Processos Celulares e Moleculares no Desenvolvimento do Sistema Visual em Operárias e Zangões de... por David Santos Marco Antonio - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

DAVID SANTOS MARCO ANTONIO

Processos celulares e moleculares no desenvolvimento do

sistema visual em operárias e zangões de

Apis mellifera

Ribeirão Preto – SP

2012

DAVID SANTOS MARCO ANTONIO

Processos celulares e moleculares no desenvolvimento do

sistema visual em operárias e zangões de

Apis mellifera

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo como parte dos requisitos para obten-

ção do título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Genética

Orientador: Prof. Dr. Klaus H. Hartfelder

Ribeirão Preto – SP

2012

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Marco Antonio, David Santos

Processos celulares e moleculares no desenvolvimento do sis-

tema visual em operárias e zangões de Apis mellifera. Ribeirão Preto,

2012.

80 p. : il. ; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Genética.

Orientador: Klaus Hartmann Hartfelder.

1. Lóbulo Óptico. 2. Olho Composto. 3. Apis mellifera.

4. Genética do Olho. 5. Insetos.

FOLHA DE APROVAÇÃO

David Santos Marco Antonio

Processos Celulares e Moleculares no Desenvolvimento do Sistema

Visual em Operárias e Zangões de Apis mellifera

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo como parte dos requisitos para obten-

ção do título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Genética

Banca Examinadora

Prof.(a) Dr.(a) ____________________________________________________

Instituição ____________________Assinatura __________________________

Prof.(a) Dr.(a) ____________________________________________________

Instituição ____________________Assinatura __________________________

Prof.(a) Dr.(a) ____________________________________________________

Instituição ____________________Assinatura __________________________

Prof.(a) Dr.(a) ____________________________________________________

Instituição ____________________Assinatura __________________________

Prof.(a) Dr.(a) ____________________________________________________

Instituição ____________________Assinatura __________________________

Agradecimentos

o À minha companheira Paola Fernanda Fedatto pela amizade, amor, paciência e suporte

que têm sido fundamentais na minha vida.

o Ao professor Klaus Hartfelder pela dedicação, apoio. Pelas discussões científicas e críti-

cas construtivas que foram e são essenciais ao meu desenvolvimento profissional e pesso-

al. Por ter acreditado no meu potencial.

o À minha família sempre me apoiando.

o Às professoras Zilá Luz Paulino Simões e Márcia M. Gentile Bitondi pelo acolhimento,

suporte e amizade.

o À técnica Vani Maria A. Corrêa pela grande ajuda em histologia e pelo acolhimento.

o Ao técnico Luiz Aguiar pela ajuda no apiário.

o Aos pós-graduandos Mônica , Sergio, Carolina e Fernanda pelas discussões na parte de

Biologia celular e molecular.

o Aos pós-graduandos Francis e Anete pela disponibilidade e paciência nas análises de

bioinformática e real-time.

o Às pós-graduandas Karina Guidugli e Adriana Mendes Nascimento pelas discussões cien-

tíficas e pela disponibilidade em ajudar.

o Aos pós-graduandos Alexandre Cristino e ao professor Roberto Barchuk, pelas discus-

sões sobre evolução, bioinformática e genômica.

o Às técnicas Vera Lúcia Figueiredo e Marcela A. Bezerra Laure que me orientaram nas

dissecções. Ao Pedro P. Prado pela ajuda no servidor

o Aos professores Ademilson Espencer E. Soares, Lionel S. Gonçalves e David de Jong pela

ajuda e amizade.

o Às amigas de laboratório Mipsi e Tatiana

o Ao professor Ricardo Ramos e seus alunos pelas discussões sobre o gene roughest.

o Aos pós-graduandos Angelika e Hans pelo auxílio e discussões e traduções

o Aos amigos Rogério, Michelle Manfrin, Thiago Francói, Fernanda S., Gesline, Ivan, Um-

berto, Omar, Rodrigo, Weider, Ana Durvalina, Michelle P., Moysés, Paulo Emílio, Va-

nessa, Amanda, Tatiana, Liliana, Paulinho e Robertinho pela grande amizade.

o Ao Departamento de Genética e Biologia Celular e Molecular e Bioagentes patogênicos

pela infra-estrutura oferecida.

o Agradeço a Deus por tudo.

o Ao CNPq pelo auxílio financeiro.

Resumo

Marco Antonio, D. S. Processos celulares e moleculares no desenvolvimento do sistema vi-

sual em operárias e zangões de Apis mellifera.

Mecanismos que regem o desenvolvimento do olho composto e lóbulo óptico tem sido am-

plamente estudados em Drosophila melanogaster onde a retina é formada a partir de um disco

imaginal anexado com o cérebro e os lóbulos opticos a partir do primórdio óptico externo.

Através de histologia comparativa e análise de expressão gênica no desenvolvimento do sis-

tema visual em Apis mellifera nós procuramos elucidar questões sobre plasticidade do desen-

volvimento subjacente a fortes diferenças sexo- e casta-específico no olho assim como contri-

buir com aspectos evo-devo. O desenvolvimento dos lóbulos ópticos ocorre por dobramento

neuroepitelial a partir de um centro de diferenciação no cérebro larval. Deste centro, a medu-

la, lamina e lóbula surgem ao mesmo tempo em operárias e zangões. Dois passos marcam a

diferenciação da lâmina (i) sua origem a partir da diferenciação de neuroblastos da camada

mais externa da medula, isso coincidindo com o primeiro pico de expressão de roughest, e (ii) 24 horas mais tarde o aparecimento dos omatideos hexagonais coincidindo com o segundo

pico de expressão de roughest. Com a inclusão de genes candidatos relacionados com o de-

senvolvimento do olho e lóbulos ópticos em insetos [ small optic lobe (sol), eyes absent (eya),

minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision ( elav) e epidermal growth factor receptor ( egfr)] nós encontramos distintos picos de expressão para sol, eya, mnb e so em níveis de transcritos e tempo de aparição do pico diferindo entre operárias e zangões. Enquanto estes quatro genes mostraram relativa sincronia durante o desenvolvimento

em zangões, o mesmo não ocorreu em operárias. Além disso, em operárias sol é muito mais

expresso na pré-pupa do que em zangões. Ambos os sexo mostraram padrões muito similares

de expressão de elav, exceto por um atraso em zangões. Em contraste, a expressão de egfr

ocorre antes em zangões. Durante a phase chave no desenvolvimento do sistema visual, uma

análise global do transcriptoma, por meio de micro-arranjos mostrou vários genes relaciona-

dos com ciclo celular entre os diferencialmente expressos. Em conclusão, a relação entre tem-

po e eventos morfológicos com os padrões de expressão gênica revelou diferenças possivel-

mente relacionadas com mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema visual alta-

mente dimorfico de Apis mellifera.

Palavras-chave: Apis mellifera, olho composto, lóbulo óptico, zangão, expressão gênica dife-

rencial.

Abstract

Marco Antonio, D. S. Molecular and celular processes during visual system development in

workers and drones of Apis mellifera.

Developmental mechanisms governing compound eye development in insects have been

broadly studied in Drosophila melanogaster, where the retina is formed from an imaginal disc

attached to the larval brain. However little is known about eye development in other insects,

most of which do not have such imaginal eye discs. Through a comparative histological and

gene expression analysis of eye development in the honey bee, Apis mellifera, we intended to

elucidate questions about developmental plasticity underlying the marked sex and caste-

specific differences in eye size, as well as to contribute to evo-devo aspects. Optic lobe devel-

opment occurs by neuroepithelial folding initiating from a differentiation center in the larval

brain. From this center, the medula, lamina and lobula arise at the same time in drones and

workers. Two steps mark the differentiation of the lamina (i) its origin from neuroblasts dif-

ferentiating in the outer layer of the medula, this coinciding with the first peak of roughest

expression during the feeding stage of the fifth larval instar, and (ii) 24 hours later, the ap-

pearance of hexagonal ommatidia, coinciding with a second peak in roughest expression. Up-

on including further candidate genes related to insect eye development [ small optic lobe (sol),

eyes absent (eya), minibrain (mnb), sine oculis (so), embryonic lethal, abnormal vision ( elav) and epidermal growth factor receptor ( egfr)] we found distinct expression peaks for sol, eya, mnb and so, with timing and relative transcript levels differing between drones and workers.

Whereas these four genes showed a relatively synchronous pattern of expression in drones in

the fifth larval instar, this was not so in workers. Furthermore, in prepupae sol was higher expressed in workers than the other three genes, and also in comparison to drones. Both sexes

showed a strikingly similar expression pattern for elav, except for some delay in drones. In

contrast, egfr expression was found to occur earlier in drones. Through a global transcriptom analysis, done at a key step of larval development, several genes were reveled as diffetentially

expressed, many of these regulating cell cycle steps. In conclusion, the relationship in the tim-

ing of morphological events with gene expression patterns revealed differences possibly relat-

ed to mechanisms underlying development of the highly dimorphic compound eye in the hon-

ey bee.

Key words: Apis mellifera, compound eye, optic lobe, drone, differential gene expression.

Sumário

Introdução ................................................................................................................................. 9

A abelha Apis mellifera ......................................................................................................... 9

Desenvolvimento e ciclo de vida ........................................................................................ 10

Determinação de castas ...................................................................................................... 11

O genoma de Apis mellifera ............................................................................................... 13

Genética do desenvolvimento do sistema visual .............................................................. 14

Desenvolvimento do sistema visual: Análise por PCR em tempo real........................... 15

Objetivos .................................................................................................................................. 17

Objetivos Específicos: ........................................................................................................ 17

Material e Métodos ................................................................................................................. 18

Abelhas ................................................................................................................................ 18

Produção e classificação de zangões ................................................................................. 18

Análise histológica .............................................................................................................. 22

Extração de RNA do lóbulo óptico e cérebro ................................................................... 22

Síntese da primeira fita de cDNA ...................................................................................... 23

Métodos computacionais .................................................................................................... 24

Sistema operacional, linguagens de programação e programas ....................................... 24

Base de dados de sequencias gênicas ............................................................................... 25

Construção da tabela de proteínas associadas ao termo Gene Ontology “Eye

Development” ................................................................................................................... 25

Busca da região promotora de genes associados ao termo“Eye Development” GO ........ 25

Análise in sílico dos genes candidatos ............................................................................. 26

Anotação dos genes candidatos e desenho de primers ..................................................... 26

Normalização dos perfis de cDNA ................................................................................... 27

Reação em cadeia da polimerase (PCR semi-quantitativo) ............................................ 28

PCR quantitativa (Real Time – PCR) .............................................................................. 28

Extração e preparo de RNA para micro-arranjos .......................................................... 29

Síntese de aRNA (Amino Allyl RNA) ............................................................................... 30

Integridade do RNA para microArray ............................................................................. 32

Preparo e hibridação das lâminas de microArray .......................................................... 32

Análise Estatística de dados do MicroArray. ................................................................... 33

Resultados ............................................................................................................................... 34

Análise do desenvolvimento através de cortes seriais. .................................................... 34

Perfil de transcrição de genes candidatos para o desenvolvimento diferencial do

lóbulo óptico ........................................................................................................................ 41

Perfil transcricional de genes chaves no desenvolvimento ............................................. 46

Predição de genes participantes do desenvolvimento dos lóbulos ópticos e retina ....... 49

Análise da expressão diferencial do genoma de Apis mellifera por meio de micro-

arranjos ............................................................................................................................... 50

Análise de Enriquecimento de dados do microarray ...................................................... 53

Análise computacional das regiões reguladoras dos genes diferencialmente

expressos .............................................................................................................................. 60

Discussão ................................................................................................................................. 64

O centro de diferenciação .................................................................................................. 65

A lóbula e a medula ............................................................................................................ 66

A lâmina e a retina ............................................................................................................. 67

Aspectos moleculares durante a fase de tecelagem de casulo ......................................... 70

Conclusões ............................................................................................................................... 72

Referências bibliográficas ...................................................................................................... 73

Anexos ...................................................................................................................................... 80

Introdução | 9

Introdução

A abelha Apis mellifera

Sociedades avançadas de insetos são caracterizadas pela sobreposição de gerações,

onde descendentes (membros da casta operária) permanecem no ninho e contribuem para o

sucesso reprodutivo de seus parentes (casta reprodutiva) ao custo de sua própria reprodução

(Winston, 1987). O parente materno (rainha) é altamente adaptado para produção e postura de

ovos. A rainha é, usualmente, maior e possui sobrevida de até dois anos enquanto as outras

castas vivem bem menos.

Apis mellifera possui uma combinação de características e cooperação social de forma

raramente vista no reino animal. É uma vasta fonte de estudos devido aos vários níveis de

adaptação que expressa enriquecido pelos benefícios econômicos que traz. A abelha melífera

tem sido objeto de estudo de diferentes perspectivas como as de: apicultores, biólogos, ecolo-

gistas, estudiosos de comportamento e médicos interessado em reações alérgicas, e todos con-

tribuíram imensamente para o entendimento da biologia deste inseto (Snodgrass, 1956).

Dentro do ninho pode-se ter uma idéia do porque este inseto tem fascinado o homem

durante tanto tempo. A infra-estrutura do ninho, primorosamente uniforme e funcional, é

composta por cera e própolis produzida pelas operárias e construída por série uniforme de cé-

lulas hexagonais. O favo serve de substrato para as mais diversas interações entre os mem-

bros, a cria, estocagem de alimento e centro de mensagem. Em relação às atividades da colô-

nia, ele provê rico cenário de interações sociais e divisão de trabalho tanto em relação às cas-

tas como em relação a cada indivíduo (Winston, 1987).

Abelhas melíferas possuem três tipos de membros na colônia: rainhas, operárias e

zangões, cada um com suas próprias especializações e lugar na sociedade das abelhas. Uma

única rainha na colônia reina sobre o ninho, cercada de operárias do qual ela recebe rica ali-

mentação necessária para desenvolver suas atividades. Seu corpo alongado esconde um ovário

superdesenvolvido o qual a transforma em extraordinária maquina de oviposição, capaz de

botar milhares de ovos em um só dia. O comportamento calmo da rainha contrasta com seus

poderosos feromônios, sinais químicos que agem nas operárias e controlam alguns dos seus

comportamentos e provê parte das características sociais das abelhas (Winston, 1987).

Outro membro desta sociedade são os zangões, zelados e alimentados pelas operárias

apesar de possuírem apenas uma função: reprodução, na qual eles morrem logo em seguida.

Para tanto eles possuem uma maquinaria especialmente adaptada para isso: olhos grandes,

Introdução | 10

músculos de vôo desenvolvidos e forte ímpeto para o acasalamento (Winston, 1987). Rainhas

e zangões são vistos como funcionalmente equivalentes relativos à reprodução e são cogitados

a representarem os fenótipos evolutivamente antigos, enquanto o fenótipo operária seria visto

como morfotipo derivado de fêmea (Hartfelder et al. , 1998). A rainha acasala com vários ma-

chos durante o vôo, logo que ela se torna adulta, e estoca o esperma dos vários acasalamentos

em uma estrutura especializada, a espermateca, para o resto de sua vida (Page e Peng, 2001).

As operárias realizam diversas e incessantes tarefas no ninho chegando até morrer de-

vido à suas picadas em intrusos. Raramente se reproduzem e a qualquer tempo podem ser vis-

ta pelo favo provavelmente cuidando do alimento, limpando os restos do ninho, fechando cé-

lulas, amadurecendo ou estocando mel, organizando pólen para estocagem perto das crias,

alimentando ou cuidando da rainha, ou alguma outra das centenas de atividades que desempe-

nham (Michener, 1974).

Apis mellifera pertence a ordem Hymenoptera a qual inclui 100.000 espécies de abe-

lhas, vespas e formigas, muitos dos quais sociais. Dentro da clade de insetos holometábolos

(sofrem metamorfose) as abelhas divergiram de um ancestral das ordens Díptera e Lepidópte-

ra a cerca de 300 milhões de anos atrás. Dentro das abelhas sociais da clade Corbiculata, o

gênero Apis é uma linhagem que evoluiu na Eurásia tropical e migrou para norte e oeste, atin-

gindo a Europa no final do Pleistoceno a cerca de 10.000 anos atrás (Ruttner, 1988). A partir

de então, humanos ajudaram a espalhá-la pelo mundo por causa de sua habilidade de produzir

mel, cera e outros produtos apícolas de interesse.

Desenvolvimento e ciclo de vida

Os processos de crescimento e metamorfose em insetos holometábolos envolvem al-

gumas das mais complexas interações numa colônia de insetos sociais. Antes de emergir co-

mo adultas, as abelhas sofrem a transição através de três estágios: ovo, larva e pupa. O perío-

do embrionário dura cerca de três dias e no final o animal atinge o primeiro instar larval. O

estágio larval é caracterizado pela alimentação onde a abelha ganha grande quantidade de pe-

so e cresce em tamanho enquanto alimentada em célula de cria aberta. Durante esta fase, a

larva passa por cinco mudas e, em seguida, a célula é operculada pelas operárias. Neste mo-

mento a larva tece o casulo e posiciona-se com a cabeça voltada para o opérculo. Logo em

seguida a larva começa a esvaziar o conteúdo intestinal e inicia a metamorfose tornando-se

pré-pupa (Myser, 1954; Michelette e Soares, 1993; Winston, 1987). Nesta fase a cabeça larval

e os apêndices alongam-se. O tórax fica reduzido em diâmetro e a cutícula larval e pupal co-

meçam a separar-se e o espaço entre elas começa a ser preenchido com fluído da muda. Du-

Introdução | 11

rante a fase pupal ocorre a transformação total, no final da qual a cutícula passa por um proce-

so de pigmentação e diferenciação gradativa até o momento da eclosão.

Rainhas necessitam de cerca de 16 dias para se desenvolverem do ovo ao adulto, três dias

como ovo, seis dias como larva em alimentação (cinco instares) e sete dias como pré-pupa e pupa

(Page e Peng, 2001; Winston, 1987). Do quinto instar em diante a rainha se desenvolve mais rápi-

do por ter estágio pupal mais curto e emerge como adulto cinco dias mais cedo que as operárias

(Page e Peng, 2001; Winston, 1987). Os zangões se desenvolvem em 24 dias do ovo ao adulto e

geralmente vivem uma média de 21 a 32 dias, podendo variar de acordo com a estação. Em abe-

lhas africanizadas o período de desenvolvimento larval (células abertas) é de 4,2 dias em média.

Já em zangões o tempo é um pouco maior com cerca de 4 a 7 dias. Depois que a célula é fechada,

as fases de tecelagem de casulo e pré-pupal duram cerca de 3 a 5 dias em operárias, 3 a 4 em rai-

nhas e 4 a 6 dias em zangões. Durante o desenvolvimento pupal as operárias e zangões levam cer-

ca de 8 a 9 dias em operárias e zangões e 4 a 5 dias em rainhas (Winston, 1987)

Determinação de castas

A rainha bota ovos em células de zangão ou de operária; ovos não fertilizados se de-

senvolvem em zangões (haplóides) enquanto fêmeas (rainha ou operárias) são derivadas de

ovos fertilizados (diplóides) (Kerr, 1962). A determinação de castas nas fêmeas é baseada em

um sistema trofogênico, isto é, a qualidade e quantidade de alimento que uma larva do sexo

feminino recebe das operárias determina o seu desenvolvimento em rainha ou operária. Este

programa de alimentação diferencial resulta em uma resposta distinta do sistema endócrino

(Hartfelder e Engels, 1998) que tem como conseqüência o desenvolvimento casta-específico

dos órgãos, especialmente dos ovários (Schmidt-Capella e Hartfelder, 1998, 2002), e das es-

truturas externas.

A distinção entre as duas castas femininas é evidenciada pelas suas diferenças no cres-

cimento e tempo de desenvolvimento, duração de vida, morfologia, anatomia, fisiologia e

comportamento (Page e Peng, 2001; deWilde e Beetsma 1982). As duas castas femininas de-

senvolvem em células de tamanhos diferentes. As larvas de operárias se desenvolvem em cé-

lulas hexagonais sob condições restritas de espaço e alimento. Elas são alimentadas primari-

amente com alimento da cria produzido pelas glândulas hipofaríngea e mandibular das operá-

rias nutridoras, embora também são alimentadas com pequena quantidade de pólen nos pri-

meiros estágios. Larvas de rainha são alimentadas com dieta mais rica e em maior quantidade

em células grandes localizadas fora do ninho de cria (Rembold, 1976; de Wilde e Beetsma

1982; Snodgrass, 1956).

Introdução | 12

As larvas diplóides com menos de 3,5 dias são bipotentes, ou seja, elas podem se de-

senvolver tanto em rainha como em operária (Jay, 1964; Winston, 1987). Durante este tempo

crítico, as larvas que são alimentadas com excesso de secreções glandulares, a geléia real, ga-

nham peso e crescem rapidamente (cerca de 120 horas no estágio larval são 60% mais pesa-

das) (Weaver, 1966) e se desenvolvem em rainhas. As larvas que são alimentadas com uma

mistura de secreções glandulares, pólen e mel (Peng e Jay, 1979) mostram uma taxa de cres-

cimento menor, pesam menos e se desenvolvem em operárias.

A formação de castas em abelhas melíferas ocorre em uma seqüência ordenada de passos.

O primeiro é a diferença na alimentação oferecida à larva (Weaver, 1955; Peng e Jay, 1979;

Rembold 1976). O segundo passo coincide com a troca de alimentação depois do terceiro instar

larval, a maturação casta-específica do sistema neuroendócrino (Ulrich e Rembold, 1983). O ter-

ceiro passo é a diferença de tempo na estimulação neuroendócrina que é reflexo da modulação de

“pools” hormonais durante o desenvolvimento de ambas castas femininas.

A modulação dos pools hormonais ocorre devido às diferenças nutricionais experi-

mentadas pelas fêmeas durante o início do desenvolvimento pós-embrionário. Esta modulação

diferencial se expressa por elevados títulos de hormônio juvenil (HJ), principalmente, em lar-

vas de rainhas quando comparadas com de operárias (Hartfelder e Engels, 1998). Associado

com neurohormônios e proteínas receptoras, o HJ regula a transcrição de genes alvos o que

resulta em respostas coordenadas tecido-específicas levando a diferenças morfológicas, fisio-

lógicas e comportamentais (Evans e Wheeler, 2000; Cristino et al, 2006; Barchuk et al, 2007).

Muitos dos genes diferencialmente expressos na modulação pelo HJ estão relacionados a ta-

xas metabólicas e respostas celulares a hormônios (Evans e Wheeler, 2000).

Pouco se sabe sobre a nutrição das larvas de zangões, embora parece que há algumas

diferenças na composição do alimento dado a eles. Zangões recebem mais alimento do que as

operárias, o que resulta no seu maior tamanho, e seu alimento tem mais proteínas do que o da

operária (Gontarski, 1954). O alimento dado às larvas mais velhas de zangões contém mais

carboidrato, riboflavina, ácido fólico, alguns aminoácidos e vitaminas a mais do que o alimen-

to dado a larvas mais jovens.

Além do sistema reprodutivo, uma das grandes diferenças entre os sexos reside no ta-

manho dos olhos compostos. Entretanto, embora as diferenças morfológicas externas do olho

estão bem caracterizadas entre os sexos (Ribi, 1989), pouco se sabe sobre o desenvolvimento

das estruturas internas que compõem o sistema visual tanto em operárias como em zangões.

Da mesma forma pouco se conhece sobre genética molecular responsável pelo desenvolvi-

mento diferencial do olho e lóbulo óptico entre os sexos.

Introdução | 13

O genoma de Apis mellifera

Em maio de 2002 Apis mellifera foi incorporada na lista de prioridades do The Natio-

nal Human Genome Research Institute (NHGRI) e começou a ter seu genoma sequenciado.

Em outubro de 2006 foi publicado a versão 4 do genoma de A. mellifera e desde então tem

permitido estudos aprofundados sobre a genética e biologia molecular desse fascinante inseto

eussocial. O projeto genoma permitiu a busca e análise de dados moleculares e a comparação

destes dados com diversas outras espécies através de diversas ferramentas de análise em

bioinformática. Com isso abriram-se as portas para diferentes estudos que nos permitem co-

nhecer sobre os processos de formação e desenvolvimento dos seres vivos, assim como, as

transformações genéticas ocasionadas pelo ambiente, as quais guiam a evolução das espécies.

O genoma de Apis mellifera possui características singulares e provê um fascinante “in-

sight” sobre a biologia da abelha. O genoma é distinto de outros insetos por possuir alto conteúdo

A + T e CpG e ausência da maior parte das famílias de transposons. Possui maior similaridade

com o genoma de vertebrados do que Drosophila e Anopheles para genes envolvidos em ritmo circadiano, RNA de interferência (RNAi) e metilação de DNA. Além disso, possui mais genes

para receptores de odores e genes novos para utilização de néctar e pólen apesar de ter menos ge-

nes do que Drosophila e Anopheles para imunidade inata, enzimas de detoxificação, proteínas de formação da cutícula e receptores gustativos. Possui genes que codificam uma família de proteí-

nas da geléia real exemplificando genes que ganharam funções durante evolução da sociabilidade,

a partir do gene yellow-d. No genoma de abelha foram detectados novos microRNAs que mostra-

ram expressão casta- e estágio-específico o que sugere um papel na diversificação social (The

Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006).

A determinação dos três fenótipos inicia na fase embrionária com a cascata de expres-

são gênica ligada à determinação de sexo. A rainha põe ovos nos alvéolos dos favos e estes

ovos, quando fertilizados, originam fêmeas e quando não fertilizados geram zangões por par-

tenogênese arrenótoca. A abelha melífera mostra similaridades genômicas com Drosophila

para a determinação sexual, porém com diferenças significativas no processo. Machos rece-

bem aleatoriamente metade do genoma materno sobre um modo de reprodução haplodiplóide.

Neste caso o sexo não é determinado por cromossomos sexuais, mas por composição alélica

de um lócus chamado de “complementary sex determiner” ( csd) (Beye et al, 2003). Acredita-se que o gene csd seja o funcional equivalente do gene tra de Drosophila o qual controla diferenciação sexual somática.

O gene csd ocupa a posição de entrada na cascata gênica de determinação de sexo que in-

fluencia sobre splicing alternativo do gene doublesex (dsx) anotado no genoma de Apis mellifera, Introdução | 14

e c por sua vez regulam o padrão de expressão de genes estruturais ligados a processos de diferen-

ciação sexo-específico durante as fases larvais e na metamorfose. Ortólogos de dsx e ix são encontrados no genoma de abelhas melíferas. O dsx passa por splicing sexo-específico o que é consis-tente com a função conservada de determinação sexual, tanto em moscas quanto em abelhas melí-

feras. Deste ponto em diante as trajetórias de ambos funcionalmente convergem a partir do gene

dsx (The Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006).

Recentemente, novas informações ligaram diretamente a via de determinação sexual

com o desenvolvimento do olho. O knockdown do gene fem (upstream ao csd no mesmo lócus de determinação sexual) em operarias ocasiona o desenvolvimento de olhos grandes típicos de

machos (Hasselmann, 2008). Aliado ao fato de macho e fêmea possuírem o mesmo genótipo

faz com que surja uma intrigante questão: quais são os mecanismos genéticos responsáveis

pelo maior desenvolvimento do olho em machos? Com isso o estudo do desenvolvimento dos

olhos e lóbulos ópticos (sistema visual) torna-se de grande importância não somente para os

processos de desenvolvimento mas também aos mecanismos de determinação sexual. Com

isso estamos realizando estudos em operárias e zangões em fases chave do desenvolvimento

desta notável estrutura sensorial.

Genética do desenvolvimento do sistema visual

A formação do primórdio dos olhos em Drosophila começa no segundo instar larval a

partir de um disco imaginal. Durante esse processo vários fatores de transcrição ligados na

cascata genética realizam papéis críticos e são codificados pelos genes: eyeless (ey), sine ocu-

lis (so), eyes absent (eya) e dachshund (dac). Em resposta à sinalização do fator Decapenta-

plégico (Dpp) Ey induz a expressão de eya. Isso é logo seguido pela indução de SO e em se-

guida Dac. A co-expressão de Ey, Eya, SO e Dac estabelece um pool de células progenitoras

do olho dentro do epitélio. No inicio do terceiro estágio larval inicia-se o desenvolvimento de

um arranjo de neurônios fotorreceptores sinalizados por Dpp e Hedgehog (Hh) (Kenyon et al,

2005; Huang, 1996). Ainda nesta fase uma onda morfogenética atravessa o disco imaginal

postero-anteriormente deixando clusteres de neurônios em diferenciação. Esta onda é marcada

por um sulco morfogenético onde as células dentro e ao redor expressam Dpp. À frente do

sulco as células entram no estágio pré-proneural marcado pela expressão do fator de transcri-

ção Hairy (H). Logo em seguida ocorre a expressão do gene atonal induzindo a diferenciação

de neurônios fotorreceptores (Jarman et al, 1994). O gene atonal marca o início da neurogê-

nese e mais tarde ele se torna restrito ao receptor R8 em cada omatídio (Kenyon e t al, 2005).

Introdução | 15

Posteriormente ao sulco morfogenético os neurônios em desenvolvimento podem ser visuali-

zados pela expressão do marcador pan-neural ELAV.

No presente projeto utilizamos genes chaves a fim de determinar o início do desenvol-

vimento e diferenciação do lóbulo óptico e retina em zangões e operárias de Apis mellifera.

Concomitante a estes marcadores genéticos foi utilizada informação sobre a diferenciação

morfológica/histológica que ajudou a determinar o melhor momento para analisar os genes

envolvidos no desenvolvimento do sistema visual. A partir do ponto onde se inicia a diferen-

ciação neuronal foi realizado um estudo da expressão diferencial

Desenvolvimento do sistema visual: Análise por PCR em tempo real

Uma segunda abordagem que utilizada no presente projeto incluiu a análise de trans-

critos por qRT-PCR de genes conhecidos que possuem importante papel no desenvolvimento

do sistema visual de Drosophila. Tais genes são: sine oculis, eyes absent, minibrain, small

optic lobes e roughest. Durante o processo de formação do primórdio do olho, o gene s ine oculis ( so) é expresso nas células progenitoras do olho e possui papel fundamental na inicia-

ção e progressão do sulco morfogenético e diferenciação neural. Sua expressão também se

mantém durante o desenvolvimento do epitélio neural no terceiro instar larval (Kenyon et al,

2005). Experimentos mostraram que a perda gradual da função de so resulta na progressiva

redução do tamanho do olho até a sua perda completa em adultos. A redução no tamanho

ocorreu devido à redução do desenvolvimento neuronal durante o terceiro instar larval. A re-

dução da neurogênese é precedida e acompanhada pela expressão reduzida de dpp e pelos fa-

tores de especificação do olho Eya e Dac (Kenyon et al, 2005). Sine oculis atua em conjunto

com a proteína Eyes absent, um fator de transcrição nuclear os quais se interagem durante a

formação do olho em Drosophila (Ohto, 1999). A proteína Eyes absent é membros de uma

rede regulatória com participação no desenvolvimento do olho, músculo, rins e ouvidos. Mu-

tações neste gene estão associadas com desordens congênitas (síndrome bronchio-oto-renal)

incluindo doenças em vários órgãos (Desplan, 1997).

Mutações do gene small optic lobes ( sol) produz defeitos específicos no sistema ner-

voso adulto como resultado da neurodegeneração. Em Drosophila, neurodegeneração ocasio-

nada por esse mutante leva à redução de aproximadamente 50% do número de células das

neurópilas (medula, lóbula e placa da lóbula) (Delaney et al, 1991). Entre os neurônios fal-

tando no olho adulto estão certas classes de neurônios transmedulares que projetam para a ló-

bula e placa da lóbula. Porém, não é afetado o número de colunas na medula mutante, assim

como, lâmina e cérebro central. As alterações de comportamento relacionadas com esse tipo

Introdução | 16

de mutação envolvem respostas de aterrizagem e discriminação de superfície. Em Drosophila

a análise da seqüência predita de aminoácidos do Sol mostrou semelhança com dedos de zin-

co encontrado em receptores de hormônios esteróides e proteínas ligantes de DNA. Também

há similaridade com motivos ricos em cisteína do domínio da proteína quinase C. Na parte

carboxila terminal da proteína há um segundo domínio similar à proteases neutras ativadas

por cálcio (calpaínas) de subunidades de humanos e outros vertebrados (Melloni et al, 1989).

Moscas mutantes para o gene minibrain ( mnb) são caracterizadas por específica redu-

ção do volume dos lóbulos ópticos e cérebro central em adultos. De modo geral, mudanças na

arquitetura neuronal não são aparentes. Desta forma o lócus mnb parece realizar papel essen-

cial na regulação do número de distintos tipos de células neuronais e, portanto, na regulação

do tamanho final. Externamente o número de facetas e de fotorreceptores é normal em Dro-

sophil a e, portanto, sua aparência externa é indistinguível em relação ao tipo selvagem. Desde que os lóbulos ópticos do cérebro adulto são derivados de neuroblastos, este gene mostra-se

excelente candidato para o estudo do desenvolvimento dos lóbulos ópticos (Tejedor et al,

1995).

O loco roughest-irregular chiasm C ( rst-irreC) é um importante componente do

sistema de sinalização durante o desenvolvimento do olho . A proteína codificada é necessária

para a projeção correta das fibras visuais no quiasma óptico do gânglio óptico em Drosophila

e correta organização e diferenciação omatidial (Boschert et al, 1990; Wolff e Ready, 1991;

Ramos et al, 1993; Schneider et al, 1995; Reiter et al, 1996). A expressão desta proteína é essencial para o alinhamento das células interomatidiais, que antecede a onda de apoptose no

início da vida pupal. A perda desta função rst-irreC acarreta em quase total falha do programa de morte celular em remover células supérfluas que desorganizam a retina, as quais se

diferenciam em células pigmentares dando ao olho uma aparência de “rugoso” (Wolff e

Ready, 1991). Portanto, alelos mutantes do lócus roughest afetam o sistema visual, tanto na

formação do olho composto como no desenvolvimento do lobo óptico (Boschert et al, 1990;

Ramos et al., 1993; Reiter et al, 1996; Araújo et al, 2003). Este gene mostra-se um importante marcador do desenvolvimento dos lóbulos ópticos visto que em zangões há praticamente o

dobro de facetas (Ribi, 1989) comparado com operárias.

Para o estudo do desenvolvimento do sistema visual em Apis melífera foi feita a com-

paração com genes já conhecidos em Drosophila e, também, o estudo da expressão diferenci-

al durante fase critica do desenvolvimento. Ambas abordagens são necessárias para o enten-

dimento dos complexos mecanismos genéticos fundamentais para os processos altamente re-

gulados que ocorrem durante o desenvolvimento do sistema visual em Apis melífera.

Objetivos | 17

Objetivos

O objetivo geral do presente projeto é a busca de genes diferencialmente expressos no

lóbulo óptico e olho envolvidos na plasticidade fenotípica observada entre machos e fêmeas

de Apis mellifera.

Objetivos Específicos:

• Determinação do inicio do desenvolvimento e neurogênese.

• Análise da expressão gênica por microArrays em fase especifica.

• Anotação dos genes diferencialmente expressos obtidos com auxílio de ferramentas de

bioinformática.

• Análise por qRT-PCR de transcritos dos genes diferencialmente expressos durante o

desenvolvimento pós-embrionário de operárias e zangões.

Material e Métodos | 18

Material e Métodos

Abelhas

No presente trabalho utilizamos abelhas operárias e zangões da espécie Apis mellifera

de diferentes estágios do desenvolvimento obtidas por métodos convencionais de apicultura

no Apiário Experimental do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo (USP).

As larvas de diferentes fases de desenvolvimento pós-embrionário (L3, L4, L5F1, L5F2,

L5F3, L5S1, L5S2, L5S3, PP1, PP2, PP3foram coletadas de diferentes favos. As larvas de

operárias foram classificadas baseando-se no seu peso, tamanho da cápsula cefálica e

morfologia (Michelette e Soares, 1993; Myser, 1954; Nelson, 1924; Winston, 1987). Como

critério de seleção para a fase de tecelagem de casulo (Spinning S) observou-se a gradual

esvaziamento do conteúdo intestinal em larvas em células recentemente operculadas. Para a

pré-pupa observou-se a segmentação da cabeça e tórax, o alargamento dos olhos, o progresso

da apólise, a visualização do intestino e a reabsorção do líquido exuvial (Tabela 2). Após o

reconhecimento da fase as larvas e pupas foram imediatamente dissecadas e/ou fixadas.

Produção e classificação de zangões

Devido ao grande gasto energético social, os machos de Apis mellifera são produzidos

principalmente durante a primavera quando há grande disponibilidade de pólen e néctar. Em

períodos de escassez de alimentos é necessário suplementação proteica e energética para uma

produção contínua de larvas de zangões. Contudo, a produção machos não é estável e pode variar

durante a estação e entre colméias. Para resolver este problema suplementamos a carga de

proteína na colméia utilizando uma pasta de pólen preparada da seguinte forma: pólen comercial

foi macerado e adicionado xarope de açúcar 50% e mexido vigorosamente até obter uma pasta. A

pasta foi aplicada no alto dos favos ou na entrada da colméia (cerca de 100 gramas por aplicação),

3 vezes por semana durante um período de 2 semanas. Neste mesmo período foram adicionados

1,5 litros de xarope de açúcar 2 vezes por semana. Durante todo o processo a colméia foi

inspecionada para evitar excesso de crias e de realeiras para evitar o enxameamento. O tratamento

foi interrompido por até 10 dias toda vez que a colméia apresentasse sinais de enxameamento ou

de super-produção de crias, podendo ser retomado subsequentemente. Se nenhuma das situações

anteriores ocorresse, a colméia estava pronta para a postura controlada de zangões em favo

especialmente preparado (Figura 1). Para utilização do favo para a postura, o mesmo foi deixado

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Material e Métodos | 19

em caixa vazia e aberta no apiário experimental do Departamento de Genética, Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para que houvesse saque de pólen e mel

por outras abelhas até que o quadro ficasse totalmente limpo. A postura controlada de zangões

consistiu em prender a rainha com tela eespecial por 24 horas sob quadro preparado sob as células

de zangões. Cerca de 3 dias antes da postura controlada qualquer suplementação alimentar foi

interrompida para evitar estoque de alimento em células de zangões.

Figura 1: Favo de colméia de Apis mellifera contendo células de zangões (a direita) e células de operárias (a esquerda). Linha branca marca a divisória do favo mostrando a diferença de tamanho das células. Seta branca aponta uma célula preenchida com pólen.

Para a correta classificação dos estágios iniciais de zangões realizamos posturas

controladas com favos de zangões em diferentes caixas. Na postura controlada prende-se uma

rainha no favo utilizando-se uma gaiola e, portanto, forçando-a a ovipositar naquela região,

permitindo que operárias possam livremente transitar e cuidar das crias e da rainha. Com isso

é possível obter indivíduos com idadee muito próxima. Ao final de 3 dias de desenvolvimento

as larvas eclodem e atingem o primeiro instar larval. Realizamos coletas no 4º, 5º, 6º e 7º dia

após a postura controlada, afim de medir o diâmetro da capsula cefálica da larva. Definimos

como 4º dia sendo L1, 5º dia sendo L2, 6º dia L3 e 7º dia L4 (Figura 1).

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Material e Métodos | 20

Colocamos larvas de zangão em régua de precisão (Leica) sob lupa Leica onde tirou-se

fotos para posterior análise. Em cada fotto foi possível utilizar a régua como padrão para definição

de medida utilizando-se o software Adobe Photoshop CS5. Os dados foram analisados em

software R (versão 2.13.2 para Mac) (Figura 2). Utilizamos ANOVA com modelo linear seguido

de teste pós-hoc Tukey para testar a hipótese nula entre os grupos. Verificamos que os quatro

grupos diferem entre si (pe = 2,2e-16, Tabela 1) e, portanto, rejeitamos a hipótese nula de que as

médias do diâmetro da capsula cefálica não diferem entre si. Pelo teste póós-hoc de Tukey através

de observou-se que todos os grupos diferem entre si (Tabela 1).

O quinto instar larval corresponde a um período de intensa alimentação e, portanto,

crescimento. Para melhor definir esta fase em zangões, coletamos indivíduos em fase

adiantada de operculação e indivíduos que acabaram de entrar no quinto instar. Com isso

pudemos subdividir o quinto instar em três subfases descritas na Tabella 2. Com esta análise

fomos capazes de traçar um padrão do desenvolvimento de zangões nos possibilitando

determinar o tempo de desenvolvimento de cada fase larval para futuros experimentos.

Figura 2. Diâmetro da cápsula cefálica de zangões de Apis mellifera, coletados no 4º dia (L1, n=5), 5º dia (L2, n=5), 6º dia (L3, n=6) e 7º dia (L4, n=7) após a postura controlada. As larvas foram fotografadas e analisadas no software Photoshop CS5. As medidas foram realizadas utilizando-se como padrão a régua de precisão em lupa Leica. Cada cápsula cefálica foi medida transversalmente (latero-lateral) traçando-se uma linha reta entre os pontoos mais distantes da capsula cefálica. O gráfico foi plotado utilizando-se o pacote

e estatístico R versão 2.13.2

para Mac.

Material e Métodos | 21

Tabela 1. Sumário estatístico dos grupos L1 a L4 e teste pós-hoc de Tukey. Estão representados as análises box-whiskers por quadrante de cada fase. A tabela também mostra os resultados do teste pós-hoc de Tukey realizado após tratamento linear com ANOVA. Pode-se verificar que os valores p entre as diferentes fases

comparativamente são significativos.

L1 L2 L3 L4

Tukey

p

adj

Max

278 391 691 1163

L1-L2

0,0050337

3º Qu.

263 387 667,5

1078

L1-L3

0,0000000

Média

255,6 365,2 634,2 1054 L1-L4

0,0000000

Mediana

252 362 640,2