Uma nova estratégia vacinal para o controle da cárie baseada em linhagens recombinantes de... por Milene Tavares Batista - Versão HTML

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MILENE TAVARES BATISTA

Uma nova estratégia vacinal para o controle da cárie baseada em

linhagens recombinantes de Bacillus subtilis

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, para

obtenção do Título de Doutor em

Ciências

São Paulo

2012

MILENE TAVARES BATISTA

Uma nova estratégia vacinal para o controle da cárie baseada em

linhagens recombinantes de Bacillus subtilis

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, para

obtenção do Título de Doutor em

Ciências

Área de Concentração: Microbiologia

Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia

Café Ferreira

Co-orientador: Prof. Dr. Luís Carlos de

Souza Ferreira

Versão original

São Paulo

2012

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Aos meus pais,

Ana e Adilao

Aos meus irmãos,

Michael e Marcel

Ao meu marido e eterno amor,

Leandro

Muito obrigada pelo amor, dedicação, apoio e

compreensão ao longo destes anos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus e à Nossa Senhora por me permitir concluir mais uma etapa

da minha vida.

Aos meus pais, Ana e Adilao, que são a razão da minha vida. Obrigada por me

darem uma família linda, por me ensinarem os valores da vida e por sempre estarem

ao meu lado. Mãe, obrigada por ser meu exemplo de grandiosidade de coração, por

sua alegria, companheirismo, fé e amor incondicional. Pai, obrigada por ser meu

exemplo de homem, de trabalhador, pai, por me ensinar o que é boa música, e por

cuidar de mim como sua princesinha.

Aos meus irmãos, Michael e Marcel, por serem meus eternos “comparsas”, por

me apoiarem sempre, me ajudarem quando ninguém mais podia.

Ao meu “namorido”, Leandro, por ser tão doce, amável, companheiro, por me

entender e apoiar, por me ajudar a dar risada quando o que eu mais queria era

chorar. E por ser meu eterno namorado, marido, amigo e amor.

Aos meus avôs pelo amor, carinho e cuidado.

À minha tia Edna por ser minha segunda mãe, cuidar de mim e me amar acima

de tudo. E a minha priminha-irmã, Jéssica, pelas suas eternas estripulias e alegria.

As minhas cunhadas, Vanessa e Vanessa, que são parte da família e trazem

ainda mais amor e união a nossa casa.

À Profa. Rita, minha orientadora, por ser minha eterna mestra e amiga, por me

dar a oportunidade de conhecer a ciência, por me apoiar sempre, me ensinar e guiar

pelo caminho profissional e pessoal (muitas vezes!). Obrigada pelo seu carinho e

alegria!

Ao Prof. Luís, meu co-orientador, por ser um exemplo de dedicação,

pesquisador e pessoa, pelos ensinamentos e paciência no trabalho, por seus bate-

papos alegres e incentivadores.

Ao Prof. Wolfgang pelo seu carinho e cuidado em um tempo de incertezas.

À Profa Jeannine, um exemplo de pessoa e profissional, por me receber com

carinho e atenção, pela oportunidade de crescer profissional e pessoalmente, por sua

amizade.

À amiga e mestra Elisa, por ser um exemplo de força e amizade. Por me ajudar

nos primeiros passos na ciência e ser meu ombro amigo, pelos incontáveis almoços e

sorvetes, pela paciência em ouvir minhas preocupações e pelas risadas.

Aos amigos Luana, Bruno (Tintim) e Sabrina, pelo companheirismo dentro e

fora do laboratório, pela descontração e suporte.

Ao amigo de outrora que me iniciou no laboratório, muito obrigada!

Aos amigos “Bacileiros”, Wilson, Rafael, Renata e Juliano (ex-bacileiro) pelo

trabalho em equipe, pela amizade. É um prazer trabalhar com pessoas como vocês.

À Renata pela sua ajuda profissional e pessoal, pelo carinho, por ter sempre

aquele toque amigo, por ser minha “comparsa” de viagens nacionais e internacionais.

À amiga e companheira de noitadas no laboratório Camila Santos pela sua

incansável energia, sua inteligência única, por sua maravilhosa força e amizade ao

longo destes anos. Obrigada por construir comigo uma amizade linda e sincera.

Ao grupo do VTNC (Renata, Rafael e Cariri) que permitiram que eu me

mantivesse sã em momentos turbulentos, pelas risadas e amizade.

Aos companheiros de laboratório (Carol IC, Ewerton, Mônica, Naína, Sara,

Débora, Priscila, Raíza, Rubens, Jaime, Marcinha, Mariana IC, Juliana, Deni, Luana

(e Manuzinha), Mari, Cariri e Bruna). Vocês estão no meu coração, obrigada pela

amizade e coleguismo, colaborações e por momentos de alegria e baboseira.

Ao Eduardo, Loren e Lilian pela inestimável ajuda em tudo.

Ao Eduardo por seu profissionalismo, competência, amizade e por me aguentar

pedindo coisas a toda hora.

Aos estagiários (Paschoal, Joelma, Bruno “Tintim”, Marianna, Mariela, Marilys e

Gabriela) que me ensinaram muitas lições profissionais e de vida, pela ajuda e

companheirismo.

À Maria Elizabete Almeida-Sbrogio (Bete) pelos ensinamentos, carinho e

mimos ao longo destes anos.

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia pelo suporte em todos os

momentos.

Aos funcionários e amigos do biotério da Parasitologia (Sandra, Juliane e Dani)

pela competência, ajuda, ensinamentos e risadas.

As agências de fomento FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro,

sem o qual seria impossível realizar este trabalho.

A todos aqueles que não consegui agradecer, minha eterna gratidão.

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.

Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”.

Marthin Luther King

RESUMO

TAVARES, M. B. Uma nova estratégia vacinal para o controle da cárie baseada

em linhagens recombinantes de Bacillus subtilis. 2012. 200 f. Tese (Doutorado

em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2012.

O Streptococcus mutans ( S. mutans) é o agente etiológico da cárie dental humana,

uma doença com ampla distribuição mundial. A adesão à superfície dental depende

da interação entre a proteína de superfície P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida

ao dente. A região N-terminal da P1 é um alvo vacinal importante que está

diretamente associada às funções de adesão e agregação. Este trabalho teve o

objetivo de avaliar estratégias vacinais contra o S. mutans baseadas na proteína P1

usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis é uma bactéria gram

positiva, formadora de esporos, não patogênica, empregada como sistema de

expressão de proteínas heterólogas e como veículo vacinal administrado por vias de

mucosas. Empregamos, inicialmente, o B. subtilis para expressar e purificar a

proteína P139-512 derivada da proteína P1 de S. mutans UA159. O antígeno P139-512

apresentou epítopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na

proteína P1 nativa. O sítio de ligação à SAG está preservado nessa proteína assim

como suas propriedades imunogênicas. A coadministração parenteral do antígeno

com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistêmica específica com anticorpos

eficazes no bloqueio da adesão de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis

como veículo de entrega de mucosa para o antígeno alvo de S. mutans. Esporos de

B. subtilis foram modificados para expressar na superfície adesinas bacterianas

(SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligação ao epitélio intestinal e, quando no

estágio de célula vegetativa, expressar intracelularmente o antígeno P139-512. A

imunização oral com os esporos adesivos induziu altas concentrações de anticorpos

sistêmicos e de mucosa. A imunização nasal ou sublingual com os esporos

recombinantes induziu níveis de anticorpos sistêmicos maiores do que aqueles

obtidos após a imunização oral. Além disso, esses anticorpos foram mais eficientes

em bloquear a adesão de S. mutans à SAG imobilizada, sem interferir com a

agregação. Em conclusão, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes

para o desenvolvimento de vacinas anti-cárie baseadas em linhagens de B. subtilis.

Palavras-chave: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vacina. Cárie dental.

Proteínas heterólogas. Veículo vacinal. Esporos.

ABSTRACT

TAVARES, M. B. A new vaccine approach for the control of tooth decay based on

recombinant Bacillus subtilis strains. 2012. 200 p. Ph. D. thesis (Microbiology) –

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.

S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with

worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the

interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the

tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly

associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate

vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant

B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic

bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine

vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B.

subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans

UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear

epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is

preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-

administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies

effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores

as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were

modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the

intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512

antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores

induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual

immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic

antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly

effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without

interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for

the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.

Keywords: Bacillus subtilis. Streptococcus mutans. Vaccine. Dental caries.

Heterologous proteins. Vaccine vehicle. Spores.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Representação esquemática da proteína P1 de S. mutans. ........................... 26

Figura 2- Construção do vetor de expressão e purificação da proteína P139-512 em B.

subtilis (pLDV701). ......................................................................................................... 71

Figura 3- Detecção e purificação da proteína P139-512 produzida em linhagem

recombinante de B. subtilis. ........................................................................................... 72

Figura 4- Representação esquemática das proteínas recombinantes derivadas da

proteína P1 de S. mutans e distribuição dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 na

estrutura conformacional da proteína. ............................................................................ 74

Figura 5- Avaliação da reatividade dos mAbs anti-P1 com a proteína nativa expressa no

S. mutans NG8 e com os fragmentos de proteína derivados da proteína P1. ............... 75

Figura 6- Caracterização dos epítopos da proteína recombinante P139-512 usando

anticorpos monoclonais anti-P1. .................................................................................... 76

Figura 7- Interação da proteína P139-512 recombinante com a SAG usando BIAcore

(surface plasmon resonance). ........................................................................................ 78

Figura 8- Especificidade antigênica dos anticorpos produzidos em camundongos

imunizados com a proteína P139-512. ............................................................................... 81

Figura 9- Reatividade dos soros gerados em camundongos com a proteína P139-512

purificada em linhagem recombinante de B. subtilis LDV701. ....................................... 83

Figura 10- Determinação da funcionalidade in vitro dos anticorpos gerados em

camundongos com as proteínas P139-512 ou P139-512d. ................................................... 86

Figura 11- Avaliação da resposta imunológica sistêmica em camundongos imunizados

pela via subcutânea com a proteína P139-512 associada aos diferentes adjuvantes. ...... 89

Figura 12- Determinação da avidez dos anticorpos em relação ao antígeno vacinal P139-

512. .................................................................................................................................. 91

Figura 13- Reatividade dos soros com a proteína P1 nativa de S. mutans NG8 e os

fragmentos truncados da P1. ......................................................................................... 93

Figura 14- Deposição do complemento na superfície de S. mutans na presença de

anticorpos anti-P139-512. .................................................................................................. 95

Figura 15- Funcionalidade dos soros gerados após imunização da proteína P139-512 co-

administrada com diferentes adjuvantes. ....................................................................... 97

Figura 16- Representação esquemática do direcionamento dos esporos de B. subtilis

para células imunes de mucosa no GALT ( gastrointestinal- associated lymphoid tissue) e

consequência para a resposta imunológica ao antígeno alvo. ..................................... 107

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Linhagens empregadas e construídas neste trabalho. ................................. 42

Quadro 2 - Vetores empregados e construídos neste trabalho. ..................................... 43

Quadro 3 - Iniciadores desenhados para a amplificação dos genes de interesse.......... 47

Quadro 4- Reatividade dos anticorpos policlonais com as proteínas recombinantes P1,

P1 39-512 ou P1 39-512d. ..................................................................................................... 82

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 21

1.1 A cárie dental humana ........................................................................................... 21

1.2 Streptococcus mutans ........................................................................................... 22

1.3 A família do Antígeno I/II e a Proteína P1 de S. mutans ...................................... 23

1.4 Região A ou Região de ligação à saliva ............................................................... 27

1.5 Estratégias vacinais contra a cárie dental ........................................................... 28

1.6 Bacillus subtilis e o desenvolvimento de vacinas .............................................. 32

1.7 Vacinas de mucosa baseadas em B. subtilis ....................................................... 37

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 39

2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 39

2.2 Objetivos específicos............................................................................................. 39

3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 40

3.1 Linhagens e vetores bacterianos, condições de cultivo .................................... 40

3.2 Competência e transformação em E. coli ............................................................ 40

3.3 Competência e transformação em B. subtilis ...................................................... 41

3.4 Lise de células vegetativas de B. subtilis ............................................................ 44

3.5 Extração de proteínas totais de S. mutans .......................................................... 44

3.6 Indução e purificação da proteína CG14 a partir de E. coli ................................ 44

3.7 Produção de anticorpos anti-P1 de S. mutans .................................................... 44

3.8 Construção do vetor de clonagem pGP1N ........................................................... 45

3.8.1 Isolamento de DNA genômico de S. mutans .................................................... 45

3.8.2 Amplificação do gene spaP1N por reação em cadeia da polimerase (PCR) e

clonagem no vetor pGEM-T-easy ................................................................................ 45

3.9 Construção do vetor de expressão pLDV701 ...................................................... 48

3.10 Expressão da proteína recombinante P139-512 em linhagem de B. subtilis

LDV701 .......................................................................................................................... 48

3.11 Fracionamento da amostra induzida de LDV701 ............................................... 49

3.12 Purificação da proteína recombinante P139-512 a partir de linhagem

recombinante de B. subtilis ......................................................................................... 50

3.13 SDS-PAGE e Western blot da proteína P139-512 .................................................. 50

3.14 Expressão e purificação dos fragmentos da proteína P1 ................................. 50

3.15 Preparação dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 ................................ 50

3.16 Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-P1 com a proteína P139-512 por

meio de Western blot ................................................................................................... 51

3.17 Determinação da reatividade dos mAbs anti-P1 com os fragmentos da

proteína P1 e a proteína P139-512 por meio de ELISA ................................................. 51

3.18 Preparo da aglutinina salivar (SAG) ................................................................... 52

3.19 Ensaio de ligação da P139-512 à SAG imobilizada em microchip via sistema

BIAcore.......................................................................................................................... 52

3.20 Regime vacinal e processamento das amostras ............................................... 53

3.21 Produção de anticorpos contra toda bactéria S. mutans ................................. 53

3.22 Adsorção dos anticorpos IgG anti-P1 com as proteínas P139-512 e P139-512d ... 54

3.23 ELISA para detecção de anticorpos específicos contra as proteínas P1,

P139-512 e P139-512d ......................................................................................................... 54

3.24 Imunofluorescência do S. mutans ...................................................................... 55

3.25 Ensaio de inibição da agregação do S. mutans mediada por saliva livre por

meio de anticorpos anti-P139-512 .................................................................................. 55

3.26 Bloqueio da adesão de S. mutans à SAG imobilizada por anticorpos

anti-P139-512 em placa de microtitulação ..................................................................... 56

3.27 Imunogenicidade da proteína P139-512 em associação com diferentes

adjuvantes - Protocolo vacinal .................................................................................... 57

3.28 Coleta de amostras .............................................................................................. 57

3.29 ELISA para detecção de anticorpos específicos contra a proteína P139-512 .... 58

3.30 ELISA de avidez .................................................................................................... 58

3.31 Reatividade dos soros policlonais anti-P139-512 com os fragmentos da

proteína P1 por meio de ELISA ................................................................................... 59

3.32 Inibição da adesão de S. mutans ao SAG imobilizado por anticorpos anti-

P139-512 específicos utilizando o sistema de BIAcore ................................................ 59

3.33 Inibição da agregação de S. mutans ao SAG livre por meio de

espectrofotometria ....................................................................................................... 60

3.34 Ensaio de deposição da proteína C3 do complemento .................................... 60

3.35 Construção das linhagens de B. subtilis capazes de expressar adesinas

bacterianas na superfície dos esporos ...................................................................... 61

3.36 Construção do vetor vacinal pLDV702 de B. subtilis ........................................ 62

3.37 Preparo dos esporos de B. subtilis .................................................................... 63

3.38 Extração e detecção das proteínas recombinantes da capa dos esporos ...... 63

3.39 Detecção e quantificação da expressão in vitro da P139-512 nas linhagens

vacinais de B. subtilis .................................................................................................. 64

3.40 Imunofluorescência dos esporos ....................................................................... 64

3.41 Adesão dos esporos recombinantes de B. subtilis a células Caco-2 in vitro . 65

3.42 Disseminação dos esporos no intestino de camundongos ............................. 66

3.43 Adesão dos esporos de B. subtilis às placas de Peyer de camundongos ..... 66

3.44 Regime vacinal com esporos recombinantes de B. subtilis e processamento

das amostras ................................................................................................................ 67

3.45 Detecção das respostas antígeno-específicas de anticorpos séricos e de

mucosa .......................................................................................................................... 67

3.46 Inibição da agregação de S. mutans mediada pela SAG livre em placas de

microtitulação ............................................................................................................... 68

3.47 Inibição da adesão de S. mutans mediada pelo SAG ligado em placa de

microtitulação ............................................................................................................... 68

3.48 Análises estatísticas ............................................................................................ 69

4 RESULTADOS ............................................................................................................ 70

4.1 Capítulo I. Produção e caracterização funcional e imunológica da proteína

P139-512 produzida a partir de uma linhagem recombinante de B. subtilis ............... 70

4.1.1 Construção da linhagem recombinante de B. subtilis LDV701, expressão e

purificação da proteína recombinante P139-512 ........................................................... 70

4.1.2 Reatividade dos monoclonais (mAbs) anti-P1 com as proteínas P1, P139-512 e

os domínios funcionais da P1 ..................................................................................... 73

4.1.3 Ligação da proteína recombinante P139-512 produzida em B. subtilis LDV701 à

SAG ............................................................................................................................... 77

4.1.4 Avaliação das propriedades imunogênicas e antigênicas da P139-512 expressa

em B. subtilis usando soros policlonais .................................................................... 79

4.1.5 Inibição do processo de agregação e adesão dependente de saliva com

anticorpos anti-P139-512 e anti-P139-512d ....................................................................... 84

4.2 Capítulo II. Caracterização imunológica de formulações vacinais usando a

proteína P139-512 co-administrada com diferentes adjuvantes .................................. 87

4.2.1 Avaliação da imunogenicidade da proteína recombinante P139-512 produzida

em B. subtilis administrada com diferentes adjuvantes ........................................... 87

4.2.2 Caracterização dos soros gerados com a proteína P139-512 associada a

adjuvantes quanto a sua avidez pelo antígeno ......................................................... 90

4.2.3 Avaliação da antigenicidade dos fragmentos de P1 usando os soros gerados

com a proteína P1 39-512 associada aos adjuvantes ................................................... 92

4.2.4 Ativação da via clássica do complemento pelos soros policlonais gerados

com a proteína P139-512 associada aos diferentes adjuvantes .................................. 94

4.2.5 Funcionalidade in vitro dos soros gerados com a proteína P139-512 associada

a adjuvantes em bloquear a adesão do S. mutans NG8 à SAG ................................ 96

4.2.6 Inibição da agregação de S. mutans NG8 in vitro usando os soros

policlonais gerados com os diferentes adjuvantes .................................................. 96

4.2.7 Discussão do Capítulo I e II ................................................................................ 98

4.3 Capítulo III. Desenvolvimento e caracterização dos esporos adesivos de B.

subtilis como veículo vacinal de entrega de mucosa ............................................. 104

5 DISCUSSÃO FINAL ................................................................................................. 147

6 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ........................................................................... 151

REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 152

APÊNDICE A - Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with an

amino-terminal polypeptide of Streptococcus mutans P1 protein produced by a

recombinant Bacillus subtilis strain ......................................................................... 173

APÊNDICE B - Avaliação da influência das condições de cultivo e método de

purificação na recuperação de esporos de B. subtilis com alto grau de pureza e

rendimento .................................................................................................................. 180

APÊNDICE C - Súmula curricular .............................................................................. 196

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21

1 INTRODUÇÃO

1.1 A cárie dental humana

A saúde bucal é um componente substancial da saúde do ser humano.

Entretanto, nos dias atuais diversas doenças orais crônicas, como a cárie dental,

estão disseminadas em países industrializados e em desenvolvimento. A Organização

Mundial da Saúde (OMS) qualifica a cárie dental como um dos maiores problemas de

saúde pública, devido à alta prevalência no mundo. Atualmente, a doença acomete

cerca de 90% das crianças em idade escolar e cerca de 100% da população mundial

adulta (LEHNER, 1992; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009; WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2012).

A cárie dental é uma doença transmissível, crônica, não letal, caracterizada

pela desmineralização do esmalte dental em consequência da produção de ácidos por

bactérias fermentadoras presentes no biofilme dental (COTE et al., 2004;

HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; SMITH, 2012; TAKAHASHI;

NYVAD, 2011; TAUBMAN; NASH, 2006). A doença cárie apresenta etiologia

multifatorial com envolvimento da dieta e susceptibilidade do hospedeiro, microbiota e

o tempo (FEJERSKOV, 2004; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009).

Mais de 700 espécies bacterianas estão presentes no biofilme dental e dentre

estas duas espécies pertencentes ao gênero Streptococcus tem sido relacionadas

como agentes etiológicos primários da cárie dental de superfície lisa, o S. mutans e o

S. sobrinus, sendo o primeiro mais frequentemente isolado da cavidade oral de

humanos e responsável por mais de 90% das lesões cariosas (DEWHIRST et al.,

2010; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986). Além disso, essa bactéria tem sido

associada a doenças infecciosas não orais como a endocardite bacteriana (AJDIC et

al., 2002; HAMADA; SLADE, 1980; LOESCHE, 1986).

Medidas como a administração tópica e sistêmica de flúor tiveram forte impacto

sobre a incidência de cárie na população mundial, contudo a eficácia desses métodos

não foi suficiente para erradicar a doença (HAJISHENGALLIS; MICHALEK 1999;

KOGA et al., 2002; SHIVAKUMAR; VIDYA; GHANDU, 2009). Desta forma, o

22

desenvolvimento de medidas efetivas de saúde pública que controlem o patógeno

mostra-se interessante pelo potencial impacto sobre a saúde bucal e geral do

individuo.

1.2 Streptococcus mutans

O S. mutans é um coco, firmicute, imóvel, catalase negativo, facultativo, capaz

de fermentar diversos açúcares provenientes da dieta do hospedeiro produzindo

ácidos que reduzem o pH da placa dental e promovem a desmineralização do esmalte

(HAMADA; SLADE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006 ). A infecção por S. mutans pode

ocorrer em dois momentos ao longo da vida do indivíduo saudável, na erupção dos

dentes decíduos e na troca para os dentes permanentes, estes períodos são

denominados de “janelas de infectividade” (CAUFIELD; CUTTER; DASANAYAKE,

1993; SMITH, 2002).

A capacidade de aderir à superfície dental, a habilidade de metabolizar

carboidratos e produzir ácidos (acidogenicidade), e a capacidade de suportar

ambientes ácidos (aciduricidade) são os principais fatores de virulências do S. mutans

relacionados com a doença cárie (HAMADA; KOGA; OOSHIMA, 1984; MICHALEK et

al., 1981). A adesão é fundamental para a patogênese da cárie dental, pois na

ausência desta não haverá formação do biofilme e desenvolvimento da doença. A

aderência do S. mutans à superfície dental envolve dois estágios, o primeiro deles,

denominado sacarose-independente e o segundo, sacarose-dependente (HAMADA;

SLADE, 1980; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980; TAUBMAN; NASH, 2006).

O primeiro estágio de adesão do S. mutans ao dente é reversível e

caracterizado pela interação entre uma proteína de superfície da bactéria, o antígeno

I/II ou P1, expresso por todas as linhagens cariogênicas de S. mutans e glicoproteínas

presente na película adquirida adsorvida ao dente (BOWEN et al., 1991; CROWLEY

et al., 1999; SMITH, 2002; STAAT; LANGLEY; DOYLE, 1980). O segundo estágio de

adesão é irreversível e associado à produção de polissacarídeos extracelulares

insolúveis (glucanos) e posterior interação desses com as proteínas ligadoras de

glucanos (Gbp) e glicosiltransferases (GtfB) presentes na superfície bacteriana. Este

23

estágio permite o acúmulo do S. mutans e o desenvolvimento do biofilme na

superfície dental (BOWEN; KOO, 2011; HAMADA; KOGA, 1984; SHIROZA et al.,

2003).

O S. mutans apresenta diferentes antígenos em sua superfície incluindo

polissacarídeos antigênicos, as Gtfs, Gbp, antígeno D, antígeno III, antígeno A,

antígeno C e antígeno B (P1). Entretanto, até momento apenas a proteína P1 e a

GbpB tem mostrado potencial como alvos vacinais com resultados favoráveis para o

controle da doença (BRADY et al., 2010; KOGA et al., 1995; KURAMITSU, 1993)

1.3 A família do Antígeno I/II e a Proteína P1 de S. mutans

Na cavidade oral a interação inicial entre bactéria e hospedeiro é dependente

da associação entre adesinas de superfície bacteriana e receptores presentes na

película adquirida adsorvida sobre o dente (HAMADA; SLADE, 1980).

Nos estreptococos orais do grupo Viridans, as proteínas da família I/II

participam na aderência, colonização e desenvolvimento da comunidade microbiana.

As proteínas da família I/II são adesinas ancoradas à parede celular bacteriana com

estrutura e antigenicidade relacionadas e apresentam entre 1310 e 1653 resíduos de

aminoácidos (BRADY et al., 2010). Essas proteínas possuem propriedades

multifuncionais como ligação a matriz extracelular, a receptores do hospedeiro, co-

agregação com outras bactérias, interação com glicoproteínas salivares e ativação de

células monocíticas (JENKINSON; DEMUTH, 1997; JENKINSON; LAMONT, 1997;

MADDOCKS et al., 2011). As proteínas da família I/II têm sido extensivamente

caracterizadas em numerosas linhagens de S. mutans e S. gordonii e apresentam

uma organização estrutural global altamente conservada com identidade entre 65 a

70% (DEMUTH et al., 1988, 1990; JENKINSON et al., 1993; KELLY et al., 1990; LEE;

PROGULSKE-FOX; BLEIWEIS, 1988; OGIER et al., 1990; OKAHASHI et al., 1989;

TOKUDA et al., 1991). A importância dessa família de proteínas pode ser

demonstrada pela presença de ortólogos em virtualmente todos os estreptococos

orais e a identificação destas também em S. pyogenes e S. agalactiae (MA et al.,

1991; ZHANG et al. , 2006).

24

A proteína P1 de S. mutans, também referida como Antígeno I/II, Antígeno B

ou PAc, é o maior antígeno de superfície deste microrganismo e pertence a grande

família I/II (JENKINSON; LAMONT, 1997; RUSSELL; LEHNER, 1978; KOGA et al.,

1995). A proteína P1 em S. mutans está envolvida no complexo processo multifatorial

de aderência as glicoproteínas salivares adsorvidas ao esmalte dentário (BOWEN et

al., 1991). Na linhagem UA159 de S. mutans do sorotipo c, a proteína P1 com peso

molecular aproximado de 171 kDa é codificada pelo gene spaP com 4689 pb (AJDIC

et al., 2002).

A sequência primária da P1 de S. mutans apresenta seis regiões distintas: um

peptídeo sinal predito composto pelos resíduos de aminoácido 1 até 38, adjacente a

este está a porção N-terminal altamente carregada composta principalmente por uma

região rica em alanina (região A, resíduos de aminoácidos 186-464). A região C-

terminal inclui um segmento rico em prolina (região P, resíduos de aminoácidos 840-

963) que confere uma alta hidrofobicidade a proteína, um domínio transmembrânico e

o motivo LPXTG que permite a ancoragem proteica na parede celular bacteriana. Na

região central, entre as regiões A e P, localiza-se um segmento denominado de

variável (região V) onde reside a maior variabilidade de sequência da proteína P1

entre as cepas de S. mutans (BRADY et al., 1991, 1998; FISCHETTI; PANCHOLI;

SCHNEEWIND, 1990; KELLY et al., 1989, 1995; MURAKAMI et al., 1997; THON-

THAT; MARRAFFINI; SCHNEEWIND, 2004) (figura 1A).

Anterior à cristalografia da proteína P1 de S. mutans um conjunto de 11

anticorpos monoclonais (mAbs) anti-P1 de S. mutans foram usados como ferramentas

para caracterizar os domínios funcionais da P1 assim como a antigenicidade desta ou

de fragmentos truncados derivados da P1, permitindo a elucidação de algumas das

propriedades mais importantes deste antígeno (BRADY et al., 1991, 1992; CROWLEY

et al., 1993). Em 2002, Troffer-Charlier obtiveram a cristalografia da região V da

proteína P1, permitindo a primeira observação sobre a estrutura 3D desta proteína de

S. mutans. Em 2010 e 2011, o restante da estrutura cristalográfica da proteína P1 de

S. mutans foi resolvida e mostrou ser singular. A proteína P1 de S. mutans apresenta

uma estrutura fibrilar alongada de aproximadamente 50 nm, onde a região A forma

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uma α-hélice que entrelaça intimamente a região P em hélice, enquanto a região V se

dobra formando uma estrutura globular (LARSON et al., 2010, 2011) (figura 1B).

A deleção da proteína P1 em linhagens de S. mutans resulta em redução

drástica da adesão à superfície dental na presença de saliva e de sua hidrofobicidade,

indicando o papel desta proteína na colonização da cavidade oral pelo patógeno

(BRADY et al., 1992; KOGA et al., 1990; LEE et al., 1989). A proteína P1 de S.

mutans interage especificamente com o receptor de varredura da imunidade inata, a

glicoproteína 340 (gp340), presente na aglutinina salivar (SAG) (LEITO et al., 2008).

O SAG é uma proteína oligomérica complexa de massa molecular aproximada de 400

kDa composta pela gp340, imunoglobulina A secretada e uma proteína de 80 kDa

(OHO et al., 1998; PRAKOBPHOL et al., 2000). A proteína P1 pode interagir com

duas formas da gp340, livre ou ligada à superfície dental, e isso determinará o destino

da bactéria na cavidade oral. Quando livre na saliva, a glicoproteína interage com a

proteína P1 de superfície do S. mutans resultando em agregação e provavelmente

eliminação da cavidade oral por meio da deglutição. Esse processo é importante na

proteção inata contra a cárie dental e tem sido considerado um mecanismo não imune

de eliminação do patógeno. Quando imobilizada, a glicoproteína servirá como um

receptor para aderência do S. mutans ao dente com consequente estabelecimento do

biofilme dental (LOIMARANTA et al., 2005; STENUDD et al., 2001). Entretanto,

apesar de ambos os processos envolverem os mesmos constituintes (proteína P1 e

gp340) dados sugerem que esses processos devem envolver domínios distintos das

proteínas (BRADY et al., 1992).

Evidências prévias de que vários fragmentos derivados da proteína P1 eram

capazes de interagir com a gp340 indicavam que essa proteína poderia apresentar

múltiplos sítios de ligação à gp340 adsorvida (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;

NAKAI et al., 1993). De fato, a proteína P1 de S. mutans apresenta pelo menos dois

sítios de ligação à SAG, um sítio está localizado na região C-terminal, mais

precisamente entre a região C1 e C2, e outro sítio está localizado dentro do fragmento

A3VP1, que corresponde a última região de repetição A, toda a região V e a primeira

região de repetição P. Adicionalmente, foi demonstrado que esses fragmentos não

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26

competem entre si pelo SAG indicando sítios distintos de ligação (LARSON et al.,

2011) (figura 1B).

Figura 1- Representação esquemática da proteína P1 de S. mutans.

(A) Representação da sequência primária da P1 com seus domínios relevantes. (B) Modelo

da estrutura terciária da proteína P1 e os sítios de ligação à aglutinina salivar humana (SAG).

PS, peptídeo sinal.

Fonte: Modificado de Larson et al. (2010, 2011).

27

1.4 Região A ou Região de ligação à saliva

Na porção amino-terminal da proteína P1 do S. mutans está localizada uma

região rica no aminoácido alanina, composta por três repetições de alanina completas

e uma incompleta formando uma estrutura em α-hélice denominada de região A

(KELLY et al., 1989; LARSON et al., 2010). Por avidez aos componentes salivares, a

região A tem sido referida como região de ligação à saliva ou SBR (Saliva-Binding

Region) (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; KOGA; RUSSELL, 1994;

HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998; NAKAI et al., 1993).

A região SBR codifica para uma proteína de peso molecular aproximado de 42

kDa, a qual permite a interação de S. mutans com componentes salivares,

particularmente a proteína gp340, demonstrando sua importância para aderência

inicial do patógeno à saliva adsorvida ao dente e subsequente desenvolvimento da

cárie (CROWLEY et al., 1993; HAJISHENGALLIS; RUSSELL; MICHALEK, 1998;

KOGA; RUSSELL, 1994; MOISSET et al., 1994; PRAKOBPHOL et al., 2000). Esse

segmento da P1 inibe competitivamente tanto aderência do S. mutans ao SAG

imobilizado quanto à agregação na presença de SAG livre (CROWLEY et al. 1993).

Além disso, a SBR tem papel fundamental na estrutura tridimensional, na expressão,

estabilidade e na antigenicidade da proteína P1 de S. mutans (SEIFERT; BLEIWEIS;

BRADY, 2004).

Ademais, essa região é antigênica e abrange tanto epítopos para células B

como para T, e anticorpos direcionados para a SBR de S. mutans tem reatividade

cruzada com a proteína P1 (Pag) de S. sobrinus (KELLY et al., 1995; LEHNER et al.,

1990; SENPUKU et al., 1996; TAKAHASHI et al., 1991). As sequências

TELARVQKANADAKAAY (repetida três vezes, com vários aminoácidos conservados)

e TYEAALKQYEADL (repetida quatro vezes, com vários aminoácidos conservados)

localizadas dentro da região A foram descritas como potenciais sítios de adesão aos

componentes salivares (adesitopos) (BRADY et al., 1992; KELLY et al., 1995;

MOISSET et al., 1994; NAKAI et al., 1993; OKAHASHI et al., 1993; SENPUKU et al.,

1995).

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Anticorpos séricos e da saliva de indivíduos naturalmente infectados pelo S.

mutans, porém sem relatos de cárie, são capazes de reconhecer fortemente vinte

sete decapeptídeos derivados da região A da proteína P1, indicando o papel protetor

de anticorpos direcionados contra essa região (MATSUSHITA et al.,1994). Ainda,

estratégias vacinais empregando peptídeos derivados desse segmento da P1 são

capazes de bloquear a agregação e a adesão de S. mutans e reduzir o