Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 em... por Luciana Juncioni de Arauz - Versão HTML

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia de Fermentações

Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator

Luciana Juncioni de Arauz

Tese para a obtenção do grau de

DOUTOR

Orientadora:

Profa. Dra. Thereza Christina Vessoni Penna

São Paulo

2011

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia de Fermentações

Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator

Luciana Juncioni de Arauz

Tese para a obtenção do grau de

DOUTOR

Orientadora:

Profa. Dra. Thereza Christina Vessoni Penna

São Paulo

2011

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Luciana Juncioni de Arauz

Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator

Comissão Julgadora

da

Tese para obtenção do grau de Doutor

Profa. Dra. Thereza Christina Vessoni Penna

orientadora/presidente

Profa. Dra. Júlia Baruque Ramos

1o. examinador

Dr. Wagner Quintilio

2o. examinador

Profa. Dra. Susana Marta Isay Saad

3o. examinador

Prof. Dr. Pedro de Alcântara Pessôa Filho

4o. examinador

São Paulo, 17 de março de 2011.

Aos meus pais, Inez e Aramis, pelo incentivo,

apoio e compreensão, em todos os momentos

desta e de outras caminhadas.

AGRADECIMENTOS

A Profa. Titular Dra. Thereza Christina Vessoni Penna, pela dedicada orientação, confiança e permanente incentivo.

A Rosilene de Almeida Casartelli, Diretora Técnica da Divisão de Serviços Básicos do Instituto Adolfo Lutz, pela compreensão e oportunidade para o desenvolvimento deste trabalho.

A Profa. Dra. Júlia Baruque Ramos pelos ensinamentos, disponibilidade e pelas valiosas contribuições para a elaboração deste trabalho.

A Profa. Dra. Priscila Gava Mazzola pelo convívio agradável, colaboração e sugestões que melhoraram o desenvolvimento deste projeto.

A Dra. Angela Faustino Jozala, pela amizade e por todas as sugestões que valorizaram este trabalho.

Aos colegas do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, pelo convívio e amizade.

A equipe do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, Irene, Elza, Gledson, Juarez, Miriam e Ricardo e também aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação, Jorge e Elaine, pelos auxílios prestados.

A todos os professores, funcionários e estagiários da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas/USP, que de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

A FAPESP, CAPES e CNPq pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.

i

RESUMO

ARAUZ, L. J. Produção de nisina em leite desnatado diluído por Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator. 2011. 148 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

Nisina é um peptídeo antimicrobiano natural produzido por Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 durante a fase exponencial de crescimento. A bacteriocina é usada como

conservante natural de alimentos, uma vez que mostra atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e esporos. Tem potencial aplicação em inúmeros campos

(farmacêutico, veterinário e cosméticos). O objetivo deste trabalho foi estudar a cinética de crescimento bacteriano e a produção de nisina em biorreator, utilizando leite desnatado diluído, como um meio de cultura a baixo custo. Também foram avaliados os consumos de açúcar e proteína, formação de ácido lático e adsorção de nisina nas células produtoras durante os processos de produção de nisina. Pré-cultivos com 107 UFC.mL-1 de

Lactococcus lactis foram cultivados em biorreator de 2 L contendo 25% de leite desnatado diluído em água (1,5 L, pH 6,7). Os ensaios foram desenvolvidos a 30oC por 52 horas, variando a agitação e aeração: (i) 200 rpm (0,0, 0,5, 1,0 e 2,0 L.min-1) e (ii) 100 rpm (0,0 e 0,5 L.min-1). A atividade de nisina foi avaliada pelo método de difusão em ágar, utilizando

Lactobacillus sakei ATCC 15521 como microrganismo sensível à ação de nisina. A melhor concentração de nisina (62,68 mg.L-1 ou 2511,89 AU.mL-1), foi obtida em 16 horas, 200 rpm e sem aeração (kLa = 5,29 x 10-3 h-1). A adsorção de nisina nas células produtoras foram baixas (6,8 - 15,1%), quando comparadas com a atividade do sobrenadante. Estes

resultados mostraram que o meio de cultivo composto por leite desnatado diluído favoreceu o crescimento celular e produção associada ao crescimento da nisina. Foram realizados estudos preliminares de liofilização (bioconservação) e purificação por cromatografia da nisina produzida em biorreator. A liofilização apresentou perda da atividade de nisina (24,8%), enquanto a purificação por cromatografia de interação hidrofóbica com resina Butyl-Sepharose, recuperou 40% da atividade da biomolécula, mostrando que ambos os

processos poderão ser aplicados à bacteriocina.

Palavras-chaves: Lantibiótico. Antimicrobiano. Bacteriocina. Conservante de alimentos.

Bactéria ácido láctica.

ii

ABSTRACT

ARAUZ, L.J. Nisin production in diluted skimmed milk utilizing Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 in bioreactor. 2011. 148 f (Tese Doutorado)– Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

Nisin is a natural antimicrobial peptide produced by Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC

11454 during its exponential growth phase. The bacteriocin is used as natural food

preservative due to its antimicrobial activity against Gram-positive bacteria and outgrowth of spores. This property allows its application in numerous fields (pharmaceutical, veterinary and cosmetic). The aim of this work was to study the bacterial growth kinetics of L. lactis and respective nisin production in bioreactor, using diluted skimmed milk as an inexpensive medium. During the production, the consumption of sugar and protein, lactic acid formation and nisin adsorption on the producer strain cells were evaluated. Pre-cultivation with 107

UFC.mL-1 of L. lactis were expanded in a 2 L bioreactor containing 25% diluted skimmed milk in water (1.5 L, pH 6.7). The assays were performed at 30oC for 52 hours, varying agitation and airflow rate: (i) 200 rpm (0.0, 0.5, 1.0 and 2.0 L.min-1) and (ii) 100 rpm (0.0, 0.5

L.min-1). Nisin activity was evaluated through diffusion assays using Lactobacillus sakei ATCC 15521 as sensitive strain. The best nisin concentration (62.68 mg.L-1 or 2511.89

AU.mL-1), was achieved at 16 hours, 200 rpm and with no airflow rate (kLa = 5.29 x 10-3 h-1).

The quantity of nisin adsorbed by the producer cells were low (6.8 -15.1%) when compared to the quantity released in the supernatant. These results showed that diluted skimmed milk supported cell growth and growth-associated nisin. Preliminary assays of lyophilization (biopreservation) and purification by chromatography of nisin produced in bioreactor were performed. Lyophilization presented a loss of nisin activity (24.8%) while purification by hydrophobic interaction chromatography with Butyl-Sepharose column recovered 40% of the activity, showing that both processes can be applied to the bacteriocin.

Keywords: Lantibiotic. Antimicrobial. Bacteriocin. Food preservative. Lactic acid bacteria.

iii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 2.1 - Esquema geral da fermentação da glicose pelas bactérias ácido lácticas.................................................................................................................................. 06

Figura 2.2 - Representação esquemática da estrutura primária de nisina A, produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454. Ala-S-Ala representa lantionina, Abu-S-Ala β-metil-lantionina, Dha dehidroalanina e Dhb dehidrobutirina.................................... 09

Figura 2.3 - Mecanismo de ação de bacteriocinas das classes I (nisina) e classe IIa (pediocina) em bactérias Gram-positivas............................................................................. 12

Figura 4.1 - Vista superior do biorreator New Brunswick Scientific Bioflo 110.................... 29

Figura 4.2 - Vista lateral do biorreator New Brunswick Scientific Bioflo 110....................... 30

Figura 4.3 - Curva padrão relacionando as concentrações da atividade de nisina comercial com o diâmetro da área de inibição (zonas sem crescimento de L. sakei), obtida usando o método de difusão em ágar, por meio de diluições de nisina em HCl

0,02 N. Equação log (AU.mL-1) = 0,2408.(Halo)-0,8745 e R2 = 0,9806............................... 37

Figura 4.4 - Estruturas da lactose, galactose e glicose....................................................... 39

Figura 5.1 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais do ensaio 1..............................................................................

44

Figura 5.2 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais dos ensaios 2 e 3........................................................................

46

Figura 5.3 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais dos ensaios 4, 5 e 6....................................................................

49

Figura 5.4 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais do ensaio 7.................................................................................. 50

Figura 5.5 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (Log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais do ensaio 8.................................................................................. 51

Figura 5.6 - Curvas de viabilidade celular (log UFC.mL-1) e atividade de nisina (log AU.mL-1), com resultados experimentais e suavizados e curvas de pH e ácido lático

(mg.mL-1) experimentais do ensaio 9.................................................................................. 52

Figura 5.7 – Curvas de atividade de nisina (log AU.mL-1) extraída das células por solução ácida ....................................................................................................................... 56

iv

Figura 5.8 - Perfil cromatográfico da eluição de nisina em coluna de Butyl-

Sepharose® por CIH, contendo solução tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5,3

em gradiente salino de (NH

4)2SO4 2 M, 1,5 M, 1 M e solução tampão. (-◆-)

Absorbância, (

59

•••••••) Gradiente salino e (--■-- ) Atividade de nisina (AU.mL-1).................

Figura 6.1 - Correlações entre kLa e aeração. Os processos de aeração foram

respectivamente: 200 rpm (y) (equação = - 7,2103.(aeração)2 + 16,6198.(aeração); e R2

= 0,9905) e 100 rpm (x) (equação kLa = 7,2200.(aeração): R2 =1)...................................... 70

Figura 9.2.1 – Curvas de log UFC.mL-1 versus log AU.mL-1, com as linhas de tendência, equação e coeficiente de correlação.................................................................................... 100

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Principais características que diferenciam bacteriocinas de

antibióticos....................................................................................................................... 14

Tabela 4.1- Composição do meio de cultivo Caldo MRS................................................ 27

Tabela 4.2- Composição do meio de cultivo leite desnatado.......................................... 27

Tabela 5.1- Resumo dos ensaios realizados em biorreator............................................ 43

Tabela 5.2 - Resultados experimentais do ensaio 1 (100rpm e sem aeração) em

biorreator......................................................................................................................... 44

Tabela 5.3- Resultados experimentais do ensaio 2 (100 rpm e 0,5 L.min-1) em

biorreator......................................................................................................................... 45

Tabela 5.4 - Resultados experimentais do ensaio 3 (100 rpm e 0,5 L.min-1) em biorreator......................................................................................................................... 45

Tabela 5.5 - Resultados experimentais do ensaio 4 (200 rpm e sem aeração) em biorreator......................................................................................................................... 47

Tabela 5.6 - Resultados experimentais do ensaio 5 (200 rpm e sem aeração) em biorreator......................................................................................................................... 47

Tabela 5.7 - Resultados experimentais do ensaio 6 (200 rpm e sem aeração) em biorreator ........................................................................................................................ 48

Tabela 5.8 - Resultados experimentais do ensaio 7 (200 rpm e 0,5 L.min-1) em biorreator......................................................................................................................... 50

Tabela 5.9 - Resultados experimentais do ensaio 8 (200 rpm e 1 L.min-1) em

biorreator........................................................................................................................

51

Tabela 5.10 - Resultados experimentais do ensaio 9 (200 rpm e 2 L.min-1) em

biorreator......................................................................................................................... 52

Tabela 5.11 - Resultados experimentais dos ensaios 1, 2 e 3 da extração de nisina adsorvida das células produtoras.................................................................................... 53

Tabela 5.12 - Resultados experimentais dos ensaios 4, 5 e 6 da extração de nisina adsorvida das células produtoras.................................................................................... 54

Tabela 5.13 - Resultados experimentais dos ensaios 7, 8 e 9 da extração de nisina adsorvida das células produtoras.................................................................................... 55

Tabela 5.14- Resultados experimentais do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa).............................................................................................................. 57

Tabela 5.15- Resultados experimentais de nisina liofilizada reconstituída em 1 mL e vi

concentrada 10 vezes (100 µL) com água destilada e HCl, produzida em biorreator

(200 rpm/ sem aeração) por L. lactis em leite desnatado

diluído.............................................................................................................................. 58

Tabela 5.16- Purificação preliminar de nisina produzida por L. lactis em biorreator......................................................................................................................... 59

Tabela 6.1 - Resumo dos resultados experimentais obtidos nos cultivos

descontínuos................................................................................................................... 61

Tabela 6.2- Resumo da adsorção de nisina pelas células produtoras........................... 66

Tabela 9.1.1 – Resultados suavizados do ensaio 1 (100 rpm/sem aeração)................. 94

Tabela 9.1.2 – Resultados suavizados do ensaio 2 (100 rpm/0,5 L.min-1)..................... 94

Tabela 9.1.3 – Resultados suavizados do ensaio 3 (100 rpm/0,5 L.min-1)..................... 95

Tabela 9.1.4 – Resultados suavizados do ensaio 4 (200 rpm/sem aeração)................. 95

Tabela 9.1.5 – Resultados suavizados do ensaio 5 (200 rpm/sem aeração)................. 96

Tabela 9.1.6 – Resultados suavizados do ensaio 6 (200 rpm/sem aeração)................. 96

Tabela 9.1.7 – Resultados suavizados do ensaio 7 (200 rpm/0,5 L.min-1)..................... 97

Tabela 9.1.8 – Resultados suavizados do ensaio 8 (200 rpm/1 L.min-1)........................ 97

Tabela 9.1.9 – Resultados suavizados do ensaio 9 (200 rpm/2 L.min-1)........................ 98

Tabela 9.3.1 – Resultados suavizados dos ensaios 1, 2 e 3 da extração de nisina das células produtoras........................................................................................................... 102

Tabela 9.3.2 – Resultados suavizados dos ensaios 4, 5 e 6 da extração de nisina das células produtoras........................................................................................................... 103

Tabela 9.3.3 – Resultados suavizados dos ensaios 7, 8 e 9 da extração de nisina das células produtoras........................................................................................................... 104

Tabela 9.4.1 - Resultados da purificação preliminar de nisina em coluna de interação hidrofóbica....................................................................................................................... 106

vii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ADI – Acceptable Daily Intake

Adso. – Adsorção

ATCC – American Type Culture Collection

AU – Unidade Arbitrária (“Arbitrary Units”)

BAL – Bactérias Ácido Lácticas

BCA – Ácido Bicincôninico

BSA – Albumina de Soro Bovino

CIH – Cromatografia de Interação Hidrofóbica

DETEN – Departamento de Técnicas Normativas

DL50 – Dose Letal (concentração de uma substância administrada, capaz de inativar 50% da população em estudo)

DO – densidade óptica

FDA – Food and Drug Administration

FAO – Food and Agriculture Organization

GRAS – Generally Regarded As Safe

IU – Unidades Internacionais

L. lactisLactococcus lactis

LPS – Lipopolissacarídeo

L. sakeiLactobacillus sakei

MRS – Man Rogosa Sharp

Oxig. Dissol. – Oxigênio Dissolvido

rpm – rotação por minuto

SDS-PAGE – gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio

subsp., spp – subspécie

UAT – Ultra Alta Temperatura

UFC – Unidades Formadoras de Colônias

UHT - ultra high temperature

Viab. Celular – Viabilidade celular

WHO – World Health Organization

viii

LISTA DE NOMENCLATURAS

% - porcentagem

oC – graus Celsius

dt – intervalo de tempo (h)

dX – concentração celular formada em dt (UFC.mL-1)

g – grama

h – hora

HCl – ácido clorídrico

kDa – Kilodalton

Kg -Quilograma

kLa – coeficiente volumérico de transferência de massa

L – Litro

L.min-1 – Litro por minuto

M – Molar

min. - minuto

mg - miligrama

mL – Mililitro

mm – milímetro

(NH4)2SO4 – Sulfato de amônio

N – Normal

P máx nisina - concentração máxima de nisina (mg.L-1)

Prod.nisina - produtividade de nisina (mg.L-1.h-1)

Prodx - Produtividade celular (UFC.mL-1.h-1)

R2 – coeficiente de correlação

tf –tempo de início de fase estacionária correpondente a Xmax (h)

Xmáx – concentração celular máxima (UFC. mL-1)

X – concentração celular no meio de fermentação (UFC. mL-1)

YN/X – coeficiente angular da correlação entre atividade de nisina e concentração celular ((Log AU.mL-1)/(Log UFC.mL-1))

µL –microlitro

µm – micrômetro

µmáx – velocidade específica máxima de crescimento (h-1)

ix

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 01

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 03

2.1 Histórico................................................................................................................... 03

2.2 Características e classificação das bactérias ácido lácticas................................... 04

2.3 A bacteriocina nisina............................................................................................... 08

2.4 Mecanismo de ação antimicrobiana........................................................................ 10

2.5 Regulamentação Toxicológica................................................................................ 12

2.6 Distinção entre bacteriocinas e antibióticos............................................................ 13

2.7 Aplicações Industriais.............................................................................................. 14

2.7.1 Bioconservante de alimentos............................................................................... 14

2.7.2 Aplicações Clínicas.............................................................................................. 16

2.8 Produção de nisina em meios de cultura alternativos............................................. 18

2.9 Leite bovino............................................................................................................. 20

2.10 Liofilização para a conservação de nisina............................................................. 21

2.11 Cromatografia de Interação Hidrofóbica (CIH)...................................................... 22

3. OBJETIVOS.............................................................................................................. 25

3.1 Objetivo principal..................................................................................................... 25

3.2 Objetivos específicos............................................................................................... 25

4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 26

4.1 Microrganismos....................................................................................................... 26

4.2 Meios de cultivo....................................................................................................... 26

4.3 Preparo do inóculo para o biorreator....................................................................... 28

4.4 Descrição do biorreator........................................................................................... 28

4.4.1 Preparo do biorreator e do meio de cultivo.......................................................... 31

4.4.1.1 Condições dos cultivos...................................................................................... 31

4.4.2 Calibração do eletrodo de oxigênio dissolvido..................................................... 32

4.4.3 Determinação do kLa............................................................................................ 32

4.4.4 Calibração do eletrodo de pH............................................................................... 33

4.5 Amostragem............................................................................................................ 33

4.6 Metodologias Analíticas........................................................................................... 34

4.6.1 Viabilidade Celular (UFC.mL-1)............................................................................. 34

4.6.2 Dosagem de proteínas......................................................................................... 35

4.6.3 Determinação da acidez em ácido lático.............................................................. 35

4.6.4 Análise do sobrenadante e pellet dos cultivos..................................................... 36

4.6.4.1 Detecção da atividade de nisina........................................................................ 36

4.6.4.2 Extração de nisina adsorvida das células produtoras....................................... 38

4.6.5 Concentração de lactose...................................................................................... 38

4.6.6 Técnica de coloração de Gram............................................................................ 39

4.6.7 Determinação das curvas suavizadas.................................................................. 40

4.6.8 Determinação dos parâmetros cinéticos.............................................................. 40

x

4.6.9 Liofilização preliminar para conservação de nisina.............................................. 41

4.6.10 Purificação preliminar de nisina por cromatografia de interação hidrofóbica..... 42

5. RESULTADOS ......................................................................................................... 43

5.1 Resultados experimentais obtidos em biorreator.................................................... 43

5.2 Resultados experimentais da extração de nisina adsorvida das células

produtoras..................................................................................................................... 53

5.3 Resultados experimentais do coeficiente volumérico de transferência de

oxigênio (kLa)................................................................................................................. 57

5.4 Liofilização preliminar para conservação de nisina................................................. 57

5.5 Purificação preliminar de nisina por cromatografia de interação hidrofóbica.......... 59

6. DISCUSSÃO. ............................................................................................................ 60

6.1 Crescimento celular - Xmáx....................................................................................... 60

6.2 Produtividade celular - Prodx................................................................................... 61

6.3 Concentração máxima de nisina – P máx nisina.......................................................... 62

6.4 Adsorção de nisina pelas células produtoras.......................................................... 65

6.5 Efeito do pH............................................................................................................. 67

6.6 Produtividade de nisina – Prodnisina.......................................................................... 68

6.7 Valores de kLa......................................................................................................... 68

6.8 Valores de oxigênio dissolvido................................................................................ 70

6.9 Correlação entre atividade de nisina e concentração celular (YN/X)........................ 70

6.10 Consumo de açúcares e proteínas........................................................................ 71

6.11 Liofilização preliminar para a conservação de nisina............................................ 72

6.12 Purificação preliminar de nisina por cromatografia de interação hidrofóbica ....... 74

. 7. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 78

8. REFERÊNCIAS......................................................................................................... 79

9. ANEXOS................................................................................................................... 93

Anexo 9.1 Tabelas de resultados suavizados............................................................... 93

Anexo 9.2 Curvas de log UFC.mL-1 versus log AU.mL-1............................................... 99

Anexo 9.3 Tabelas de extração de nisina adsorvida das células produtoras – pontos

suavizados..................................................................................................................... 101

Anexo 9.4 Purificação preliminar de nisina em coluna de interação hidrofóbica.......... 105

Artigo 9.5 Artigos publicados......................................................................................... 107

Artigo 9.5.1 Nisin biotechnological production and application: a review..................... 108

Artigo 9.5.2 Nisin expression production from Lactococcus lactis in milk whey medium………………………………………………………………………………………... 118

Artigo 9.5.3 Nisin production utilizing skimmed milk aiming to reduce process cost…. 123

Anexo 9.6 Currículo Lattes............................................................................................ 138

Anexo 9.7 Histórico Acadêmico..................................................................................... 143

Anexo 9.8 Declaração do Comitê de Ética em Pesquisa e Informações para

membros de bancas julgadoras.................................................................................... 146

Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

As bactérias ácido lácticas (BAL) são empregadas na fermentação de

alimentos como iogurtes e queijos. Estas bactérias também melhoram a qualidade

microbiológica destes alimentos por meio da produção de uma variedade de

compostos antimicrobianos como ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio,

diacetil, acetaldeído e bacteriocinas. As bacteriocinas são proteínas ou complexos

protéicos biologicamente ativos que apresentam atividade bactericida contra

espécies geneticamente relacionadas. A bacteriocina nisina é um peptídeo

antimicrobiano composto por 34 resíduos de aminoácidos, massa molar de 3,5

KDa e produzido pelo Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454. Este peptídeo apresenta capacidade de inibir a germinação de esporos e o desenvolvimento de

bactérias Gram-positivas, assim como de bactérias Gram-negativas na presença

de agentes quelantes.

Atualmente, nisina é a única bacteriocina amplamente utilizada como

bioconservante natural de alimentos, principalmente em laticínios e aprovada pelas

legislações nacionais e internacionais. Apresenta as características ideais para um aditivo alimentício, não apresentando efeito sobre a microbiota normal do intestino, é atóxica, não afeta a cor e o sabor dos alimentos e apresenta estabilidade térmica à temperatura de esterilização. Devido a estas propriedades, pesquisadores vêm

realizando estudos para ampliar o potencial uso desta biomolécula nas áreas

farmacêutica, veterinária e de cosméticos.

As BAL são bactérias extremamente exigentes do ponto de composição do

seu meio de cultura. Para o seu crescimento, esses microrganismos necessitam de

um meio de cultura rico em aminoácidos, peptídeos, vitaminas, etc. Geralmente, os

meios de cultura empregados em escala laboratorial são o caldo MRS e caldo

M17. No entanto os altos custos destes meios tornam inviáveis a sua utilização na

produção comercial dessas bactérias e bacteriocinas. O elevado custo desses

meios é devido à presença de fontes complexas de nitrogênio (peptonas, extrato

de carne e levedura), porém estas fontes são capazes de suprir as necessidades

para crescimento das bactérias e para a produção de bacteriocinas.

Atualmente, o Brasil importa nisina a preços elevados, o que dificulta a sua

aplicação imediata no mercado consumidor. Devido ao alto custo desta

Introdução 2

biomolécula, é importante promover a produção economicamente viável de nisina,

buscando meios de cultura alternativos e reduzindo custos de produção. Deste

modo, o presente estudo de pesquisa objetivará o estudo quantitativo da produção

do antimicrobiano nisina em leite desnatado diluído UHT por Lactococcus lactis

subsp. lactis ATCC 11454 em biorreator. Estudos preliminares e complementares como a liofilização (bioconservação) e a purificação (cromatografia de interação

hidrofóbica) desta biomolécula produzida em escala laboratorial, também foram

desenvolvidos.

Revisão Bibliográfica 3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Histórico

Os primeiros registros sobre bacteriocinas datam de 1925, quando André

Gratia publicou um estudo referente ao antagonismo promovido por uma linhagem

de Escherichia coli sobre outras linhagens da mesma espécie. As substâncias responsáveis por esse efeito inibitório foram denominadas de “colicinas” em

referência ao microrganismo produtor original. Com a descoberta de que a

produção desses compostos não se limitava ao grupo dos coliformes, Jacob et al.

1953 propuseram o termo “bacteriocina” para as proteínas antimicrobianas

produzidas por microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos (NASCIMENTO;

MORENO; KUAYE, 2008).

Em 1928, Roger e Whittier na Inglaterra observaram que certas linhagens de

Lactococcus tinham a capacidade de inibir o crescimento de outras bactérias ácido lácticas. Após cinco anos, o antagonismo microbiano também foi observado na

Nova Zelândia por Whitehead e colaboradores (WHITEHEAD, 1933; WHITEHEAD;

RIDDET, 1933). Eles observaram o desenvolvimento de acidez, durante o

armazenamento do leite pelas culturas starters (iniciadoras), no processo de fabricação de queijo Cheddar e isolaram e identificaram sua natureza protéica.

Porém somente Meanwell (1943) na Inglaterra e Hunter e Whitehead (1944) na

Nova Zelândia, comprovaram que o desenvolvimento desta acidez foi realmente

causado pelas culturas starters. Shattock e Mattick (1943) identificaram estas linhagens como “estreptococos lácticos” do grupo sorológico “N” (DE VUYST;

VANDAMME, 1994).

Devido à escassez de penicilina durante a Segunda Guerra Mundial e a

necessidade de controlar mastite bovina, Mattick e Hirsch (1944) concentraram o

composto inibitório isolado por Meanwell (1943) para testar sua atividade

antagônica. Descobriram que este composto inibiu muitas bactérias patogênicas e

denominaram estes compostos como “antibióticos”. A denominação “nisina”

derivou da frase “Group N Inhibitory Substance” e o sufixo “in” foi atribuído à Revisão Bibliográfica 4

nomenclatura dos antibióticos. Atualmente, as linhagens de estreptococos são

denominadas lactococos (DE VUYST; VANDAMME, 1994).

2.2 Características e classificação das bactérias ácido lácticas

As bactérias ácido lácticas (BAL) são cocos ou bastonetes Gram-positivas,

anaeróbias facultativas ou microaerófilas, catalase-negativas, não formadoras de

esporos; apresentam carência de citocromos (o que reflete na ausência de

metabolismo respiratório gerador de energia) e produzem ácido lático como

principal produto da fermentação de carboidratos. São comensais naturais do trato

gastrointestinal de humanos e muitos animais. Este grupo é composto por espécies

dos gêneros Lactococcus, Streptococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium e Bifidobacterium (DE VUYST; VANDAMME, 1994). Do ponto de vista morfológico, as bactérias lácticas podem estar distribuídas em cocos, bacilos ou bastões

regulares e bacilos ou bastões irregulares. Os cocos são de forma esférica mais ou

menos alargada entre 0,5 e 2 µm, se apresentam em pares, tétrades ou cadeias de

número variado. Os bastões regulares podem ter um diâmetro variável entre 0,5 e

2 µm e comprimento até maior que 10 µm, se apresentado isolados, em pares ou

cadeias longas. Os Lactobacillus pertencem a este grupo. Os bastões irregulares são característicos das bactérias lácticas do gênero Bifidobacterium e são típicos por seus aspectos extremadamente variáveis de uma espécie à outra (TORO,

2005).

BAL são reconhecidas pelo FDA (US-Food and Drug Administration) como

generally regarded as safe (GRAS) e têm sido empregadas na fermentação de

alimentos como o iogurte ( Streptococcus spp. e Lactobacillus spp.) e queijo ( Lactococcus spp.), conferindo sabores e texturas característicos. Estes

microrganismos também melhoram a qualidade microbiológica destes alimentos

por meio da produção de uma variedade de compostos antimicrobianos tais como,

ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, diacetil, acetaldeído e bacteriocinas

(CHEIGH; PYUN, 2005). O peróxido de hidrogênio é produzido como mecanismo

de proteção frente ao oxigênio pela ação das oxidases ou NADH peroxidases. O

Revisão Bibliográfica 5

acúmulo de peróxido de hidrogênio nos produtos fermentados ocorre devido ao

fato de que os lactobacilos não possuem a enzima catalase. A ação bactericida

desse composto é atribuída ao seu efeito altamente oxidante, mediante a

peroxidação dos lipídeos da membrana e a destruição da estrutura básica

molecular das proteínas celulares (TORO, 2005). Bacteriocinas são proteínas ou

complexos protéicos biologicamente ativos, que apresentam atividade bactericida

contra espécies geneticamente relacionadas. São classificadas de acordo com o

espectro bacteriano, massa molar, estrutura química e modo de ação

(SVETOSLAV; DICKS, 2009). Com o fim de retardar a deterioração e preservar

alimentos através de fermentações naturais, estas bactérias têm sido usadas em

aplicações comerciais como culturas starters em indústrias de laticínios e carnes.

Além de inibir o crescimento de bactérias potencialmente patogênicas nos

produtos fermentados, acredita-se que as BAL proporcionem efeitos benéficos à

saúde. Isso fortaleceu o marketing de muitos alimentos contendo culturas vivas de bactérias lácticas, incluindo leite não fermentado, leite fermentado, iogurte, culturas secas, bebidas e doces. Esses alimentos com bactérias promotoras de benefícios

à saúde são denominados probióticos (RICHARDSON, 1996).

As BAL possuem alta tolerância ácida e sobrevivem em pH 5 ou inferior. A

tolerância ácida confere a essas bactérias uma vantagem competitiva sobre outros

microrganismos. A temperatura ótima de crescimento varia entre 20 e 45ºC,

dependendo do microrganismo considerado (HOFVENDAHL; HAHN-HAGERDAL,

2000).