Perfil da expressão de genes homeobox em linhagens celulares de carcinoma epidermóide de boca... por Thaís Acquafreda Antunes - Versão HTML

ATENÇÃO: Esta é apenas uma visualização em HTML e alguns elementos como links e números de página podem estar incorretos.
Faça o download do livro em PDF, ePub, Kindle para obter uma versão completa.

THAÍS ACQUAFREDA ANTUNES

PERFIL DA EXPRESSÃO DE GENES HOMEOBOX EM LINHAGENS

CELULARES DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA

ESTIMULADAS PELO ÁCIDO RETINÓICO

São Paulo

2009

Thaís Acquafreda Antunes

Perfil da expressão de genes homeobox em linhagens celulares de

carcinoma epidermóide de boca estimuladas pelo ácido retinóico

Tese

apresentada à Faculdade de

Odontologia da Universidade de São

Paulo, para obter o título de Doutor, pelo

Programa de Pós-Graduação em

Odontologia.

Área de Concentração: Patologia Bucal

Orientador: Prof. Dr. Fabio Daumas Nunes

São Paulo

2009

Catalogação-na-Publicação

Serviço de Documentação Odontológica

Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo

Antunes, Thaís Acquafreda

Perfil da expressão de genes homeobox em linhagens celulares de

carcinoma epidermóide de boca estimuladas pelo ácido epidermóide /

Thaís Acquafreda Antunes; orientador Fabio Daumas Nunes. -- São

Paulo, 2009.

111p. : fig., tab.; 30 cm.

Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

Área de Concentração: Patologia bucal) -- Faculdade de Odontologia

da Universidade de São Paulo.

1. Genes homeobox – Carcinoma de células escamosas –

Avaliação 2. Patologia bucal

CDD 617.63

BLACK D61

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,

DESDE QUE CITADA A FONTE E COMUNICADA AO AUTOR A REFERÊNCIA DA CITAÇÃO.

São Paulo, ____/____/____

Assinatura:

E-mail:

FOLHA DE APROVAÇÃO

Antunes TA. Perfil da expressão de genes homeobox em linhagens celulares de

carcinoma epidermóide de boca estimuladas pelo ácido retinóico [Tese de

Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2009.

São Paulo,___/___/ 2009.

Banca Examinadora

1) Prof(a). Dr(a). _________________________________________________________

Titulação: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura: ________________________________

2) Prof(a). Dr(a). _________________________________________________________

Titulação: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura: ________________________________

3) Prof(a). Dr(a). _________________________________________________________

Titulação: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura: ________________________________

4) Prof(a). Dr(a). _________________________________________________________

Titulação: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura: ________________________________

5) Prof(a). Dr(a). _________________________________________________________

Titulação: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura: ________________________________

DEDICATÓRIA

À minha querida mãe, Maria Cecília, a pessoa mais importante da minha vida.

Obrigada por estar sempre ao meu lado, me ajudando e me incentivando a alcançar

os meus objetivos. Sem você eu não teria chegado até aqui. Você é o meu exemplo

de vida.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Fabio Daumas Nunes pelos conhecimentos

transmitidos e disponibilidade para orientação desde os tempos de Iniciação

Científica.

Aos meus co-orientadores Prof. Dr. Kenneth J. Soprano e Profa. Dra. Dianne R.

Soprano por me receberem em seus laboratórios, me ensinarem tanto sobre

pesquisa e colaborarem de forma fundamental na execução desse trabalho.

À Profa. Dra. Vera Cavalcanti de Araújo e ao Prof. Dr. Ney Soares de Araújo pelo exemplo em pesquisa em Patologia Bucal no Brasil.

À todos os professores da disciplina de Patologia Bucal da FOUSP, Profa. Dra.

Suzana C. Orsini Machado de Sousa, Prof. Dr. Décio dos Santos Pinto Júnior,

Profa. Dra. Marina Helena C. G. de Magalhães, Profa. Dra. Andréa Mantesso e

Profa. Dra. Karem Lopes Ortega pelo convívio, disponibilidade e ensino em

Patologia Bucal.

À Profa. Dra Marília Trierveiler Martins que, além de me ensinar muito sobre pesquisa e Patologia Bucal, foi uma grande amiga durante esses anos de Pós-Graduação.

Às amigas e companheiras de laboratório Dorret Gardner, Evelyn Sirisani, Erin Payne, Dra. Maria Radu e Dra. Jianhua Zhao (JJ) que me receberam de braços abertos no laboratório, me ajudaram, me incentivaram, me mostraram um pouquinho

da cultura de vocês e fizeram com que o trabalho fosse sempre mais alegre e

divertido.

Aos colegas de laboratório Brandy Pickens, Bryan Teets, Fang Wang e Zhen Ping Zhang pela convivência e sugestões dadas nesse trabalho.

Aos amigos da Turma da Copa da Patologia Bucal:

Paulo. Agradecer você é algo muito difícil. Não sei nem por onde começar.

Seria pela companhia desde a Graduação, inclusive no ônibus? Seriam pelas piadas

ótimas que você solta? Seria pelo exemplo de profissional? Seria pelo amigo legal

que você é? A única coisa que sei, é que você fez esses anos de

Odontologia/Patologia serem muito mais divertidos.

Karen. Agora Profa. Dra. Karen Renata Nakamura Hiraki. Pelo exemplo de

pessoa que você. Uma amiga extraordinária, companheira e dedicada e uma

profissional exemplar. Você faz muita falta por aqui.

Juliana. Pela amizade e companheirismo durante esses anos. E que, mesmo

quando eu estava fora, sempre fez questão de manter contato. Estou torcendo muito

pelo seu sucesso.

Alexandra. Pelo exemplo de pessoa que consegue se desdobrar entre

pesquisa e consultório, mas ainda arruma tempo para ser uma grande amiga e ter

sempre na ponta da língua uma música da nossa infância, que ninguém mais

lembrava que existia.

Renata. Pela amizade, companheirismo, troca de idéias e exemplo de

profissional e pessoa que você é.

Nathalie. Pela amizade durante todos esses anos de pós. Em especial,

durante o doutorado quando as nossas vidas passaram por grandes mudanças, mas

que conseguimos superar tudo com muito luxo, glamour e sofisticação.

Fabi e Márcio. Pelo exemplo de pessoas que vocês são. Profissionais

competentes, que conquistaram o espaço e respeito no departamento. Amigos leais,

fiéis, companheiros e que, além de tudo, formam um casal lindo. Também tenho que

agradecer por permitirem que o apartamento de vocês seja o quartel-general da

turma.

Pati Adachi. Pela convivência, amizade e apoio durante esses anos.

Aos amigos Erin, Jess, Tim, Kate, Becka, Virginia, Monica, Panos, Bryan,

Danielle, Lis, Phil, Todd e Ryan que me receberam muito bem e me mostraram como é a vida americana fora do laboratório e nos horários de happy hour. Sem a

amizade de vocês os meus dias na Philadelphia teriam sido muito mais difíceis.

À Profa. Dra. Tatiana Libório pelo apoio, troca de experiências, convivência e, acima de tudo, amizade, durante todos esses anos.

À Dra. Márcia Campos pelo apoio e amizade, mesmo que a distância e um pouco

tardia.

Aos colegas da Patologia Bucal Aline, Aluna, Ana Cláudia, Arthur, Brunno,

Camila Fragata, Camila Rodini, Erika, Fábio Coracin, Fátima, Felipe Sperandio,

Fernanda Yamamoto, Fernanda Giudice, Flávia Caló, Kati, Luciana Sassa,

Marina, Roberto, Yonara pelo apoio e convivência.

À todas as funcionárias da disciplina de patologia bucal Zilda, Néia, Nair, Elisa e Bia pelo convívio e pela presteza sempre que foi preciso.

Ao Centro de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa para cursar a Pós-Graduação em Patologia Bucal e pela bolsa PDEE para

estágio no exterior.

Ao National Institute of Health pelo financiamento desse estudo.

À todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para o meu percurso no

curso de Doutorado da FOUSP .

Antunes TA. Perfil da expressão de genes homeobox em linhagens celulares de

carcinoma epidermóide de boca estimuladas pelo ácido retinóico [Tese de

Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2009.

RESUMO

O carcinoma epidermóide de boca, neoplasia maligna de boca mais comum, pode

originar-se de lesões potencialmente malignas. O ácido retinóico, que atua no

crescimento e diferenciação celular, tem sido comumente estudado como um

possível quimioterápico na prevenção dessa progressão. Embora o mecanismo pelo

qual o ácido retinóico previne essa progressão, e promove a parada do crescimento

celular, não esteja estabelecido, sabe-se que os genes homeobox são importantes

alvos do ácido retinóico durante o desenvolvimento embrionário e diferenciação

tecidual. Este estudo visa determinar se a modulação da expressão desses genes

está envolvida na inibição do crescimento pelo ácido retinóico em carcinoma

epidermóide de boca. Para isso, foi realizado PCR array para avaliar a expressão de

84 genes homeobox na linhagem celular de carcinoma epidermóide de boca

sensível ao ácido retinóico SSC-25, comparando com a linhagem resistente, SSC-9,

após o tratamento com ácido retinóico por sete dias. Os resultados mostraram nove

genes com perda de expressão e quatro com alta expressão. A validação por qPCR

de 7 desses genes confirmou os resultados. Desses, três genes(ALX1, DLX3, TLX1)

foram selecionados para terem a expressão avaliada em amostras tratadas por 3, 5

e 7 dias. O gene ALX1 apresentou baixa expressão apenas no dia 7. O gene DLX3

apresentou baixa expressão no terceiro dia com maior decréscimo no sétimo. Já o gene TLX1, mostrou baixa significativa no quinto dia, com valores semelhantes no sétimo. Os dados mostram genes homebox são modulados pelo ácido retinóico em

linhagens de carcinoma epidermóide de boca. No entanto, esses genes não

parecem ser alvo direto da inibição do crescimento promovida pelo ácido retinóico.

Palavras-Chave: Carcinoma de Células Escamosas; Genes Homeobox; Retinóides

Antunes TA. Expression of homeobox gene in oral squamous cell carcinoma cell

lines under retinoic acid stimulus [Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de

Odontologia da USP; 2009.

ABSTRACT

Oral squamous cell carcinoma, the most frequent oral cancer, may arise from

potentially malignant oral lesions. Retinoic acid, which plays a role in cell growth and differentiation, has been frequently studied as a possible chemotherapeutic agent in

the prevention of this progression. While the mechanism by which retinoic acid

prevents progression and suppresses cell growth has not been completely

elucidated, it is known that homeobox genes represent important targets of retinoic

acid during embryogenesis and differentiation. The present study aims to determine if

modulation of the expression of these genes is involved in inhibition of OSCC cell

growth by retinoic acid. In order to achieve this goal a PCR array was performed to

evaluate the expression of 84 homeobox genes in retinoic acid sensitive SCC-25

cells compared to retinoic acid resistant SCC-9 cells following treatment with retinoic acid for 7 days. Results showed that 9 homeobox genes are downregulated and 4

are upregulated by retinoic acid. The validation confirmed these results. Three genes

(ALX1, DLX3, TLX1) were selected for having their expression evaluated on samples

treated with retinoic acid for 3, 5 and 7 days. Three different patterns of gene

expression were observed. Gene ALX1 showed down-regulation only on day 7.

Homeobox gene DLX3 showed reduced expression on day 3 and decreased

expression on day 7. TLX1 showed a substantial down-regulation on day 5 with

similar values on. The data presented show that a number of homeobox genes are

modulated by retinoic acid in oral squamous cell carcinoma cell lines. However, these

genes do not appear to be direct targets of growth suppression trigged by retinoic

acid.

Keywords: Squamous cell carcinoma; Homebox genes; Retinoids

SUMÁRIO

p.

1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 13

2 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................. 15

3 PROPOSIÇÃO .................................................................................... 33

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 34

5 RESULTADOS .................................................................................... 46

6 DISCUSSÃO ....................................................................................... 62

7 CONCLUSÕES ................................................................................... 75

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 76

ANEXOS ................................................................................................. 86

13

1 INTRODUÇÃO

Atualmente, o tratamento do carcinoma epidermóide de boca baseia-se no

procedimento cirúrgico e uso de radioterapia complementar. No entanto, esse

modelo não tem se mostrado eficiente na redução das taxas de mortalidade. Um dos

principais fatores para a dificuldade no tratamento dessa doença é o alto índice de

segundo tumores primários e recidivas. Com o objetivo de reduzir esses índices,

diversos grupos de pesquisa focaram os seus estudos na busca de substâncias que

prevenissem o reaparecimento da doença.

Uma das substâncias que tem sido amplamente testada é o ácido retinóico.

Nos ensaios pré-clínicos ele se mostrou capaz de promover parada do ciclo celular e

diferenciação celular, reduzindo o potencial agressivo da célula. No entanto, os

ensaios clínicos não foram tão promissores. A utilização de altas doses do ácido

retinóico é eficaz na redução dos índices de recidiva, porém grande parte dos

pacientes acaba abandonando o tratamento devido aos diversos efeitos colaterais.

Quando uma baixa dose é administrada, os resultados da prevenção de novas

lesões não são promissores. Diante desse impasse, pesquisas que venham

esclarecer os mecanismos de ação do ácido retinóico, que até agora não estão

completamente estabelecidos, podem fornecer alternativas terapêuticas.

Durante o desenvolvimento embrionário já foi demonstrado que o ácido

retinóico é capaz de promover a expressão de diversos genes da família dos

homeobox. Esses genes estão envolvidos na diferenciação e definição da identidade

celular, sendo que sua expressão já foi relatada em diversas neoplasias malignas,

inclusive no carcinoma epidermóide de boca.

14

Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a expressão de

84 genes homeobox através da técnica de PCR array em linhagens celulares de

carcinoma epidermóide de boca tratadas com ácido retinóico, para encontrar genes

que possam estar envolvidos na inibição do crescimento celular promovida pelo

ácido retinóico no carcinoma epidermóide.

15

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Carcinoma epidermóide de boca

De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde, as neoplasias

malignas de boca ocupam a oitava posição entre as mais freqüentes no mundo.

Entre as neoplasias malignas de boca, o carcinoma epidermóide é a mais comum,

representando mais de 90% dos casos. No entanto, a incidência dessa neoplasia

varia de acordo com hábitos culturais, como mascar folhas de bétel e tabaco, que

fazem com que a taxa de incidência de câncer de boca seja superior em algumas

áreas do mundo (WORLD HEALTH REPORT, 2003).

Estatísticas prevêem um total de 23.100 novos casos de câncer de boca para

o ano de 2009 nos Estados Unidos, sendo 15.220 entre os homens e 7.890 entre as

mulheres. Com relação à sobrevida após 5 anos, observou-se uma taxa de 53% no

período de 1975-1977 e 60% entre 1996 e 2004, indicando aumento dessa taxa

(JEMAL et al., 2009). Estudos que avaliaram a sobrevida separando casos de

cavidade bucal e lábio mostraram que para lesões da cavidade bucal a sobrevida é

de 56,70% e 42,6% nos Estados Unidos e na Alemanha, respectivamente

(CARVALHO et al., 2005; GUNTINAS-LICHIUS et al., 2009) . No Brasil, o Instituto

Nacional do Câncer previu para o ano de 2008, 14.160 novos casos de câncer de

boca, sendo 10.380 entre os homens e 3.780 entre as mulheres (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2007). A taxa de mortalidade para neoplasias malignas de boca, no período

16

de 1979 a 1998, variou de 2,16 para 2,96 a cada 100.000 homens e de 0,48 para

0,70 a cada 100.000 mulheres no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

Homens acima dos 50 anos de idade são mais acometidos por essa

neoplasia, embora registros atuais revelem um aumento nos casos entre as

mulheres e pacientes jovens. As lesões podem acometer qualquer região da boca,

porém são mais freqüentes em língua, soalho bucal e lábio. Clinicamente,

apresentam aspecto ulcerado, com bordos elevados e endurecidos, fundo necrótico,

base infiltrativa e propensão a metástases precoces e extensas. Ao exame

histológico, observa-se uma neoplasia epitelial invasiva, exibindo diferentes graus de diferenciação escamosa e infiltração para os tecidos adjacentes (JEMAL et al., 2009;

WORLD HEALTH ORGANIZATION CLASSIFICATION OF TUMOURS, 2005).

A etiologia do carcinoma epidermóide de boca não está completamente

estabelecida. Considerando-se que a carcinogênese é um processo que envolve

diversos passos, acredita-se que não seja apenas um agente específico o

responsável pela formação dessa neoplasia, mas sim uma associação de diversos

fatores (NEVILLE et al., 2002). Entre os possíveis fatores, destacam-se o uso de

tabaco e álcool, que, quando metabolizados, levam a formação de substâncias

capazes de produzir danos ao DNA (DAS; NAGPAL, 2002; HOMANN et al., 1997;

KUPER; ADAMI; BOFFETTA, 2002). A participação de vírus na gênese do

carcinoma epidermóide de boca ainda é incerta, sendo que alguns estudos sugerem

a participação dos vírus HPV e EBV (HERMANN et al., 2004). Deve-se levar em

consideração que os casos de carcinoma epidermóide de lábio possuem etiologia

diferente dos demais sítios da boca, estando intimamente ligados a radiação

ultravioleta, ao contrário das demais lesões (DAS; NAGPAL, 2002; JOHNSON,

2001).

17

O câncer é uma doença genética, resultado de acúmulo de alterações no

DNA que levam a formação de célula com capacidade de proliferação e crescimento

autônomos. (CUPERLOVIC-CULF; BELACEL; OUELLETTE, 2005; KIM; CALIFANO,

2004). Para o carcinoma epidermóide de boca ainda não há um perfil molecular

definido, devido a sua patogênese complexa e a necessidade de desestabilização

de diversos sistemas de controle celular para que ocorra a carcinogênese

(SCHLIEPHAKE, 2003). Entre as alterações moleculares já descritas, destacam-se o

aumento da expressão protéica do EGFR, TGF-α, ciclina D1, ciclina E, e a

amplificação de genes da família ras (GRANDIS; TWEARDY, 1993; RUBIN

GRANDIS et al., 1998; SHINTANI et al., 2002). A literatura também relata mutações nos genes TP53 e p16, e que a diminuição de p63 está relacionada à invasão celular

(HIGASHIKAWA et al., 2007; LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002; REED et al., 1996).

Estudos recentes descreveram a expressão de micro-RNAs e a presença de células

tronco cancerosas em carcinoma epidermóide de boca, o que levanta a

possibilidade de novos mecanismos envolvidos na patogênese do carcinoma

epidermóide de boca (CHIOU et al., 2008; LIU et al., 2009).

O tratamento do carcinoma epidermóide de boca é realizado em sua maior

parte através de cirurgia, seguido por cirurgia e radioterapia combinadas e,

raramente, por apenas radioterapia (CARVALHO et al., 2005). Apesar dos trabalhos

descrevendo novos marcadores tumorais e de prognóstico, houve pouca mudança

na taxa de sobrevida após 5 anos, que se mantém em torno de 50% (KIM;

CALIFANO, 2004). Um dos principais problemas do tratamento do carcinoma

epidermóide de boca é o desenvolvimento de segundos tumores primários. Já foi

demonstrado que pacientes com câncer de boca que têm a doença limitada a um

sítio primário apresentam risco de desenvolver segundos tumores primários no trato

18

aerodigestivo com taxas que variam de 2 a 7% por ano. Com o objetivo essas taxas,

o uso de agentes quimioprotetores que bloqueiem ou consigam reverter o processo

de carcinogênese, tornaram-se importante foco nas pesquisas do carcinoma

epidermóide de boca (RALHAN et al., 2006). Diferentes substâncias têm sido usadas

com esse objetivo como, por exemplo, ácido retinóico, α -tocoferol and β-caroteno, embora um protocolo definitivo ainda não tenha sido obtido (RHEE; KHURI; SHIN,

2004).

2.2 Ácido retinóico

Os retinóides fazem parte de uma grande família de moléculas naturais ou

sintéticas, derivadas do retinol (vitamina A) que controlam vias de sinalização

durante o desenvolvimento embrionário e influenciam a proliferação e a

diferenciação de diversos tipos celulares em adultos (MONGAN; GUDAS, 2007).

Como essas moléculas não são naturalmente sintetizadas no organismo, o

retinol é obtido através da alimentação. Ele é carregado até as células-alvo através

do sangue pelas proteínas ligantes de retinol (RBP). Essas proteínas se ligam a

STRAT6, uma proteína transmembrana que promove a entrada do retinol na célula.

Uma vez dentro da célula, o retinol se liga a proteína ligante de retinol celular I

(CRBPI). Essa proteína é responsável por direcionar o retinol para diferentes

enzimas envolvidas no seu metabolismo. Uma dessas enzimas é a lecitina retinol

acil transferase (LRAT) que esterifica o retinol em retinil ester, forma de acumulação de retinol nas células. As enzimas ADH1, ADH4, RDH4, RDH5 e P450promovem

19

oxidação de retinol em retinal. Em seguida, uma dehidrogenação irreversível

catalisada pelas enzimas retinal deidrogenases citossólicas (RALDH1, RALDH2,

RALDH3, RALDH4) convertem o retinal em ácido retinóico all-trans (atRA). Assim

que o atRA foi formado, um grupo de proteínas ligantes ao atRA celular (CRABPI e

CRABPII) transferem o atRA para o núcleo ou para as enzimas citossólicas

responsáveis pelo seu catabolismo e eliminação (BULETIC; SOPRANO; SOPRANO,

2006; KAWAGUCHI et al., 2007; MONGAN; GUDAS, 2007). Uma vez no núcleo, o

ácido retinóico exerce a sua função através de dois grupos de receptores, receptores

de ácido retinóico (RARs) e receptores X retinóicos (RXRs). Esses receptores

apresentam três isoformas cada um (RAR-α, RAR-β, RAR-γ and RXR-α, RXR-β,

RXR-γ) que são traduzidas a partir de “splicing” alternativo. Eles atuam como fatores

de transcrição ligante-ativados na forma de heterodímeros (RAR/RXR) ou

homodímeros (RXR) que se ligam a elementos responsivos ao ácido retinóico

(RARE) presentes na região promotora dos genes alvo (Figura 2.1) (SWIFT et al.,

2006).

A capacidade de diferenciação e controle do crescimento celular promovida

pelo ácido retinóico foi demonstrada durante o desenvolvimento embrionário e em

tecidos adultos em diversos trabalhos e esses processos ocorrem através de

redução da síntese de DNA e aumento no tempo de duplicação celular, com

mudanças morfológicas das células. A capacidade de agir em diferentes tipos

celulares e em diferentes estágios do desenvolvimento está relacionada à habilidade

que o ácido retinóico tem de alterar a expressão diversos tipos de genes, no entanto,

ainda não foi encontrado um mecanismo de ação comum (GUDAS, 1992;

SOPRANO; SOPRANO, 2002).

index-22_1.png

20

Figura 2.1 – Esquema ilustrando o metabolismo do retinol até se converter em ácido retinóico all-trans

Uma importante ação do ácido retinóico é a parada do ciclo celular durante

a fase G1 (WU et al., 1997). Foi demonstrado que o ácido retinóico tem a

capacidade de aumentar a taxa proteolítica das proteínas ciclina D1 e ciclina E, que

atuam na parada do ciclo celular (DIMBERG et al. 2002; FREEMANTLE et al., 2007).

O ácido retinóico também promove a parada do ciclo celular através do aumento do

nível da proteína p27 em neuroblastomas, carcinomas de pulmão de células

pequenas, carcinomas de ovário e melanomas (NILES, 2004; VUOCOLO;

SOPRANO; SOPRANO, 2004).

A atuação do ácido retinóico já foi amplamente descrita em carcinoma

epidermóide de boca. Em 2000, Hayashi et al. analisaram os efeitos de ácido

retinóico 9-cis em seis linhagens celulares de carcinoma epidermóide de boca. Eles

observaram que a linhagem que não respondeu ao ácido apresentava baixos níveis

de RAR-β, e as linhagens que responderam ao tratamento mostraram mudanças

21

nas proteínas do ciclo celular como redução de ciclina-D1, cdk4, kinase ativadora de

CDK e expressão de p21Waf1/Cp1, p27Kip1, p300, CBP, BAX, Bak e bcl-2. Outro estudo

verificou que o ácido retinóico all-trans inibe o crescimento celular em carcinoma

epidermóide de boca, com o aumento concomitante da expressão de queratina 13,

p21Waf1/Cp1 e p27Kip1, e diminuição de COX-2, o que sugere que ocorra diferenciação

celular através de mecanismos envolvendo essas proteínas (KURODA et al., 2005).

Xiao et. (2006) mostraram que a inibição do crescimento do carcinoma epidermóide

de boca promovida pelo ácido retinóico all-trans é dose e tempo dependente e

acompanhada por aumento de fosfatase alcalina, indicando que as células passam

por um processo de diferenciação celular.

Diversos estudos clínicos utilizando ácido retinóico na quimioprevenção do

carcinoma epidermóide de boca já foram realizados. Hong et al. (1986)

demonstraram que altas doses de 13-cis ácido retinóico (isotretinoína) foram

capazes de diminuir o tamanho de leucoplasias orais. Entretanto, a toxicidade foi

alta e 50% dos pacientes que tiveram resposta a medicação, apresentaram recidiva

após 3 meses após o término do tratamento. Com o objetivo de reduzir a toxicidade

e evitar recidivas, Lippman et al. (1993) trataram pacientes com leucoplasias com

altas doses de isotretinoína por 3 meses, seguido por tratamento com baixas doses

de isotretinoína ou β-caroteno por 9 meses. Esse protocolo conseguiu estabilizar ou

permitir a regressão das lesões. Entretanto, o seguimento dos pacientes não

mostrou diferenças no tempo de sobrevida livre de doença.

Com o objetivo de prevenir segundos tumores primários em pacientes com

carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, placebo ou doses variadas de

isotretinoína foram administrados aos pacientes durante um ano. Após um período

de 54 meses 14% dos pacientes do grupo do isotretinoína apresentaram recidiva

22

contra 31% do grupo placebo, no entanto os efeitos adversos que incluíram

ressecamento da pele, conjuntivite e queilite fizeram com que 33% dos pacientes

abandonassem o tratamento (BENNER et al., 1994). Um estudo clínico fase III tratou

1190 pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, estádios I e II,

com baixa dose de isotretinoína (30 mg/dia) ou placebo. Após o acompanhamento

por quatro anos, verificou-se que os resultados da prevenção de segundos tumores

primários no grupo isotretinoína não foram estatisticamente significantes quando

comparados aos resultados do grupo placebo (KHURI et al., 2006).

Os trabalhos da literatura mostram controvérsias entre os resultados obtidos

nos estudos pré-clínicos e clínicos e entre os diversos estudos clínicos realizados

para a utilização do ácido retinóico na quimioprevenção do carcinoma epidermóide

de boca. Diante desse problema, autores sugerem que estudos que envolvam a

combinação de ácido retinóico com outras drogas, e que entendam melhor a via de

sinalização e os alvos do ácido retinóico, poderão favorecer a utilização clínica

dessa droga (FREEMANTLE; DRAGNEV; DMITROVSKY, 2006). Entre os genes

alvo do ácido retinóico, destacam-se a família homebox, em especial os genes HOX.

2.3 Genes homeobox

Genes homeobox representam uma grande família de fatores de transcrição

que já foram descritos nos cinco reinos animais e estão fortemente ligados ao

desenvolvimento embrionário e diferenciação celular. O termo “homeo” vem do

grego e significa similar, parecido. Ele foi inicialmente empregado para nomear um

index-25_1.png

23

grupo de genes da Drosophila, os genes do complexo homeótico (HOM-C), que

eram capazes de causar homeose. Esse fenômeno consiste na transformação de

uma estrutura do corpo em outra perfeitamente igual, quando há mutação em genes

homeóticos (Figura 2.2) (DE ROBERTIS; OLIVER; WRIGHT, 1990; MARK; RIJLI;

CHAMBOM, 1997).

Figura 2.2 – Transformações homeóticas na Drosophila melanogaster. (A) Drosophila normal, (B) mutação no gene Bithorax que leva a formação de um par de asas a mais e (C)

mutação no gene Antennapedia exibindo uma pata no lugar da antena (GRIER et al.,

2005)

Os genes dessa família possuem uma seqüência de DNA comum de 183pb,

denominada homeobox, que codifica uma seqüência protéica de 61 aminoácidos

chamada homeodomínio. O homeodomínio exibe uma estrutura de três α-hélices

que se manteve conservada durante a evolução, e é responsável pela ligação da

proteína ao DNA para exercer a função de fator de transcrição. As duas primeiras

hélices apresentam-se paralelas entre si e cruzando a terceira, que é a responsável

pela ligação ao DNA (ABATE-SHEN, 2002; CILLO et al., 2001; MARK; RIJLI;

CHAMBOM, 1997).

Em mamíferos, mais de 200 genes homeobox já foram descritos e eles

encontram-se divididos em duas grandes famílias, a dos homeobox agrupados,

também chamados de genes HOX, e a dos não agrupados. Os genes HOX possuem

grande homologia com os genes do complexo HOM-C da Drosophila melanogaster e por isso são também genes homeóticos. Até agora, 39 genes HOX já foram

index-26_1.png

24

identificados e eles estão agrupados em quatro grupos A, B, C e D, localizados,

respectivamente, nos cromossomos 7, 17, 12 e 2. Esses genes controlam a

identidade celular e são responsáveis por determinar o posicionamento ântero-

posterior no embrião. Eles são expressos de maneira que genes localizados na

região 3’ são expressos primeiro e em regiões anteriores do embrião, enquanto

genes mais a 5’ são expressos mais tardiamente durante o desenvolvimento, e em

áreas mais posteriores (Figura 2.3) (DEL BENE; WITTBRODT, 2005; GRIER et al.,

2005; HOEGG; MEYER, 2005).

Figura 2.3 –Conservação das famílias de genes HOM-C em Drosophila melanogaste r e HOX em humanos. Em humanos há 4 “clusters” de genes HOX que surgiram a partir de

duplicação e divergência dos genes do complexo HOM-C da Drosophila. Esses genes

são expressos seguindo colinearidade espacial e temporal, sendo que genes da região

3’são expressos primeiro e na parte anterior do embrião. (GRIER et al., 2005)

A classe dos homeobox não agrupados é formada por um número de genes

superior aos HOX, e tem aumentado com a freqüente descoberta de novos genes. A

característica marcante deles é a combinação do homeodomínio com outros

index-27_1.png

25

domínios, o que dá origem a subfamílias de genes homeobox, e contribui para a

especificidade de ligação ao DNA (DEL BENE; WITTBRODT, 2005). Esses genes

apresentam-se dispersos pelo genoma e, assim como os HOX, os homeobox não

agrupados também apresentam homologia com genes da Drosophila. Entre esses

genes podemos citar: os PAX, os MSX, os EMX, os OTX e os DLX, que são

homólogos, respectivamente, ao paired, muscle segment homeobox, empty

spiracles, orthodenticle e distal-less (Figura 2.4) (CILLO et al., 2001).

Figura 2.4 – Os genes HOX são formados por 2 exons e 1 intron. O exon 2 possui uma seqüência com 183 pares de base que codifica uma proteína de 61 aminoácidos, o

homeodomínio, responsável pela interação com o DNA. Os genes LIM, MSX, PAX e

SIX são exemplos de homeobox não agrupados e possuem, além do homeodomínio,

domínios adicionais (GRIER et al., 2005)

As homeoproteínas atuam como fatores de transcrição graças a sua ligação

ao DNA através da seqüência de bases TAAT, e podendo agir tanto como

ativadores quanto como repressores da transcrição. Até agora, pouco se sabe sobre

os genes alvo dos homeobox e isso se deve em grande parte pela capacidade

seletiva que essas proteínas têm in vivo. Acredita-se que a especificidade das

index-28_1.png

26

homeoproteínas esteja ligada, além de sua seqüência, a diversos níveis de

regulação, incluindo controle pós-transcricional, transporte núcleo-citoplasma e

interações entre proteínas (Figura 2.5) (ABATE-SHEN, 2002). Entre os cofatores que

interagem com os homeobox, destacam-se o papel de duas famílias de homeobox, a

PBX e MEIS, que já foram descritos como importantes proteínas na interação com

outros homeobox (CHARBONEAU et al., 2005; FERNANDEZ; GUDAS, 2009;

SARNO; KLIMAN; TAYLOR, 2005).

Figura 2.5 – Esquema das modificações pós traducionais de homeoproteínas. M: modificações pós traducionais; GTF: fator de transcrição geral, do inglês “general transcritption

factor” (ABATE-SHEN, 2002)

Por participarem tão intensamente do processo de proliferação e

diferenciação celular, acredita-se que os genes homeobox tenham um grande

envolvimento com o controle do ciclo celular e apoptose e por essa razão, a

interação dos homeobox com esses processos vem sendo fortemente estudada

(Figura 2.5) (CILLO et al., 2001; DEL BENE; WITTBRODT, 2005; FORD, 1998;

MORETTI; COSTANZO, 2009; RADOJA et al., 2007). O HOX11/TLX1 é capaz de

anular o ponto de checagem da divisão celular na fase G2 através da interação com

index-29_1.png

27

a proteína fosfatase 2A (FORD, 1998; CILLO et al., 2001). O gene PITX2 é capaz de

induzir a expressão de genes controladores da fase G1 do ciclo celular, como ciclina

D1, D2 e c-Myc (BAEK et al., 2003). Acredita-se que os genes MSX sejam capazes

de inibir a diferenciação celular impedindo que a célula saia do ciclo celular. Esse

modelo pode ser comprovado em camundongos com defeitos na diferenciação em

células epiteliais e mesenquimais da glândula mamária, que têm expressão

aumentada de Msx1 e que tiveram um aumento na ciclina D1 e CDK4 (HU et al.,

2001). A proteína p63, que é um fator de transcrição homólogo ao p53 e p73, possui

seis diferentes isoformas que estão intimamente relacionadas a expressão do

homeobox DLX3. A isoforma TAp63α ativa e TAp63γ reprime a transcrição do DLX3.

O DLX3 por sua vez, promove a fosforilação da Raf1 que promove a ubiquitinização

da isoforma ΔNp63α (DI COSTANZO et al., 2009; MORETTI; COSTANZO, 2009;

RADOJA et al., 2007).

Figura 2.5 – Genes Homeobox e os seus alvos no ciclo celular. As linhas azuis indicam ativação ou repressão direta, as linhas vermelhas mostram interação proteína-proteína, as

linhas verdes mostram ativação ou repressão indireta e as linhas pretas incidam

interações que ainda não se mostraram como diretas (DEL BENE; WITTBRODT,

2005)

28

2.3.1 Genes homeobox e ácido retinóico

Os mecanismos envolvidos na expressão dos genes homeobox ainda não

estão esclarecidos. No entanto, estudos envolvendo desenvolvimento de embriões

de camundongos levaram a identificação do ácido retinóico como um possível

ativador dos genes HOX.

O estudo de 33 genes HOX na linhagem celular de carcinoma embrionário

NT2/D1 induzida por ácido retinóico para promover diferenciação celular, revelou

que 22 genes tiveram um aumento de expressão em células tratadas com ácido

retinóico a 10µM por 14 dias. Também foi observado que os 11 genes, cujos níveis

de expressão se mantiveram indetectáveis após o tratamento, se localizavam na

região 5’ de cada grupo de genes HOX. De acordo com os resultados, os autores

propuseram que os genes HOX são diferentemente ativados pelo ácido retinóico

nessas células de acordo com a sua localização nos diferentes grupos de genes

HOX (STORNAIUOLO et al., 1990).

Quando a expressão dos genes HOX foi analisada nas linhagens celulares

NT2/D1 e TERA2/clone13 induzidas por ácido retinóico em concentrações de 10-5 e

10-7 M, durante períodos que variaram de 1h a 180h, diferentes padrões de

expressão gênica foram observados. Genes localizados na região 3’ foram

inicialmente ativados e a ativação ocorreu de forma colinear no lócus. Genes

localizados na região 5’ não apresentaram ativação pelo ácido retinóico. Também foi

observado que alguns genes tiveram padrões de expressão diferentes. HOXC13,

D10, D11, D12 e D13 apresentavam uma baixa expressão em células não tratadas

29

com ácido retinóico e que foi progressivamente reduzida com o tratamento. Esses

resultados indicaram que existem 3 grupos de genes HOX. O primeiro grupo

apresenta aumento da expressão dos genes com o estímulo das células com ácido

retinóico, o segundo não apresenta mudanças na expressão e o terceiro exibe baixa

da expressão. Segundo os autores, essas diferenças indicam que o ácido retinóico é

capaz de alterar a expressão dos genes HOX, mas não de ativá-los inicialmente

(SIMEONE et al., 1990; 1991).

Estudos com a linhagem celular de teratocarcinoma humano NT2/D1

demonstraram que muitos genes HOX são estimulados por ácido retinóico. Já foi

observado que existe uma correspondência entre a localização do gene e a sua

resposta ao estímulo por ácido retinóico. Genes HOX localizados próximo a região 3’

são induzidos rapidamente e por baixas concentrações de ácido retinóico, e a

medida que a distância da região 3’ aumenta, aumenta também o tempo e a

concentração para a indução por ácido retinóico (LANGSTON; GUDAS, 1994;

SIMEONE et al., 1991).

As evidências da influência do ácido retinóico na expressão dos genes

homeobox levaram diversos grupos a investigarem a existência de elementos

responsivos de ácido retinóico (RARE) nos genes homeobox. O estudo da região

promotora do HOXA1 identificou a presença de um sítio RARE localizado a jusante

do promotor do gene, e que auxilia na modulação da sua expressão (LANGSTON;

GUDAS, 1992). Estudos semelhantes foram realizados para HOXB1, HOXD4, CDX1

e MSX1 e identificaram a presença de RARE também para esses genes (HOULE;

SYLVESTRE; LOHNES, 2003; MORONI; VIGANO; MAVILIO, 1993; OGURA;

EVANS, 1995; SHEN et al., 1994).

30

2.3.2 Homeobox genes e cancer

Durante a carcinogênese diversos genes homeobox apresentam-se alterados,

tanto para ganho quanto para perda de função (FORD, 1998). Entre os genes que

apresentam ganho de função podemos citar o HOXB7 que promove proliferação

celular através da ativação do bFGF em melanoma (CARE et al., 1996). O

homeobox SIX1 foi detectado em diversas linhagens celulares, incluindo linhagens

celulares de carcinoma mamário primário e metastático. Esse gene também tem

aumento da sua expressão em rabdomiossarcomas, sendo correlacionado com a

formação de metástases. Durante a hematopoiese, a expressão de HOXA10 foi

relatada em células precursoras mielóides e, em camundongos, a sua

superexpressão leva a proliferação celular (DEL BENE; WITTBRODT, 2005).

A família de genes PAX é, entre os homeobox, a que apresenta uma

associação com a oncogênese melhor estabelecida. O gene PAX5 possui expressão

alterada em glioblastoma e meduloblastoma, além de estar envolvido na

translocação t(9;14) na leucemia linfoplasmocitóide. O PAX2 e o PAX8 foram

detectados no tumor de Wilms e o PAX3 está associado à diferenciação anormal de

melanócitos (CILLO et al., 2001).

O gene CDX2, que é expresso no intestino durante o desenvolvimento e

também na fase adulta, é um exemplo de homeobox que tem expressão diminuída

em linhagens celulares de carcinoma (EE et al., 1995). De forma semelhante ao

CDX2, o NKX3 é expresso nos estágios iniciais da formação da próstata até a idade

adulta, e é necessário para a diferenciação do epitélio da próstata. Camundongos

31

com mutações homozigóticas ou heterozigóticas nesse gene desenvolvem uma

lesão pré-maligna chamada neoplasia epitelial prostática. Embora essa lesão não

progrida para um carcinoma por si só, ela acelera a progressão maligna em

colaboração com a perda de função do gene supressor de tumor PTEN (ABATE-

SHEN, 2002).

Campo Dell'Orto et al. (2007) demonstraram que o DLX3 pode ser útil na

distinção de dois tipos de leucemia. Eles verificaram que na leucemia linfoblástica

aguda B t(4;11) (q21;q23) há alto nível de metilação e baixa expressão do DLX3,

enquanto na leucemia linfoblástica aguda B t(12;21) (p13;q22) e nos controles sem

translocação, o nível de metilação era baixo e o de expressão alto. Outro gene

homeobox que apresenta sua metilação ligada a progressão tumoral é o TLX1 em

carcinoma ductal de mama (TOMMASI et al., 2009).

Chen et al. (2005) avaliaram a presença dos 39 genes HOX em carcinomas

epidermóides de esôfago e em tecidos não tumorais adjacentes. Eles observaram

que oito genes HOX estavam presentes somente na neoplasia (HOXA10, HOXA13,

HOXB7, HOXC4, HOXC8, HOXD9, HOXD10, HOXD13) e cinco estavam expressos

tanto em CE quanto em tecido não tumoral (HOXA7, HOXA9, HOXC6, HOXA2,

HOXC9), sendo que três deles apresentaram expressão muito superior na neoplasia

maligna (HOXA7, HOXA9, HOXC6). Acredita-se que os cinco genes expressos em

ambos os tecidos tenham como função manter a estrutura normal da mucosa

esofágica, enquanto os oito que estão presentes apenas no CE, acrescidos dos

outros três que possuem expressão superior na neoplasia maligna, estejam

envolvidos na carcinogênese.

Apenas dois trabalhos na literatura que verificaram o perfil de genes

homeobox em carcinoma epidermóide de boca. Um deles foi realizado por Hassan et

32

al. (2006) que avaliaram os níveis de expressão de transcritos dos 39 HOX em

mucosa normal, displasia e carcinoma epidermóide de boca. Eles verificaram que 18

genes (HOXA1, A2, A3, A5, A9, B3, B6, B7, B9, C4, C6, C8, C9, C11, C13, D9, D10

e D11) apresentaram níveis de expressão diferentes entre mucosa normal,

displasias e carcinoma epidérmoide, sendo que todos eles apresentavam expressão

superior no carcinoma quando comparados com a mucosa normal. Os genes

HOXA2, A3, B3 e D10 estavam mais expressos em displasias que na mucosa

normal, no entanto não houve diferença na expressão entre displasias e carcinomas.

No entanto, as displasias apresentavam níveis de expressão inferiores para os

genes HOXA1, B7 B9 e C8 quando comparados ao carcinoma. Segundo os autores,

esses dados sugerem que a alteração na expressão de genes HOX pode estar

implicada na patogênese de displasias bucais e carcinoma epidermóide.

O segundo trabalho, desenvolvido por Zhu et al. (2004) verificou a

expressão do gene homeobox QUOX1 em carcinomas epidermóide de boca. Os

autores observaram que não há expressão do gene em tecido adjacente não

tumoral, mas sim em tecidos displásicos e no carcinoma. Segundo os autores, esses

achados sugerem que QUOX1 poderia funcionar como um marcador biológico de

malignidade e de proliferação do carcinoma epidermóide de boca.

33

3 PROPOSIÇÃO

Avaliar os efeitos do tratamento com ácido retinóico all-trans na expressão de

gene homeobox em linhagens celulares de carcinoma epidermóide de boca. Para

atingir essa meta, os seguintes objetivos específicos são propostos:

1. Realizar PCR array para 84 genes homeobox utilizando linhagens celulares

de carcinoma epidermóide de boca tratadas com ácido retinóico.

2. Validar os resultados obtidos no PCR array para os genes que apresentaram

perda de expressão, utilizando a técnica da PCR em tempo real.

34

4 MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Faculdade de

Odontologia da Universidade de São Paulo (Anexo A). Todos os procedimentos

laboratoriais foram realizados no Laboratório de Patologia Molecular da Disciplina de

Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, sob a

supervisão do Prof. Dr. Fabio Daumas Nunes e no Laboratório de Biologia Celular e

Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Temple University sob

a supervisão do Prof. Dr. Kenneth J. Soprano e da Prof. Dra. Dianne R. Soprano.

4.1 Linhagens celulares

As linhagens de carcinoma epidermóide humano de língua SCC-9 e SCC-25

foram obtidas na American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA). As

linhagens SCC-9 e SCC-25 foram isoladas de pacientes de 25 e 70 anos de idade,

respectivamente, e os tumores foram detectados menos de três meses antes da

biopsia utilizada para a cultura de células. Os pacientes não foram submetidos a

nenhum tratamento para os tumores antes da biópsia utilizada para a cultura de

células (RHEINWALD; BECKETT, 1981).

35

4.2 Cultura de células

As linhagens celulares foram mantidas em nitrogênio líquido e

crioprotegidas por dimetil sulfóxido (DMSO – Sigma, St. Louis, MO, USA) para

estoque de longo prazo. Quando necessário, as células foram descongeladas em

banho de água a 37°C por 2 min, sendo em seguida transferidas para um tubo

Falcon de 15ml contendo 10ml de uma mistura 1:1 de meio de Eagle modificado por

Dulbecco e de meio Ham F-12 (DMEM/F-12) (GIBCO; Carlsbad, California, USA)

suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (FBS; Mediatech Cellgro,

Herndon, VA, USA), 2mM L-glutamina (HyClone; Logan, UT, USA), 100U/ml de

penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (Mediatech Cellgro, Herndon, VA, USA) e,

então, centrifugado a 130x g por 5 minutos a 4oC (Brinkmann Eppendorf; Westbury, NY, USA). O sobrenadante foi aspirado e o precipitado de células dissolvido em

10ml de meio de cultura DMEM/F-12 (GIBCO; Carlsbad, California, USA)

suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (FBS; Mediatech Cellgro,

Herndon, VA, USA), 2mM L-glutamina (HyClone; Logan, UT, USA, 100U/ml de

penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (Mediatech Cellgro, Herndon, VA, USA) e

cultivado em placas para cultura de célula de 100mm a 37°C, em atmosfera úmida

contendo 5% de CO2. As células foram monitoradas em microscópio de fase e o

meio foi trocado a cada dois dias, dependendo do crescimento celular, até que as

células atingissem a confluência. As células foram passadas quando atingiram a

confluência de 100% e para isso, o meio de cultura foi aspirado, as células lavadas

com tampão fosfato salino (PBS)1X estéril pH7.2 e adicionado 2ml de tripsina 1X

(GIBCO, Invitrogen Corporation; Carlsbad, California, USA). As placas foram

36

mantidas a 25oC até as células se destacarem e então, 5ml de meio de cultura

DMEM/F-12 suplementado conforme descrito anteriormente, foi adicionado para a

inativação da enzima. As células em suspensão foram transferidas para um tubo

Falcon de 15 ml, centrifugadas 130x g por 5 minutos a 4oC (Brinkmann Eppendorf; Westbury, NY, USA) e subcultivadas em uma taxa de 1:10.

A contagem celular foi realizada utilizando-se hemocitômetro. Células

tripsinizadas e em suspensão em meio de cultura DMEM/F-12 foram misturadas na

taxa de 1:1 com 0.4% de azul de tripan (GIBCO, Invitrogen Corporation; Carlsbad,

California, USA) e 10µl da suspensão foi colocado no hemocitômetro. Todas as

contagens celulares foram realizadas em triplicata.

4.3 Ácido retinóico

Ácido retinóico all-trans (atRA) na forma de pó foi gentilmente fornecido por

Hoffmann-LaRoche, Inc. (Nutley, NJ, USA) e mantido protegido de luz em freezer -

20oC. A cada 3 semanas, soluções estoque de ácido atRA diluído em etanol na

concentração de 10-3M foram preparadas e estocadas a -20oC, protegidas de luz.

Para a determinação exata da concentração das soluções de estoque, a densidade

óptica das soluções foi verificada através de leitura em espectofotômetro (Beckman -

Du 640; Fullerton, CA, USA) na absorbância de OD350nm.

37

4.4 Curva de crescimento

Para a análise quantitativa da proliferação celular após o tratamento das

linhagens celulares SCC-9 e SCC-25 com atRA, 1X105 células foram plaqueadas em

placas para cultura de célula de 100mm e incubadas em meio DMEM/F-12

suplementado com 10% de soro fetal bovino, como previamente descrito, por 24

horas. Após esse período, solução de estoque de atRA foi adicionado ao meio de

cultura afim de atingir a concentração de 10-6M que já havia sido previamente

estabelecida como ideal (SOPRANO; SOPRANO, 2002). O meio de cultura celular

foi trocado a cada 2 dias e o atRA readicionado. A contagem celular foi realizada nos

dias 1, 3, 5 e 7, com o objetivo de definir o melhor período para tratamento dessas

linhagens com ácido retinóico. Culturas celulares controle foram tratadas com etanol

pelo mesmo e período e seguindo os mesmos procedimentos descritos para o ácido

retinóico. Todos os procedimentos foram realizados protegidos de luz e em triplicata.

4.5 PCR array

4.5.1 Extração de RNA

As linhagens celulares SCC-9 e SCC-25 foram tratadas com ácido retinóico

e com etanol por 7 dias como descrito para a curva de crescimento. Após o

38

tratamento com atRA, as células foram lavadas com PBS1X, tripsinizadas e

contadas. A extração de RNA foi realizada com o kit RT2 qPCR-Grade RNA Isolation

Kit (SABiosciences; Frederick, MD, USA), de acordo com as instruções do fabricante