia ao mostrar que mediadores solúveis liberados por Revisão de Literatura 25

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células do sistema imune ativadas in vitro também eram capazes de aumentar os níveis séricos de corticosterona de ratos (BESEDOVSKY; DEL REY; SORKIN, 1981).

O conjunto de evidências obtidas pelo grupo de Besedovsky levava a crer que a ativação do sistema imune e a conseqüente produção de mediadores solúveis provocavam uma resposta endócrina desencadeada pelas ações destes mediadores no SNC. Talvez, a última peça para que este quebra-cabeça fosse definitivamente resolvido tenha surgido com a descoberta, pelo grupo de Wylie Vale, do fator liberador de corticotrofina (CRF) e da sua importância na ativação do eixo hipotálamo-pituitária(hipófise)-adrenal (HPA), que leva à produção de glicocorticóides (RIVIER et al., 1982; VALE et al., 1981). De fato, alguns anos depois, foi demonstrado pelo próprio grupo do Besedovsky que a injeção de interleucina 1

(IL-1), substância liberada, por exemplo, por macrófagos ativados, é capaz de promover um aumento dos níveis plasmáticos de ACTH e, também, de corticosterona via ativação do eixo HPA de ratos e camundongos (BESEDOVSKY et al., 1986). Também demonstrou-se que a ação da IL-1 se fazia por meio da ativação de neurônios produtores de CRF

(BERKENBOSCH et al., 1987).

Posteriormente, foi descoberto que a injeção intraperitoneal (IP) de IL-1 também era capaz de provocar um decréscimo no conteúdo de noradrenalina (NE) no hipotálamo de ratos (KABIERSCH et al., 1988). Estes autores avaliaram também um metabólito da noradrenalina, o MHPG; não só o conteúdo deste metabólito no hipotálamo, como também a razão MHPG/NE estavam aumentados após a injeção de IL-1. Este dado sugere que a redução observada no conteúdo de NE seja conseqüência de um efeito estimulante da IL-1 sobre o metabolismo desse neurotransmissor. Outros trabalhos (CHULUYAN et al., 1992; DUNN, 1988) correlacionaram alterações no metabolismo de noradrenalina (NE) com a ativação do eixo HPA, mostrando que o mecanismo pelo qual a IL-1 ativa tal eixo envolve modificações no metabolismo da NE hipotalâmica.

Revisão de Literatura 26

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A ativação do eixo HPA é entendida como um mecanismo de regulação no qual os hormônios liberados exercem um papel modulador de diversas funções orgânicas, entre as quais aquela de controlar um processo inflamatório e/ou infeccioso em curso, inibindo a produção da mesma IL-1 (DUNN, 1995).

A ativação do eixo HPA e a conseqüente liberação de ACTH e de glicocorticóides fazem parte das respostas neurovegetativas ligadas às situações de estresse e de ansiedade (RIVIER; VALE, 1983). A ativação do mesmo eixo pela IL-1, que pode ser produzida durante um processo inflamatório ou infeccioso, passa então, a ser considerada como parte de uma situação de estresse ou ansiedade, de forma semelhante àquela desencadeada por estímulos ambientais ou físicos (DUNN, 1995).

De fato, a administração de IL-1 em camundongos e ratos é capaz de promover diversas alterações comportamentais. Spadaro e Dunn (1990) verificaram que após 20

minutos da administração intracerebroventricular (ICV) de IL-1 camundongos tiveram a atividade exploratória diminuída. Nestas condições, os parâmetros relativos à atividade geral e grooming não sofreram qualquer alteração (SPADARO; DUNN, 1990). Outra alteração comportamental observada após a injeção de IL-1 foi a presença de anorexia (HELLERSTEIN et al., 1989). De fato, a administração IP ou ICV de IL-1 em ratos foi capaz de suprimir um comportamento operante recompensado com alimento. Observou-se que essa ação dependia tanto da ativação de receptores para IL-1 presentes no SNC quanto daqueles presentes na periferia. Assim, quando um antagonista de receptores de IL-1 era injetado pela mesma via e antes da IL-1, os efeitos da interleucina eram bloqueados. Por outro lado, observou-se que quando a via de administração do antagonista era diferente da utilizada para a injeção de IL-1, o bloqueio era parcial ou não ocorria (KENT et al., 1996).

O conjunto das alterações comportamentais observadas em animais após a injeção de IL-1 ou LPS foi denominado de comportamento doentio ( sickness behavior) (KENT et al., Revisão de Literatura 27

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1992). Importante salientar, neste momento, que o comportamento doentio não deve ser compreendido como um estado de depressão inespecífico e/ou generalizado do SNC, um efeito indesejável da doença, mas sim como uma estratégia altamente organizada que visa a adaptação do animal ao estímulo (no caso, uma infecção) e que, em última instância, pode ser crítico para a sua sobrevivência (HART, 1988).

A forma exata pela qual a IL-1 modula o comportamento animal não está totalmente esclarecida. Os dados de literatura são um tanto quanto contraditórios em alguns aspectos.

Assim, há trabalhos mostrando que as alterações comportamentais são dependentes do CRF

produzido no hipotálamo (DUNN; ANTOON; CHAPMAN, 1991) e outros negando tal fato (BLUTHE et al., 1992; SPADARO; DUNN, 1990). Há, também, trabalhos demonstrando a participação das prostaglandinas nas alterações comportamentais ocasionadas pela injeção de IL-1 (BLUTHE et al., 1992; HELLERSTEIN et al., 1989). Ademais, mostrou-se que as administrações de LPS e de alguns vírus, como o da doença de newcastle, mimetizam as alterações comportamentais, neuroquímicas e hormonais observadas após a administração IP

ou ICV de IL-1 (BESEDOVSKY; DEL REY, 1989). É muito provável que, nessas situações, diversos componentes atuem em conjunto na mediação dos eventos aqui abordados.

Além da administração de IL-1 ou LPS, outros modelos têm sido utilizados para o estudo das influências exercidas pelo sistema imune sobre o SNC. O condicionamento de eventos relacionados à resposta imune é um deles (para revisão veja ADER; COHEN, 1991).

Devido à sua ação imunossupressora e/ou devido ao desconforto que causa no trato gastrointestinal, animais “normais” evitam consumir soluções contendo ciclofosfamida bem como soluções doces que tenham sido associadas a essa droga. Entretanto, animais de uma linhagem de camundongos selecionada para manifestar uma doença autoimune, o lupus sistêmico, ingerem voluntariamente maiores quantidades de uma solução de leite achocolatado com ciclofosfamida do que os seus controles congênicos sadios. Além disso, Revisão de Literatura 28

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mostrou-se que esses animais bebem dessa solução a quantidade suficiente para reverter a linfoadenopatia que possuem e, também, para reduzir o alto título de anticorpos apresentado por eles (ADER, 1990). Esses achados são compatíveis com dados anteriores do mesmo autor, nos quais se observou não ser possível condicionar os animais que apresentam o lupus a ingerirem menores quantidades de soluções com sacarina após esse estímulo ter sido pareado com o outro, não condicionado: a injeção de ciclofosfamida. Exatamente o inverso do que ocorre com animais normais (ADER; GROTA; COHEN, 1987). É importante salientar que esses dados não têm relação com uma possível deficiência de aprendizado nos animais dessa linhagem, já que eles passam a evitar a solução doce caso ela seja associada ao cloreto de lítio. Com relação ao maior consumo da solução achocolatada com ciclofosfamida e a ausência da resposta condicionada nos animais que apresentam o lupus, o autor sugere haver, por parte desses camundongos, a capacidade de reconhecer os efeitos imunossupressivos exercidos pela droga. Assim, tendo associado o sabor da solução achocolatada aos efeitos imunossupressivos da ciclofosfamida, os animais se comportam de modo a corrigir as alterações imunológicas que apresentam. O autor sugere, então, que o SNC é capaz de receber e processar as informações de um sistema imune “desregulado” de tal forma a modular o comportamento dos camundongos.

Em trabalho publicado em 1988, Markovic e colaboradores, por intermédio de outro modelo, também apresentaram resultados que, segundo os mesmos, demonstram a capacidade de uma resposta imune atuar como aferência do SNC, o qual, a partir daí, modularia o comportamento dos animais. Assim, animais imunizados com OVA foram submetidos a um esquema de condicionamento no qual o estímulo não condicionado - uma injeção de OVA capaz de induzir choque anafilático - era apresentado juntamente com um estímulo condicionado - a ingestão de uma solução adocicada com sacarina. Vinte e quatro horas depois, os animais eram submetidos a um teste de preferência com dois bebedouros, um Revisão de Literatura 29

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contendo água e o outro contendo a mesma solução adocicada com sacarina. Os animais imunizados submetidos ao condicionamento passaram a rejeitar a solução com sacarina, enquanto os do grupo controle preferiram ingerir a solução adocicada (MARKOVIC et al., 1988). O condicionamento da resposta foi mantido durante os seis dias consecutivos em que os animais passaram pelo teste de preferência. Em trabalho realizado pelo mesmo grupo, foi demonstrado que a dose de antígeno utilizada para provocar o choque anafilático e os sinais clínicos do mesmo (hematócrito e temperatura retal) correlacionaram-se de modo positivo com a porcentagem de preferência à solução com sacarina, ou seja, a maior dose de antígeno, que provocou os sinais clínicos mais evidentes, foi a dose que levou à menor porcentagem de preferência pela solução com sacarina (DJURIC et al., 1988).

Estudos envolvendo respostas condicionadas também exploraram o sentido inverso das relações entre os sistemas imune e nervoso, ou seja, já se demonstrou também que respostas imunes podem ser condicionadas. Talvez, o estudo pioneiro nesta área tenha sido aquele relatado por Ader e Cohen em 1975. Neste trabalho os autores demonstraram, em ratos imunizados com hemácias de carneiro, uma supressão condicionada da produção de anticorpos após a associação de ciclofosfamida (estímulo não condicionado que de fato causa imunossupressão) com uma solução adocicada com sacarina (ADER; COHEN, 1975). De modo muito interessante, outros trabalhos têm demonstrado que também é possível o condicionamento da produção de anticorpos. Assim sendo, a re-exposição à sacarina, anteriormente associada ao antígeno no momento da primeira imunização, foi capaz de induzir um aumento na produção de anticorpos específicos em ratos (ALVAREZ-BORDA et al., 1995). A magnitude da resposta foi semelhante àquela apresentada pelos animais que foram de fato submetidos à uma segunda imunização ( booster) (ALVAREZ-BORDA et al., 1995). Este experimento foi replicado por outro grupo, reforçando a idéia de que o condicionamento pode levar à produção de anticorpos específicos independentemente da Revisão de Literatura 30

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presença do antígeno (MADDEN et al., 2001). Ademais, foi relatado que a lesão do córtex insular ou da amígdala impede a produção condicionada de anticorpos (RAMIREZ-AMAYA; BERMUDEZ-RATTONI, 1999). Por fim, já foi demonstrado que a desgranulação de mastócitos também pode ocorrer de modo condicionado. Assim, em ratos sensibilizados com OVA e re-expostos a um sinal visual anteriormente associado ao desafio antigênico verificou-se uma quantidade de protease de mastócitos no soro semelhante àquela apresentada por animais que de fato receberam o desafio com o antígeno (MACQUEEN et al., 1989). A desgranulação condicionada de mastócitos pode ser elemento chave para explicar a ocorrência do condicionamento de comportamentos associados a uma reação alérgica pulmonar (PALERMO-NETO; GUIMARAES, 2000).

Os dados de literatura levantam, assim, sólidas evidências comportamentais e bioquímicas que suportam a hipótese de haver uma comunicação direta e bidirecional entre o SNC e o sistema imune; contribuindo deste modo, para o melhor entendimento da regulação/modulação das respostas adaptativas aos estímulos com os quais os animais se deparam constantemente.

2.2 Alergia alimentar

Reações adversas ocasionadas por ingestão de alimentos são descritas desde os primeiros séculos da era cristã (COHEN; SAAVEDRA-DELGADO, 1989). Nos dias de hoje, entende-se que as reações adversas ocasionadas pela ingestão de alimentos consistem uma série ampla de fenômenos que nem sempre compartilham dos mecanismos pelos quais geram a sintomatologia associada a eles. Entre esses fenômenos está a alergia alimentar ou hipersensibilidade alimentar, cujos mecanismos fisiopatológicos envolvem o sistema imune.

Revisão de Literatura 31

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Segundo Sampson (1999), as primeiras descrições de reações adversas causadas pela alergia em indivíduos que ingeriram ovos e peixes datam do século XVI e XVII, respectivamente.

Desde então, a medicina vem se esforçando para aprimorar os métodos usados para o diagnóstico da alergia alimentar.

Curiosamente, nas últimas duas ou três décadas, devido ao enorme aumento da sua prevalência, a alergia alimentar (e as doenças alérgicas de modo geral) transformou-se em relevante problema de saúde pública. Hoje em dia estima-se que a prevalência da alergia alimentar seja de até 8% em crianças e de até 2% em adultos (SAMPSON, 1999; SAMPSON; BURKS, 1996). Além disso, nos últimos anos, a resposta alérgica a alimentos tem sido apontada como a principal causa de reações anafiláticas atendidas nos setores de emergência de hospitais dos EUA e do Reino Unido (SAMPSON, 2000; WUTHRICH; BALLMER-WEBER, 2001).

As reações de hipersensibilidade imediata ou do tipo I, também ditas reações alérgicas, são em última instância conseqüência da exposição a um antígeno que acaba por gerar uma resposta imune orquestrada fundamentalmente por células Th2. As células Th2 são responsáveis pela produção de citocinas tais como IL-4, IL-5, IL-13 e também determinam a produção de IgE pelas células B. A IgE, assim como a IgG1 em camundongos e a IgG4 em humanos, é dita um anticorpo anafilático e liga-se à membrana dos mastócitos por meio do seu receptor de alta afinidade (FcεRI). Quando um indivíduo que desenvolveu uma resposta deste tipo é exposto pela segunda vez ao mesmo antígeno, ocorre uma ligação cruzada entre este antígeno e duas moléculas de IgE presas à membrana do mastócito e, como conseqüência, há a desgranulação desta célula. É o que chamamos de fase imediata da reação de hipersensibilidade, portanto, fundamentalmente mediada pelos mastócitos e pela IgE. A desgranulação dos mastócitos leva à síntese e/ou liberação de mediadores ditos pré-formados (histamina, serotonina), mediadores lipídicos (prostaglandinas e leucotrienos) e diversas Revisão de Literatura 32

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citocinas. Além da fase imediata, há também a fase tardia da reação de hipersensibilidade, mediada basicamente pelos eosinófilos e por citocinas do padrão Th2 (SENGOKU et al., 2001). Do ponto de vista das reações alérgicas que ocorrem no trato gastrointestinal (GI) em decorrência da ingestão de alimentos faz-se, tradicionalmente, uma divisão das doenças cuja fisiopatologia depende mais ou menos da presença de IgE (ROTHENBERG et al., 2001; SAMPSON, 1999). Aqui, daremos ênfase àquelas que são mais dependentes de IgE e nas quais há menor participação dos eosinófilos.

Reações alérgicas provocadas por alimentos podem ser responsáveis por uma série de sintomas envolvendo a pele (prurido, eczema), o trato gastrointestinal (diarréia, dor abdominal, náusea) e as vias aéreas (rinite, coriza) (CROWE; PERDUE, 1992b; SAMPSON, 1999). Boa parte dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos na sintomatologia que decorre da alergia alimentar é bastante estudada e bem conhecida. Nesse sentido, a desgranulação de mastócitos - que no intestino estão presentes principalmente na lâmina própria e na submucosa - parece estar relacionada ao aumento do transporte de íons pelo epitélio, a alterações na absorção de nutrientes e à contração da musculatura lisa intestinal, além de causar edema de mucosa e diminução da integridade da barreira epitelial (BISCHOFF; MAYER; MANNS, 2000; YU; PERDUE, 2001). De fato, em ratos alérgicos à OVA, observou-se edema dos vilos intestinais, além de uma redução da absorção de íons (Na+, K+) e de água quarenta minutos depois do desafio com OVA feito por infusão em uma porção isolada do intestino (PERDUE; CHUNG; GALL, 1984). Essas alterações estavam associadas à redução da concentração de histamina na mucosa do intestino e ao aumento da concentração desse mediador na luz intestinal (PERDUE; CHUNG; GALL, 1984). O uso de doxantrazole – que impede a desgranulação de mastócitos de mucosa e de serosa – mas não o uso de cromoglicato de sódio – que impede apenas a desgranulação dos mastócitos de serosa

– bloqueou as alterações provocadas pelo desafio antigênico, evidenciando-se assim, a Revisão de Literatura 33

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participação dos mastócitos de mucosa (CROWE; PERDUE, 1992a; PERDUE; GALL, 1985).

Além das alterações relacionadas à absorção, também verificou-se em animais alérgicos desafiados com o antígeno um aumento da secreção de íons cloreto pelo epitélio intestinal que foi prevenido por meio do tratamento com antagonistas de receptores de serotonina e histamina, inibidores da cicloxigenase e estabilizadores de mastócitos (CATTO-SMITH et al., 1989; STENTON; VLIAGOFTIS; BEFUS, 1998). A integridade da barreira epitelial também parece estar comprometida em animais com hipersensibilidade alimentar, fato que pode facilitar a penetração de outros antígenos. Desse modo, por meio da análise do trânsito de moléculas marcadas (tais como 51Cr-EDTA), observou-se uma maior penetração de partículas pelo epitélio intestinal após o desafio com o antígeno (CROWE; PERDUE, 1992b). Este fato vem acompanhado de altas concentrações de protease de mastócito (RMCP II) no soro (CROWE; PERDUE, 1992b). Por fim, sabe-se também que o desafio antigênico no estômago de animais sensibilizados com OVA leva a um aumento da secreção de ácido gástrico, fato este revertido com o uso de cimetidina (antagonista do receptor de histamina H2) e de cromoglicato de sódio (STENTON; VLIAGOFTIS; BEFUS, 1998).

Outros pesquisadores procuraram entender os sintomas observados na pele em decorrência de reações alérgicas oriundas da ingestão de alimentos. Desta forma, verificou-se que pelo menos um terço dos camundongos sensibilizados por via oral com leite bovino ou amendoim apresentou erupções na pele (eczema) após consumir o antígeno com o qual foram imunizados (LI et al., 2001). A análise histológica das lesões de pele revelou a presença de linfócitos T CD4+, eosinófilos e grande número de mastócitos, além de maior porcentagem de mastócitos desgranulados. Ademais, constatou-se a presença de RNAm para IL-5 e IL-13

somente na pele dos animais que desenvolveram a dermatite atópica; os quais também apresentaram altos níveis de IgE no soro (LI et al., 2001).

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Apesar do conhecimento acumulado a respeito dos mecanismos que envolvem diferentes aspectos da sintomatologia decorrente das reações alérgicas após a ingestão do antígeno, pouco se sabe a respeito dos efeitos da alergia alimentar sobre o funcionamento do sistema nervoso central (SNC). Alguns autores discutiram a possibilidade de ser a resposta alérgica a alimentos capaz de levar a mudanças de comportamento (ATKINS, 1986; CRAYTON, 1986; GETTIS, 1989). A maior parte desses artigos consiste em pequenas coleções de relatos de casos clínicos nos quais o médico responsável por um paciente ou um pequeno grupo de pacientes argumenta em favor da ocorrência de um tipo de distúrbio de comportamento em função da ingestão de certos alimentos. O principal argumento utilizado para fundamentar esse tipo de sugestão é a remissão da alteração comportamental frente à retirada do alimento da dieta. Como bem apontado em um dos artigos (ATKINS, 1986), os sintomas relatados são subjetivos e o diagnóstico de alergia alimentar, quando presente, é questionável. Um estudo que buscou correlacionar o diagnóstico de desordens psiquiátricas em pacientes humanos com alergia alimentar identificou maior prevalência de ansiedade e depressão nestes pacientes do que naqueles controles ditos não saudáveis com intolerância à lactose ou naqueles controles saudáveis (ADDOLORATO et al., 1998). No entanto, diversos autores argumentam que a associação entre desordens psiquiátricas e doenças alérgicas se deveria mais a um artefato, apontando dados por meio dos quais não foi possível verificar tal associação (PEARSON; RIX; BENTLEY, 1983; PEVELER et al., 1996). Neste contexto, a falta de evidências claras de que uma reação alérgica seja capaz de afetar diretamente a função do SNC e/ou o comportamento tem sido um dos principais argumentos usados para contestar a existência de associações entre doenças alérgicas e sintomas de caráter psicológico (PEARSON, 1988).

Uma abordagem que privilegie as interações entre os sistemas imune e nervoso utilizando um modelo de alergia alimentar poderia, assim, fornecer o elo que falta na Revisão de Literatura 35

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investigação da ocorrência de sintomas psicológicos em pacientes alérgicos. Nesse sentido, o modelo proposto por Cara, Conde e Vaz (1994) para investigar o papel do sistema imune na seleção de dietas em camundongos quer parecer-nos apropriado. Como já mencionado na introdução, os dados obtidos por Cara, Conde e Vaz (1994) mostram que uma resposta imune decorrente de um antígeno presente na dieta pode alterar a preferência alimentar de animais imunizados com esse antígeno. Dessa forma, enquanto animais não imunizados têm uma preferência natural por uma solução adocicada de clara de ovo, os imunizados apresentam uma alteração de preferência ao sabor, passando a ingerir preferencialmente água, isto é, preterindo a solução adocicada que contém o antígeno com o qual foram imunizados.

O trabalho de Cara (1995) procurou caracterizar essa mudança de comportamento e estudar os possíveis mecanismos imunológicos envolvidos com o desenvolvimento da aversão ao antígeno presente na dieta. Os resultados mostraram que há especificidade nesta aversão à ingestão de antígenos por animais imunizados. Assim, enquanto camundongos imunizados com ovalbumina (OVA) apresentaram altos títulos de anticorpos específicos para a OVA e rejeitaram consumir a solução adocicada de clara, os animais imunizados com gama globulina bovina (BGG), que apresentaram altos títulos de anticorpos anti-BGG, não produziram anticorpos específicos para a OVA e não rejeitaram consumir a solução adocicada de clara de ovo. Ainda, em consenso com relação à especificidade na aversão, animais imunizados com DNP2OVA (dinitrofenil-OVA contendo, em média, dois radicais dinitrofenil por molécula) produziram anticorpos específicos para a OVA em títulos semelhantes a de animais imunizados com OVA nativa e apresentaram a mesma aversão à solução adocicada de clara de ovo. Por outro lado, camundongos imunizados com DNP12OVA (conjugado, contendo em média, 12 radicais dinitrofenil por molécula) não produziram anticorpos específicos para a OVA e também não apresentaram aversão à solução adocicada de clara de ovo.

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Como se pode notar, parece haver uma estreita relação entre a produção de anticorpos específicos ao antígeno e a aversão que se estabelece. De fato, o trabalho de Cara, Conde e Vaz (1994) demonstrou que a aversão surgiu concomitantemente ao aparecimento dos anticorpos específicos no soro dos animais imunizados, ou seja, 14 dias após a imunização primária. Confirmando a importância dos anticorpos específicos para o desenvolvimento da aversão à solução adocicada, Cara, Conde e Vaz (1994) observaram que animais não imunizados apresentaram uma rejeição à ingestão de clara adocicada 3 horas após receberem um pool de soro proveniente de animais imunizados com 100 µg de OVA.

Investigando as conseqüências gastrointestinais da ingestão do antígeno por animais imunizados, Cara (1995) demonstrou que durante as três primeiras horas em que esses animais ingeriam a solução de clara de ovo ocorria, na mucosa das porções iniciais do intestino, um aumento de permeabilidade vascular detectado pelo extravasamento de azul de Evans. Esse aumento de permeabilidade no intestino era semelhante ao que ocorria em animais que recebiam 10 mg de OVA por gavagem.

Tratamentos farmacológicos com 70 mg/Kg de NDGA (um inibidor da cicloxigenase e lipoxigenase) ou com a associação de 3 mg/Kg de mepiramina (antagonista de receptores H1) e 2,5 mg/Kg de metisergide (antagonista de receptores 1 e 2 de serotonina) foram capazes de evitar o aumento de permeabilidade vascular observado nos animais imunizados que ingeriram o antígeno. Contudo, os mesmos tratamentos não foram capazes de fazer com que os animais imunizados voltassem a ingerir preferencialmente a solução adocicada de clara de ovo (CARA ,1995).

Buscando avaliar o envolvimento de fenômenos tais como dor ou náusea no desenvolvimento da alteração de preferência ao sabor, Cara (1995) também tratou os animais imunizados com 2 mg/Kg de indometacina (inibidor da cicloxigenase), com 10 mg/kg de dipirona (antiálgico) ou com 0,2 mg/Kg de ondansetron (antagonista de receptores 5-HT3).

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Nenhum desses tratamentos foi capaz de fazer com que os camundongos imunizados ingerissem maiores quantidades de solução adocicada de clara de ovo. Nesse sentido, o único tratamento capaz de evitar a alteração de preferência ao sabor foi aquele realizado com 0,4

mg/kg de dexametasona. No entanto, este efeito foi observado apenas até a sexta hora do teste de preferência (CARA; CONDE; VAZ, 1997).

Em trabalho de mestrado realizado pelo mesmo grupo em Belo Horizonte, Andrade (1999) pesquisou o papel dos mastócitos e dos mediadores liberados por eles na formação do edema em baço, rim, pulmão, estômago e intestino delgado (duodeno e jejuno) de animais germ free imunizados com OVA. Para tanto, avaliou o extravasamento do corante azul de Evans após a injeção intravenosa do antígeno e do corante. Os resultados mostraram um aumento de permeabilidade vascular apenas no duodeno e no jejuno proximal de animais imunizados. Nenhuma alteração na permeabilidade vascular foi verificada nos animais não imunizados. No caso de camundongos convencionais, verificou-se nos animais imunizados um padrão muito semelhante, isto é, um aumento de permeabilidade vascular apenas no estômago e no duodeno. A autora chama a atenção para o fato de que, mesmo com a injeção sistêmica do antígeno, observou-se aumento de permeabilidade vascular apenas nas porções iniciais do trato gastrointestinal.

A presença do edema nos animais que rejeitaram a solução adocicada de clara de ovo levou Andrade (1999) a pesquisar, também, possíveis alterações histológicas que eventualmente acompanhassem o desenvolvimento de aversão à dieta contendo o antígeno em camundongos sensibilizados com OVA. No entanto, não foi possível detectar quaisquer alterações na altura dos vilos, na espessura total da mucosa e na profundidade das criptas, tanto no duodeno como no jejuno, após 2 ou 24 horas em que os animais convencionais tiveram a opção de ingerir água ou solução adocicada de clara. Também não se observaram alterações histológicas dignas de nota na língua dos animais que rejeitaram a solução de clara.

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Apenas foi possível notar uma diminuição da altura dos vilos intestinais nos animais convencionais imunizados que não tiveram outra opção de ingestão líquida que não fosse a solução de clara por dez dias.

Importante citar que os animais consumiram a mesma quantidade de clara quando havia opção pela água e quando não havia qualquer outra fonte líquida disponível para ingestão (Andrade 1999); em outras palavras, os camundongos reduziram a quantidade de líquido ingerido em 70 ou 80% mas não beberam da solução contendo o antígeno.

Cara (1995) também mostrou que esta resposta pode ser condicionada. Desse modo, os animais imunizados submetidos ao teste de preferência passam a evitar a solução adocicada mesmo na ausência do antígeno. No entanto, o condicionamento era transitório, mantendo-se por apenas um dia.

2.3 Vias sensoriais do trato gastrointestinal

Os livros texto de fisiologia e farmacologia costumam dividir o sistema nervoso autônomo em dois subgrupos: simpático e parassimpático. A esse sistema deve-se o controle do comportamento motor da musculatura lisa das vísceras e dos vasos sanguíneos, além do coração e de glândulas. No entanto, Langley, pesquisador inglês que primeiro conceituou o sistema nervoso autônomo, não propôs uma divisão do sistema nervoso autônomo em apenas dois subgrupos. De fato, além do simpático e do parassimpático, ele propõe um terceiro componente: o sistema nervoso entérico (LANGLEY, 1921). Langley tinha razões de cunho anatômico e funcional para propor tal divisão. As razões anatômicas diziam respeito à enorme diferença numérica entre as fibras provenientes do SNC que chegam ao intestino (fibras pré-

ganglionares que constituem ramificações do nervo vago) e as fibras nervosas que podem ser Revisão de Literatura 39

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encontradas no intestino. Estima-se haver algo em torno de duas mil fibras pré-ganglionares do nervo vago na região em que ocorre a inervação do intestino. Enquanto isso, as estimativas apontam a presença de cerca de cem milhões de células nervosas no instestino delgado de seres humanos (GERSHON, 1998). Langley já suspeitava ser improvável associar tal número de células nervosas presentes no intestino às ramificações das fibras provenientes do nervo vago. Mais plausível seria considerar a possibilidade de haver um sistema nervoso intrínseco ao intestino. As razões de cunho funcional vinham de experimentos realizados por Trendelenburg em 1917. Nestes estudos, ele investigou a reação do intestino a partir de estímulos que eram provocados no lúmen do mesmo - uma tentativa elegante de simular os efeitos causados pelo conteúdo intestinal em sua parede. Deste modo, o pesquisador aumentou a pressão interna da porção isolada do intestino e, em seguida, observou uma resposta motora cuja reprodutibilidade chamava a atenção. O intestino exibia contrações musculares muito bem coordenadas e em forma de ondas; contração oral ao estímulo e relaxamento anal que tinham, como claro intuito, promover a propulsão do conteúdo intestinal em sentido único e em direção ao ânus. O surpreendente é que este reflexo podia ser observado em um segmento de intestino totalmente isolado do corpo do animal. Ele trabalhava com preparações de órgãos isolados. Trendelenburg1 (1917 apud GERSHON, 1998) foi quem introduziu o termo reflexo peristáltico, e que é utilizado até hoje. Começava então, a surgir a idéia de que o trato gastrointestinal possuia um sistema nervoso intrínseco capaz de executar funções independentes de sinais ou comandos provenientes do SNC. Mais do que isto, esses experimentos já esboçavam o fato de que o sistema nervoso entérico era capaz de perceber estímulos sensoriais e, a partir deles, elaborar uma resposta motora sem o auxílio de qualquer tipo de processamento de informações por parte do SNC.

1 TRENDELEMBURG, P. Physiologische und pharmakologische versuche über die dünndarmperistaltik.

Naunyn-Schmiedeberg’s. Arch. Pharmac., v. 81, p. 55-129, 1917.

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Os conceitos propostos por Langley, no entanto, parecem não ter ganho muita atenção do meio acadêmico. O neurocientista Michael D. Gershon, ao publicar em 1998 um livro entitulado The second brain “gut instinct” , é um dos responsáveis por tentar resgatar estes conceitos e também a relevância do sistema nervoso entérico. Segundo ele, o sistema nervoso entérico é composto basicamente por dois plexos. O primeiro a ser descoberto, e o maior deles, é o plexo mioentérico (plexo de Auerbach), situado entre as duas camadas musculares que fazem parte do intestino. O segundo, é o plexo submucoso (plexo de Meissner) que se situa, obviamente, na camada submucosa do intestino. Ambos plexos possuem corpos de células nervosas que se organizam em gânglios e possuem neurônios sensitivos, motores, secretomotores e interneurônios (GERSHON, 1998). Em função da sua importância para este trabalho, serão mais analisadas as informações referentes aos neurônios aferentes intrínsecos, os sensitivos.

O reflexo peristáltico que ocorre quando se submete a parede do intestino à determinada pressão mais uma vez teve papel importante na descoberta de nervos sensitivos intrínsecos na submucosa desse órgão. Nesse sentido, o trabalho realizado em 1958 por Edith Bülbring e Lin foi determinante. A idéia lançada por eles era de que a serotonina liberada por células enterocromafins, as quais funcionariam como sensores de pressão, estimulava nervos sensitivos presentes no intestino, permitindo a ocorrência do reflexo peristáltico (BULBRING; LIN, 1958).

Bem mais tarde, o gupo liderado por Gershon voltou a estudar a participação dos neurônios aferentes intrínsecos nas respostas que seguiam a aplicação de um estímulo na mucosa intestinal. Esses estudos demonstraram que após a aplicação do estímulo à mucosa, havia uma intensa ativação de neurônios presentes tanto no plexo submucoso quanto no plexo mioentérico (KIRCHGESSNER; GERSHON, 1988). Essa ativação também foi avaliada por meio da expressão do gene c-fos (KIRCHGESSNER; TAMIR; GERSHON, 1992). Os Revisão de Literatura 41

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resultados do grupo de Gershon também mostraram que, quando era realizado um bloqueio da transmissão sináptica, a ativação ficava restrita aos corpos celulares de neurônios localizados no plexo submucoso e apenas nas proximidades da região que havia recebido o estímulo (GERSHON, 1998). Os dados sugeriam ser o bloqueio da transmissão sináptica capaz de evitar que a informação captada pelos nervos presentes no plexo submucoso passasse adiante e chegasse até os neurônios do plexo mioentérico. A hipótese lançada por Edith Bülbring, ainda antes dos anos 60, parece estar correta; não só quanto à presença de neurônios sensitivos intrínsecos mas, também, como veremos adiante, quanto à participação da serotonina na percepção de estímulos aplicados à mucosa.

Nos últimos anos, vários estudos têm sido realizados na tentativa de melhor caracterizar a natureza dos neurônios aferentes primários intrínsecos, incluindo-se aqui seu modo de atuação. Esses estudos envolveram análises morfológicas, eletrofisiológicas e técnicas de imunoistoquímica (CLERC et al., 1998; FURNESS et al., 1998; KIRCHGESSNER; TAMIR; GERSHON, 1992). Em trabalho realizado em 1992,

Kirchgessner, Tamir e Gershon (1992) demonstraram que os neurônios da camada submucosa, os quais expressam c-fos quando há estímulo mecânico da mucosa, apresentam imunorreatividade para a substância P. Em estudos com traçadores anterógrados observou-se que esses neurônios apresentam projeções que se dirigem à mucosa e também ao plexo mioentérico (KIRCHGESSNER; GERSHON, 1988). Tais neurônios foram observados tanto no íleo quanto no duodeno (CLERC et al., 1998). Os neurônios aferentes primários intrínsecos também estão presentes no plexo mioentérico de duodeno e íleo. Essas células apresentam projeções que correm em direção a outras células nervosas no próprio plexo mioentérico, além de estarem presentes no plexo submucoso e na mucosa. No íleo, grande parte desses neurônios também apresenta imunorreatividade para a substância P e para a Revisão de Literatura 42

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colina acetiltransferase. Já no duodeno, quase não se observou presença de imunorreatividade para a substância P (CLERC et al., 1998).

Morfologicamente, os neurônios aferentes primários intrínsecos são classificados como neurônios tipo II de Dogiel (FURNESS et al., 1998). Em 1899, quando propôs essa classificação, Dogiel descreveu os neurônios do tipo II como sendo aqueles em que se encontrava a característica particular de possuir múltiplos axônios. É exatamente por esse motivo que, em estudos utilizando transporte axonal anterógrado, pode-se observar diversas projeções partindo dessas células. Essa particularidade morfológica permite aos neurônios aferentes primários intrínsecos constituírem uma imensa rede de transmissão de informações ao longo do intestino.

Eletrofisiologicamente, os neurônios aferentes primários intrínsecos são classificados como sendo do tipo AH. Esses neurônios caracterizam-se por apresentar um amplo potencial de ação com uma inflexão na fase de repolarização, seguido de dois potenciais hiperpolarizantes: um imediato e um tardio. O tardio é a característica eletrofisiológica que de fato determina a classificação dos neurônios aferentes primários intrínsecos em neurônios do tipo AH. Esse potencial hiperpolarizante tardio ocorre, principalmente, devido à saída de íons potássio através de um canal de potássio dependente de cálcio (gKCA) (FURNESS et al., 1998).

A transmissão sináptica excitatória realizada por esses neurônios pode ocorrer de duas formas: potenciais pós-sinápticos rápidos ou lentos. Os potenciais excitatórios pós-sinápticos lentos ocorrem pela inibição da condutância de potássio através de canais entre os quais estão aqueles envolvidos com o potencial hiperpolarizante tardio. Essas correntes de potássio reduzem a excitabilidade dos neurônios, restringindo os disparos dos potenciais de ação em resposta à despolarização da membrana neuronal. Neurônios, nesse estado, são ditos de rápida acomodação. A inibição da abertura desses canais liberta os neurônios dessa restrição e os Revisão de Literatura 43

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coloca em um estado de lenta acomodação (KUNZE et al., 1997). A transmissão mediada pelos potenciais lentos parece ocorrer devido à ligação de acetilcolina em receptores muscarínicos e, também, pela ligação de substância P nos receptores NK1 ou NK3

(FURNESS et al., 1998). O potencial rápido parece ser mediado pela ligação de acetilcolina nos receptores nicotínicos. Enquanto o potencial rápido dura de 20 a 50 milisegundos, o potencial lento permite que os impulsos durem mais de dois segundos.

Sem dúvida alguma, no intestino, além das fibras aferentes primárias intrínsecas, há também fibras aferentes extrínsecas. Estas fibras são responsáveis por levar informações percebidas no intestino (e em outras vísceras) até o sistema nervoso central. Assim, existem fibras aferentes derivadas do nervo vago e há também fibras aferentes espinhais. Os corpos celulares das fibras aferentes vagais localizam-se no gânglio nodoso ou inferior, próximo ao crânio (CERVERO, 1994). A informação levada por essas fibras entra no SNC por meio de conexões com o núcleo do trato solitário (NTS). Os corpos celulares dos neurônios aferentes espinhais encontram-se no gânglio da raiz dorsal e seus processos terminam no corno dorsal da medula espinhal, onde fazem conexão com neurônios de segunda ordem, os quais, por sua vez, emitem axônios em direção ao cérebro (CERVERO, 1994). As fibras aferentes desses neurônios passam pelo gânglio simpático e chegam ao intestino delgado (incluindo-se aqui a mucosa) através dos nervos esplênico e mesentérico, os quais apresentam ramos colaterais que seguem pelos plexos submucoso e mioentérico. As fibras oriundas dos neurônios aferentes vagais também estão presentes na mucosa do intestino, bem como nos plexos submucoso e mioentérico (FURNESS et al., 1998) (Figura 1). Apesar dos neurônios aferentes intrínsecos e extrínsecos diferirem quanto às suas origens, eles compartilham de uma série de características. Assim sendo, ambos estão presentes em regiões semelhantes na mucosa e nas camadas musculares do intestino, ambos respondem a estímulos químicos e mecânicos aplicados à mucosa e, por fim, compartilham qualidades referentes ao código neuroquímico,

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tais como a substância P. Como podemos notar, existe uma estreita relação entre as fibras aferentes intrínsecas e as extrínsecas; este fato sugere a existência de uma interação funcional entre elas. Nesse aspecto, apesar de ainda serem necessários estudos mais aprofundados, há algumas evidências de que estímulos captados por fibras intrínsecas podem ser transmitidos a fibras extrínsecas (HOLZER, 2002).

Figura 1 – Disposição dos neurônios aferentes primários intrínsecos e relação com os neurônios aferentes primários espinhais e vagais que inervam o intestino. Os neurônios aferentes primários espinhais e vagais são pseudounipolares e possuem ramos colaterais que se dirigem aos gânglios entéricos (setas). Os neurônios aferentes primários vagais são morfologicamente semelhantes a outros neurônios aferentes primários craniais e possuem seus corpos celulares próximos à região cranial. Estes corpos celulares se encontram no gânglio nodoso e suas projeções ascendentes se dirigem ao núcleo do trato solitário. Os corpos celulares dos neurônios aferentes primários espinhais se localizam nos gânglios da raiz dorsal e seus processos atingem o corno dorsal da medula espinhal. Os neurônios aferentes primários intrínsecos são multipolares e seus terminais se encontram exclusivamente na parede intestinal. Muc, mucosa; SM, Submucosa; CM, músculo circular; MP, plexo mioentérico; LM, músculo longitudinal. Fonte: adaptado de Furness et al., 1998.

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Do que foi exposto, depreende-se que o trato gastrointestinal possui uma rica e ampla rede de fibras nervosas. Contudo, além desta rede de fibras e de células nervosas, há no intestino uma enorme coleção de células do sistema imune (cerca de 70 a 80% do total (CASTRO; ARNTZEN, 1993)) e de células epiteliais especializadas (FURNESS; KUNZE; CLERC, 1999; HOLZER, 2002; SHARKEY; MAWE, 2002). Atualmente, a capacidade do intestino em executar determinadas tarefas, que as vezes parecem ser conflitantes, é atribuída à estreita relação anatômica e ao funcionamento em conjunto destes três componentes: fibras nervosas, células do sistema imune e células epiteliais especializadas (FURNESS; KUNZE; CLERC, 1999; HOLZER, 2002).

O intestino, ao mesmo tempo em que é responsável pela absorção de nutrientes e pela digestão dos alimentos, também deve perceber substâncias potencialmente nocivas e elaborar a resposta adequada à presença deste material. Nesse sentido, tem sido demonstrado que a presença de nutrientes (lipídeos, carboidratos e proteínas) na luz intestinal leva a uma diminuição da motilidade do estômago e a uma redução da secreção de ácido gástrico; ao mesmo tempo modula-se o comportamento alimentar havendo diminuição da ingestão de novos alimentos (HOLZER et al., 1994; RAYBOULD, 1998, 1999). A presença dos nutrientes na luz do intestino faz com que as células endócrinas (enterocromafins) presentes no epitélio intestinal liberem colecistoquinina (CCK) e/ou serotonina (5-HT), as quais são capazes de ativar as terminações nervosas das fibras vagais e espinhais (RAYBOULD, 1998, 1999; RAYBOULD; HOLZER, 1992). Deste modo, a informação chega ao SNC, ocorrendo então a modulação da motilidade intestinal e do comportamento alimentar (diminuição da ingestão ou saciedade). De fato, o uso de antagonistas de receptores de CCK e de 5-HT

bloqueou a inibição do esvaziamento gástrico induzida por nutrientes (lipídeos e glicose) em ratos. Antagonistas de receptores CCKA também bloquearam a diminuição da secreção gástrica e o comportamento de saciedade (HOLZER et al., 1994; RAYBOULD, 1998, 1999).

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Além disso, a administração de CCK exógena produziu alterações semelhantes àquelas observas quando da presença de nutrientes na luz do intestino (RAYBOULD, 1998). Neste momento, vale dizer que as alterações provocadas pela CCK endógena no padrão de motilidade do intestino parecem ser dependentes dos mastócitos. Deste modo, em animais tratados com estabilizador de membrana de mastócitos de mucosa não mais observou-se as ações da CCK na motilidade do intestino (JUANOLA et al., 1998).

A CCK e a serotonina também participam do modo como as informação são

transmitidas pelas fibras extrínsecas do intestino ao SNC (GRUNDY et al., 1998). Assim, receptores de CCK e de 5-HT foram identificados em terminações nervosas de fibras vagais, espinhais e, também, intrínsecas. Também já foi demonstrado que a administração IV de serotonina estimula fibras aferentes vagais por meio de receptores 5 HT3. Essa estimulação deixa de ocorrer quando a mucosa intestinal é anestesiada e não é possível bloqueá-la quando se faz uso de bloqueadores da transmissão sináptica. Esses dados sugerem que a ativação ocorre diretamente em terminais presentes na mucosa do órgão. Ademais, a injeção de uma solução ácida na mucosa provoca o mesmo padrão de estimulação das aferências vagais (HILLSLEY; GRUNDY, 1998a, b).

Quando uma porção do intestino delgado sofre distensão por intermédio da injeção de solução salina no seu interior, há um outro padrão de estimulação ocorrendo em outras fibras aferentes e que também é observado quando da aplicação intravenosa de serotonina. Essa estimulação inicia-se depois daquela mediada pelos receptores 5 HT3 e é menos intensa e mais prolongada. Verificou-se que esse último padrão de estimulação é mediado pelos receptores 5 HT2 e não é bloqueado quando os animais são submetidos à vagotomia. Os autores sugerem, então, que as fibras que apresentam esse padrão de estimulação são aferências espinhais (HILLSLEY; GRUNDY, 1998a).

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A CCK também é capaz de estimular aferências vagais presentes na mucosa do intestino. Essa estimulação parece ser mediada pelos receptores CCKA (RICHARDS et al., 1996) presentes em fibras diferentes das que possuem receptores 5 HT3. Portanto, há fibras aferentes vagais distintas transmitindo as informações que partem da mucosa em função da liberação de serotonina e CCK (HILLSLEY; GRUNDY, 1998b).

Por fim, o tratamento de ratos com capsaicina mostrou que as fibras do tipo C também são importantes na sinalização a partir de nutrientes no intestino. A destruição as fibras C

bloqueia o comportamento de saciedade, a inibição da secreção de ácido gástrico e do esvaziamento do estômago induzidos por lipídeos e carboidratos (HOLZER et al., 1994; LLOYD et al., 1993; RAYBOULD; HOLZER, 1992; SCHWARTZ, 2000).

Vários estudos têm proposto que além de controlarem as respostas motoras e secretórias que se seguem à ingestão de alimentos, as interações entre os sistemas imune e nervoso no intestino contribuem de modo determinante para o desenvolvimento de sintomas tais como hiperalgesia e alterações motoras do trato GI, os quais são observados em pacientes com síndrome inflamatória do intestino (IBS) (FURNESS; KUNZE; CLERC, 1999; HOLZER, 2002; HOLZER et al., 2001). Esses sintomas têm sido relacionados com a sensibilização de vias sensoriais que estabelecem a comunicação entre o intestino e o cérebro, as quais, como vimos, são importantes na fisiologia da digestão. A sensibilização é um fenômeno associado à plasticidade e depende da ativação por determinados estímulos. Esta ativação acaba por aumentar a magnitude da resposta das fibras sensitivas e/ou por diminuir o limite para que a mesma ocorra. De fato, demonstrou-se que mediadores (tais como serotonina, citocinas e PGE2) liberados por células do sistema imune durante uma resposta inflamatória no intestino podem alterar a função e promover um aumento do número de receptores e canais iônicos presentes em fibras nervosas responsáveis pela informação sensorial de vísceras (GRUNDY, 2002; HOLZER, 2002). Além da sensibilização de fibras Revisão de Literatura 48

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aferentes, há ainda indícios de que a sensibilização de áreas específicas no cérebro esteja também envolvida com o aumento da sensação de dor observada em pacientes com IBS

(CERVERO, 2000; GEBHART, 2000).

Em conjunto, os dados de literatura sustentam a noção de que o melhor entendimento das interações entre o sistema imune, as vias nervosas aferentes e áreas específicas do cérebro – especialmente aquelas responsáveis pela integração de informações sensoriais e elaboração de respostas endócrinas e autonômicas – é crucial para a elucidação da fisiopatologia associada a algumas doenças do trato gastrointestinal.

O modelo proposto originalmente por Cara, Conde e Vaz (1994) parece ideal para abordar a estas questões, uma vez que envolve uma reação imune no intestino que, como vimos, é capaz de promover diversas alterações tanto na fisiologia do intestino quanto no comportamento, ou seja, o desenvolvimento de aversão à dieta contendo o antígeno.

Fazendo uso deste modelo, privilegiaremos neste trabalho uma abordagem que ao contemplar a área da neuroimunomodulação buscará o entendimento dos efeitos da alergia alimentar no SNC.

Objetivos 49

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3 OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da alergia alimentar no sistema nervoso central (SNC). Assim, formulamos as seguintes questões: que tipo de alterações comportamentais poderiam ocorrer em animais com alergia alimentar? A que áreas do SNC

essas alterações comportamentais estariam associadas? Como a reação alérgica gera a informação a ser transmitida para o SNC? Uma vez gerada esta informação, de que modo ela chega ao SNC?

3.1 Objetivos específicos

Investigar a natureza das alterações de comportamento observadas em animais com alergia alimentar.

Investigar, por meio da avaliação da expressão de c-fos, que áreas do SNC estão associadas ou envolvidas com as alterações de comportamento observadas em animais alérgicos.

Investigar, por meio da indução de tolerância oral e do tratamento com um anticorpo anti-IgE, quais mecanismos efetores da reação alérgica são importantes para que ocorram as alterações no cérebro e no comportamento dos animais.

Investigar, por meio do tratamento neonatal com capsaicina, a participação das fibras do tipo C na transmissão para o cérebro da informação gerada pela reação alérgica no intestino.

Material e Métodos 50

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4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem isogênica BALB/c (6 a 8 semanas de idade) provenientes do biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo (USP). Os animais foram alojados em salas destinadas exclusivamente à manutenção dessa espécie de animal de experimentação.

Durante todo o período experimental os camundongos receberam ração e água “ad libitum” e foram mantidos em ambiente com temperatura (entre 22 e 25 ºC) e umidade (60 a 75 %) controladas, e em um ciclo de 12 horas claro-escuro com luz ligada às 7 horas. Os animais foram alojados e utilizados de acordo com as normas e protocolos do Comitê de Manutenção e Uso de Animais de Laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. (Autorização: Processo n° 56/2002).

4.2 Procedimentos

4.2.1 Imunização com ovalbumina (OVA)

Os animais (6-8 semanas de idade) foram imunizados por meio de duas injeções aplicadas por via intraperitoneal. O intervalo entre as duas injeções foi de 14 dias. Nas duas injeções, aplicadas nos dias 0 e 14 (D0 e D14), os animais receberam 4 µg de OVA grau V

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Material e Métodos 51

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(Sigma, St. Louis, MO) mais 1,6 mg de Al(OH3) diluídos em 0,4 ml de salina em tampão fosfato (PBS) (Figura 2).

4.2.2 Teste de preferência

Decorridos 7 dias da segunda injeção com OVA (imunização), os animais foram submetidos a um teste de preferência pela solução contendo o antígeno (D21) (Figura 2). Para tanto, foram isolados em gaiolas individuais 3 dias antes do início do teste. Dois bebedouros de mesma forma, cor e tamanho contendo água foram dispostos um de cada lado da gaiola.

No dia do teste (D21), um deles foi preenchido com uma solução de clara de ovo a 20% em água adocicada com 0,5% de sacarina e o outro com água. Os bebedouros foram pesados imediatamente antes do início do teste e 24 horas depois. O consumo total foi expresso em gramas (g) de solução (água + clara) ingerida. A preferência pela solução adocicada contendo o antígeno foi indicada pela porcentagem do consumo da mesma: (consumo de clara /

consumo total (água + clara)) X 100.

Figura 2 – Esquema explicativo do delineamento experimental. A indução de tolerância foi realizada entre os dias –7 e –2. A imunização consistiu de duas injeções de OVA, uma no dia 0 e outra no dia 14. O teste de preferência, a avaliação comportamenal, a análise da expressão de Fos ou a dosagem de corticosterona foram realizados no dia 21.

Material e Métodos 52

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4.2.3 Protocolo de indução de tolerância oral

Por cinco dias antes da imunização (D-7 até D-2), os animais que fizeram parte do grupo tolerante, tiveram como única opção de bebida uma solução de ovalbumina (grau II, Sigma) a 1% em água (Figura 2). A indução de tolerância oral envolveu, portanto, a ingestão espontânea e prévia do antígeno com o qual estes camundongos foram imunizados no dia 0

(D0). Durante os cinco dias, a solução de ovalbumina a 1% foi preparada e trocada a cada 24

horas.

4.2.4 Tratamento neonatal com capsaicina para destruição das fibras do tipo C

O tratamento foi realizado segundo descrito anteriormente (JANCSO; KIRALY; JANCSO-GABOR, 1977). Os animais com 2 dias de idade receberam uma única injeção de capsaicina (Sigma, St. Louis, MO) (50 mg/Kg) por via subcutânea. Os camundongos do grupo controle receberam o mesmo volume de veículo (10% álcool, 10% Tween, 80% salina tamponada). A seguir, quando adultos (6 a 8 semanas), animais provenientes de ninhadas diferentes foram divididos nos diversos grupos experimentais.

4.2.5 Teste de contorção abdominal para a avaliação da eficiência do tratamento neonatal com capsaicina

A eficiência do tratamento neonatal com capsaicina foi avaliada por meio de um teste largamente empregado no estudo da sensibilidade visceral frente a estímulos químicos Material e Métodos 53

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presentes durante a resposta inflamatória, entre os quais estão aqueles dependentes da desgranulação de mastócitos (RIBEIRO et al., 2000). O teste de contorções abdominais consiste em avaliar e quantificar a sensibilidade visceral após a injeção intraperitoneal (IP) (0,1 ml/10 g de peso) de ácido acético 0,6%. Para tanto, após a administração do ácido acético, os animais foram colocados em uma caixa de observação transparente e durante vinte minutos o número de contorções abdominais foi contabilizado. A contorção se caracteriza pela contração da musculatura abdominal acompanhada de estiramento do corpo e extensão dos membros posteriores. Já havia sido demonstrado que o tratamento com capsaicina é capaz de diminuir o número de contorções abdominais após uma injeção intraperitoneal de fenilquinona (BRET-DIBAT et al., 1997). Apenas os animais que tiveram uma redução de pelo menos 50% no número de contorções abdominais foram utilizados no experimento que avaliou a participação das fibras do tipo C na expressão de c-fos no SNC induzida pela alergia alimentar. Estes animais foram imunizados pelo menos uma semana depois de passarem pelo teste de contorções abdominais.

4.2.6 Tratamento com o anticorpo anti-IgE

Os animais receberam uma injeção intravenosa contendo 0,25 mg de IgG1 de rato anti-IgE de camundongo (clone R35-92, Pharmingen, San Diego, CA) em um volume total de 0,25 ml. Esta injeção foi feita no mesmo dia (D14) em que eles receberam a segunda injeção referente ao protocolo de imunização descrito acima. Os camundongos do grupo controle receberam idêntico volume com igual concentração de um anticorpo controle (IgG de rato, Sigma). Já foi demonstrado anteriormente que este esquema de tratamento é eficiente em Material e Métodos 54

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reduzir os níveis séricos de IgE em camundongos imunizados (HAAK-FRENDSCHO et al., 1998).

4.2.7 Análise Comportamental

Os animais foram submetidos à ingestão forçada de água (gavagem) por 3 dias consecutivos antes do dia 21 (D18, D19, D20). Este procedimento permitiu a habituação e evitou possíveis alterações comportamentais oriundas da manipulação ou da ingestão forçada em si. No dia 21 os camundongos, imunizados (D0 e D14) ou não, foram desafiados por via oral (gavagem) com 0,5 ml de uma solução contendo 60% de clara de ovo em água ou apenas com água (Figura 2). Uma hora depois os animais foram avaliados quanto à sua atividade geral por meio da observação direta no campo aberto. Este aparelho consiste, basicamente, em uma arena circular de madeira (45 cm de diâmetro, paredes de 20 cm de altura), pintada de branco e com o piso dividido em diversos compartimentos de tamanhos iguais. Cada camundongo, colocado individualmente no centro da arena, foi observado por cinco minutos quanto à sua freqüência de locomoção (número total de entradas nos compartimentos). Logo em seguida, os animais foram observados no labirinto em cruz elevado (LCE). Este modelo, descrito por Pellow et al. (1985) e validado para camundongos por Lister (1987), é amplamente utilizado para o estudo dos níveis de ansiedade em roedores e baseia-se na aversão natural que estes animais apresentam por espaços abertos (LISTER, 1987). A validação deste método envolveu estudos que fizeram uso tanto de fármacos ansiolíticos do tipo benzodiazepínico (PELLOW et al., 1985) como de fármacos tidos como ansiogênicos para o homem tais como a cafeína, o pentilenotetrazol e a anfetamina (PELLOW et al., 1985).

Por outro lado, foi também validado por meio da apresentação de estímulos aversivos que Material e Métodos 55

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fazem parte da história natural dos roedores, tais como estressores sociais (RODGERS; COLE, 1993), exposição única a um predador (ADAMEC; SHALLOW, 1993) ou ao odor de um predador (ZANGROSSI; FILE, 1992). O labirinto em cruz elevado é composto por dois braços abertos (15 X 5 cm) e dois braços fechados do mesmo tamanho, mas com paredes de 15 cm de altura. O labirinto fica a 100 cm do chão e é construído de tal modo que os braços abertos e fechados se contrapõem, formando a figura de uma cruz. Cada camundongo foi colocado na área central do labirinto (interseção dos braços fechados e abertos) e observado por cinco minutos. O número de entradas nos braços fechados foi computado e o tempo gasto na exploração dos braços abertos e fechados foi registrado com o auxílio de um cronômetro.

Neste teste, a porcentagem de tempo gasto na exploração dos braços abertos é inversamente proporcional aos níveis de ansiedade. Os animais dos diversos grupos experimentais foram sempre intercalados entre si para as observações que foram feitas sempre no período de 8:00 a 12:00 horas. Entre as observações de cada camundongo, o campo aberto e o labirinto em cruz elevado foram limpos com uma solução de água-álcool 5.0%.

4.2.8 Marcação de ativação celular em núcleos específicos do SNC por meio da avaliação da expressão de c-fos

A expressão do gene c-fos tem se revelado eficiente como um marcador de ativação neuronal e sua avaliação vem sendo amplamente utilizada na descrição de conexões neuroanatômicas, locais de ação de drogas no sistema nervoso central e mapeamento da atividade cerebral após desafios imunológicos ou estímulos psicológicos (DRAGUNOW; FAULL, 1989; SAGAR; SHARP; CURRAN, 1988).

Material e Métodos 56

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Como descrito na seção correspondente à análise do comportamento, os animais foram submetidos à ingestão forçada de água (gavagem) por 3 dias consecutivos antes do dia 21.

Este procedimento permitiu a habituação e evitou possíveis alterações na expressão de c-fos oriundas da manipulação ou da ingestão forçada em si. No dia 21 os camundongos, imunizados (D0 e D14) ou não, foram desafiados por via oral (gavagem) com 0,5 ml de uma solução contendo 60% de clara de ovo em água ou com apenas água (Figura 2). A imunoistoquímica para a proteína Fos foi efetuada em material coletado 90 minutos após o desafio oral com OVA. Os camundongos foram profundamente anestesiados com uma associação de quetamina e xilazina para a realização de perfusão sistêmica com 100 ml de salina tamponada (PBS 0,1 M) e, em seguida, com 300 ml de fixador (paraformaldeído 4%

em tampão fosfato (PB) 0,1 M) bombeados através de uma cânula introduzida no ventrículo esquerdo. Imediatamente após, foi realizada a retirada dos encéfalos, os quais permaneceram no mesmo fixador por no mínimo 5 horas sendo, em seguida, “crioprotegidos” por 24 horas em solução de sacarose a 30% em tampão fosfato. Os cérebros foram cortados por congelação (30 µm) e os cortes foram coletados em tampão fosfato. A seguir, os cortes foram lavados em PB 0,1 M (3 vezes por 10 minutos) e incubados por 12 horas com anticorpo anti-Fos (Ab-5, Calbiochem, San Diego, CA) na diluição de 1:1000 em PB com 0,3% de Triton X-100 e 5%

de soro normal de cabra. Antes da incubação por 1 hora com o anticorpo secundário biotinilado (diluição de 1:200), os cortes foram novamente lavados (3 vezes por 10 minutos).

À incubação com o anticorpo secundário (Jackson, West Grove, PA), seguiu-se a incubação com avidina (1:100) e complexo biotina-peroxidase (Vectastain Kit, Vector, Burlingame, CA) (1:100) por 1 hora. Em seguida, procedeu-se a revelação com H2O2 utilizando-se diaminobenzidina como cromógeno. Como controles negativos da reação, algumas seções de cérebro foram incubadas ou com soro normal de coelho ou na ausência do anticorpo primário.

Ambos os procedimentos aboliram completamente a marcação para Fos. Após terminada a Material e Métodos 57

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reação, os cortes foram montados em lâminas cobertas com uma camada de gelatina e desidratados. A localização dos corpos celulares contendo a proteína Fos em regiões específicas do SNC foi realizada em microscopia convencional de luz e sua quantificação realizada por meio de análise de imagens auxiliada por computador. Em alguns casos, a contra coloração com Giemsa proporcionou a avaliação da porcentagem de neurônios Fos positivos. A análise de imagens foi feita por meio do programa Image-Pro® Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Para a estimativa do número de células Fos positivas foram utilizados três cortes por animal de cada uma das áreas analisadas. Em cada corte, a área a ser analisada foi delineada de acordo com referências anatômicas e coordenadas estereotáxicas.

As coordenadas estereotáxicas aproximadas das seções utilizadas na contagem de células Fos positivas foram: núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) bregma –0,82 mm; núcleo central da amígdala (CeA) bregma –1,22 mm; núcleo do trato solitário (NTS) bregma –7,08

mm (FRANKLIN; PAXINOS, 1996). A média do número de células marcadas dos dois lados foi utilizada para representar o número de neurônios positivos para Fos em cada corte, e os animais de cada grupo experimental foram comparados usando-se a média do número de células marcadas em todas as seções analisadas de cada região.

4.2.9 Hibridização in situ para o Fator Liberador de Corticotrofina (CRF) A

hibridização

in situ para o CRF foi realizada segundo adaptação de um protocolo descrito anteriormente (KUSNECOV; LIANG; SHURIN, 1999). Os animais foram anestesiados, submetidos a perfusão e tiveram o cérebro processado de modo exatamente igual ao descrito acima. Os cortes de 30 µm foram então montados em lâminas carregadas, fixados em solução de paraformaldeído 4% em PB 0,1M e desidratados em soluções de álcool Material e Métodos 58

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com concentrações crescentes (50, 70 e 95%, por 1 minuto em cada uma). Para reduzir a ligação não específica da sonda, os cortes foram tratados por 10 minutos em uma solução de anidro acético 0,25% contendo 0,1M de trietolamina. A seguir, as seções foram banhadas em 0,2X SSC, novamente desidratas e secas em temperatura ambiente. A detecção do RNAm para CRF foi feita por meio de sonda complementar ( riboprobe) marcada com [S35]UTP

(AmershamPharmaciaBiotech®). Após a transcrição da sonda por métodos convencionais (SP6 RNA polimerase), os cortes foram hibridizados por 12 horas a 55°C. Aproximadamente 100 µl de sonda foram aplicados por lâmina. Após a hibridização as seções foram tratadas com RNAse A (200 µg/ml) por 1h a 37°C e colocadas em uma série de banhos por 1 hora cada (2X SSC a 50°C; 0,2X SSC a 55°C e 0,2X SSC a 55°C). Após serem desidratas e secas, as seções foram expostas a um filme de raio-X por 2 dias e, em seguida, mergulhadas em emulsão fotográfica. Depois de 10 dias a 4°C a emulsão foi revelada e as lâminas foram desidratadas, cobertas e observadas em campo escuro e/ou claro para identificação das áreas marcadas.