Utilização de eletrodos compósitos na análise voltamétrica de tetraciclinas em amostras biológicas.. por Carolina Maria Fioramonti Calixto - Versão HTML

ATENÇÃO: Esta é apenas uma visualização em HTML e alguns elementos como links e números de página podem estar incorretos.
Faça o download do livro em PDF, ePub para obter uma versão completa.

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS

CAROLINA MARIA FIORAMONTI CALIXTO

Utilização de eletrodos compósitos na análise voltamétrica de

tetraciclinas em amostras biológicas e ambientais

SÃO CARLOS

2012

Exemplar revisado

O exemplar original encontra-se em acervo

reservado na Biblioteca do IQSC-USP

CAROLINA MARIA FIORAMONTI CALIXTO

Utilização de eletrodos compósitos na análise voltamétrica de

tetraciclinas em amostras biológicas e ambientais

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de

Química de São Carlos, da Universidade de São

Paulo, como parte dos requisitos para a obtenção

do título de Doutor em Ciências.

Área de Concentração: Química Analítica e

Inorgânica.

Orientador: Prof. Dr. Éder Tadeu Gomes Cavalheiro

SÃO CARLOS

2012

“De tanto ver triunfar as nulidades,

De tanto ver prosperar a desonra,

De tanto ver crescer a injustiça,

De tanto ver agigantarem-se os

poderes nas mãos dos maus,

O homem chega a desanimar da

virtude,

A rir-se da honra,

A ter vergonha de ser honesto.”

Rui Barbosa

Aos meus pais, João e Rosana, pelo apoio e

confiança.

Aos meus irmãos, Giovana e João Gabriel.

Aos meus queridos avós, Vilma e Israel, e à tia

Railda, pelo carinho.

Ao Fábio, pelo amor, paciência e incentivo.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus por me conceder saúde e paz para a conclusão deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Éder Tadeu Gomes Cavalheiro pela oportunidade, confiança e orientação

durante todos esses anos.

Ao Prof. Dr. Gilberto Chierice pela disponibilidade do laboratório e pelos ensinamentos.

À Drª. Priscila Cervini, pela amizade e pela ajuda indispensável em grande parte do

trabalho.

A todos os amigos do LATEQS e GQATP, espero não esquecer ninguém. Aos atuais:

Sidney, Rita, Bia, Thalita, Luis Carlos, Abigail, Onias, Eliene, Fernanda, Renata,

Manoel, Arley, Pedro, Mônia, Glauco, Diego, Fellipy, Amanda, Ana Paula, Salvador,

Marli e Toninho. Aos antigos: Roberta, Fernando, Gilbert, Lucinéia, Ivana, Milena,

Adriana, Felipe, Royal, Toni, Luiz, Rafael, Andressa, Tácia, Glimaldo, Juliana, Graziela.

Aos professores do IQSC/USP pelos conhecimentos transmitidos.

Ao Dr. Marco Aurélio Carneiro Meira Bergamaschi, pesquisador da EMBRAPA Pecuária

Sudeste, pelas amostras de urina bovina.

À enfermeira Annie J. Correa, responsável pelo Banco de Leite da Santa Casa de

Misericórdia de São Carlos, pelas amostras de leite materno.

À FAPESP, pela bolsa concedida.

Aos meus sogros, Luiza e Paulo.

Em especial, ao meu marido Fábio por todo amor e apoio, em todos os momentos.

A todos que, de algum modo, contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO

Neste trabalho, um eletrodo compósito à base de grafite e poliuretana (EGPU)

60% (grafite, m/m) foi avaliado quanto ao seu potencial para determinação dos

antibióticos da família das tetraciclinas em amostras de água natural, de urina bovina e

humana, e em amostras de leite bovino e humano. Visando desenvolver métodos

simples, de baixo custo e com baixa geração de resíduos, o eletrodo foi usado sem

modificação, para atender a estes propósitos e considerando os níveis de concentração

das tetraciclinas nas amostras biológicas. A otimização dos parâmetros em voltametria

de pulso diferencial (DPV) foi realizada para a determinação dos antibióticos tetraciclina

(TC), oxitetraciclina (OTC) e clortetraciclina (CTC) em tampão fosfato 0,10 mol L-1 pH

2,3, permitindo atingir limites de detecção de 2,6 µmol L-1, 1,7 µmol L-1 e 0,82 µmol L-1,

respectivamente, sem a necessidade de renovação da superfície, entre as medidas

sucessivas. Durante as determinações de TC e OTC em amostras de água natural e

purificada, foram observadas recuperações entre 92,6% e 100%, após etapa de pré-

concentração. As amostras de urina foram acidificadas, em seguida centrifugadas para a

remoção de partículas sólidas e proteínas. A TC e OTC foram determinadas diretamente,

na amostra de urina tratada e diluída em tampão fosfato 0,10 mol L-1 pH 2,3. Durante a

determinação de TC e OTC nas amostras de urina, após o preparo da amostra, foram

obtidas recuperações entre 96% e 100%. As amostras de leite bovino e humano foram

intencionalmente contaminadas com TC. Após preparo das amostras, estas foram

submetidas à extração, usando cartucho para extração em fase sólida (SPE). Após

eluição e retomada do analito retido no cartucho, a quantidade de TC presente nas

amostras foi determinada pelo método de adição de padrão, usando DPV, com EGPU

60% (grafite, m/m). Foram obtidas recuperações entre 76% e 103% para as amostras de

leite bovino e recuperações entre 91% e 100 % para as amostras de leite humano, que

mostram que o eletrodo proposto pode ser usado neste tipo de determinação com as

características postuladas acima.

ABSTRACT

A bare graphite-polyurethane composite electrode 60% (graphite, m/m) (GPUE)

was evaluated in the determination of tetracycline (TC) class antibiotics in natural water

as well as, in human and bovine urine and in milk samples. Thus, a DPV procedure was

optimized for the determination of tetracycline, oxytetracycline (OTC) and

chlortetracycline (CTC) antibiotics in phosphate buffer 0.10 mol L-1 pH 2.3, resulting in

LOD of 2.6 µmol L-1, 1.7 µmol L-1 and 0.82 µmol L-1, respectively. During the

determination of TC and OTC in the water samples, recoveries between 92.6 and 100%

were found, after pre-concentration stage. The urine samples were submitted to

acidification followed by centrifugation to remove solids and proteins. During the

determination of TC and OTC in urine samples, after pre-treatment of urine, recoveries

between 96 and 100% were found. The composite electrode was also evaluated in the

determination of TC in the bovine and human milk samples. During the determination of

TC in milk, recoveries between 76 and 103% were found for bovine milk and recoveries

between 91 and 100% were found for human milk after pre-concentration stage,

showing the feasibility of the procedure.

GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

a – Amplitude de Pulso

b – Coeficiente angular da reta

C – Concentração

CTC – Clortetraciclina

DC - Doxiciclina

DPV – Voltametria de Pulso Diferencial

E – Potencial

Ep – Potencial de Pico

ECS – Eletrodo de Calomelano Saturado

EGM – Eletrodo Gotejante de Mercúrio

I – Corrente

Ip – Corrente de Pico

LOD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

OTC - Oxitetraciclina

PU - Poliuretana

R – Coeficiente de Correlação

SPE – Extração em Fase Sólida (do inglês “Solid Phase Extraction”)

Sb – Desvio-padrão do Branco

SD – Desvio-Padrão

TC – Tetraciclina

tpré-conc – Tempo de pré-concentração

U.H.T. – Ultra High Temperature

Φ – Diâmetro da Superfície do Eletrodo

ν - Velocidade de Varredura

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática da prensa manual utilizada na preparação dos

eletrodos compósitos grafite-PU (grafite, m/m).

Figura 2 - Esquema de preparação do EGPU (grafite, m/m).

Figura 3 – Voltamogramas cíclicos obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m) na ausência

(---) e na presença (—) de solução de TC e OTC, ambas 9,5 x 10-5 mol L-1, e

CTC 7,7 x 10-5 mol L-1 em tampão fosfato 0,10 mol L-1 pH 2,3, 2,3 e 4,0,

respectivamente, com ν = 25 mV s-1.

Figura 4 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para o EGPU 60% (grafite, m/m)

utilizando solução de TC 9,5 x 10-5 mol L-1 em tampão fosfato pH 2,3.

Figura 5 – Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para o EGPU 60% (grafite, m/m)

utilizando soluções de TC, OTC, ambas 9,5 x 10-5 mol L-1, e

CTC 7,7 x 10-5 mol L-1 em tampão fosfato 0,10 mol L-1, nos diferentes valores

de pH (pH 2,3-7,3), com a = 50 mV e ν = 10 mV s-1.

Figura 6 - Relação entre o potencial de pico em voltametria de pulso diferencial e pH, em

solução tampão fosfato, em diferentes valores de pH, contendo

TC 9,5 x 10-6 mol L-1.

Figura 7 - Relação entre o potencial de pico em voltametria de pulso diferencial e pH, em

solução tampão fosfato, em diferentes valores de pH, contendo

CTC 9,5 x 10-6 mol L-1.

Figura 8 – Voltamogramas em pulso diferencial em diferentes concentrações de TC, OTC

e CTC, respectivamente, utilizando o EGPU 60% (grafite, m/m). No detalhe as

curvas analíticas descritas.

Figura 9 - Voltamogramas em pulso diferencial obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em água natural.

Figura 10 - Demonstração do uso do método gráfico na estimativa do valor da corrente

de pico do voltamograma de pulso diferencial obtido para o EGPU 60%

(grafite, m/m) para a determinação de TC, em água natural: (a) curva

estimada para a linha base e (c) resposta voltamétrica na presença do TC.

Figura 11 - Voltamogramas em pulso diferencial obtidos para OTC no EGPU 60%

(grafite, m/m), em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em urina

bovina.

Figura 12 - Voltamogramas em pulso diferencial obtidos para o EGPU 60% (grafite,

m/m), em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, na determinação

de OTC em urina bovina.

Figura 13 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para o EGPU 60% (grafite,

m/m), em tampão fosfato pH 2,5, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, na determinação

de TC em urina humana.

Figura 14 - Voltamogramas em pulso diferencial obtidos para o EGPU 60% (grafite,

m/m), em tampão fosfato pH 2,5, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, na determinação

de OTC em urina humana.

Figura 15 - Voltamograma de pulso diferencial obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite bovino.

Figura 16 - Voltamograma de pulso diferencial obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,5, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite bovino.

Figura 17 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos om o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,5, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite bovino. Teste 1.

Figura 18 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,5, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite bovino. Teste 2.

Figura 19 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos com EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite bovino.

Figura 20 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos com o EGPU 60% (grafite, m/m),

em tampão fosfato pH 2,3, a = 50 mV e ν = 10 mV s-1, em leite humano.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Fórmulas estruturais das principais tetraciclinas

Tabela 2 - Resumo dos resultados descritos para determinação eletroquímica de

tetraciclinas, incluindo técnicas, eletrodos, dados analíticos e referências

Tabela 3 – Resultados obtidos para o EGPU 60% (grafite, m/m).

Tabela 4 - Resultados da determinação de TC e OTC em amostras de água natural e

purificada usando o EGPU 60% (grafite, m/m), após uso de SPE,

considerando um valor original de 1,90 µmol L-1 (914 ng mL-1), na amostra

Tabela 5 - Resultados da determinação de OTC em urina bovina usando o EGPU 60%

(grafite, m/m), considerando um valor original de 0,47 mg mL-1 na amostra

Tabela 6 - Resultados da determinação de TC em urina humana usando o EGPU 60%

(grafite, m/m), considerando um valor original de 283 µg mL-1 de TC na

amostra

Tabela 7 - Resultados da determinação de OTC em urina humana usando o EGPU 60%

(grafite, m/m), considerando um valor original de 285 µg mL-1 de OTC na

amostra

Tabela 8 - Experimentos para otimização do solvente de eluição do cartucho na

determinação de TC em leite bovino

Tabela 9 - Resultados da determinação de TC em três amostras diferentes de leite

bovino usando o EGPU 60% (grafite, m/m), considerando um valor original

de 100 e 400 μg Kg-1 na amostra

Tabela 10 - Resultados da determinação de TC em amostra de leite humano usando o

eletrodo compósito grafite-PU 60% (grafite, m/m), considerando um valor

original de 0,43 mg L-1 na amostra

SUMÁRIO

1 Introdução......................................................................................................................................... 15

1.1 Apresentação .......................................................................................................................... 15

1.2 Determinação de fármacos em fluidos biológicos e/ou amostras ambientais

utilizando técnicas eletroanalíticas ....................................................................................... 16

1.3 Antibióticos ............................................................................................................................. 18

1.3.1 Tetraciclinas ................................................................................................................ 20

1.4 Comportamento eletroquímico e estabilidade das tetraciclinas ........................ 24

1.5 Revisão bibliográfica de métodos de determinação voltamétrica de

tetraciclinas .................................................................................................................................... 26

1.6 Eletrodos compósitos .......................................................................................................... 31

1.7 Resina poliuretana................................................................................................................ 33

1.8 Revisão bibliográfica dos eletrodos compósitos à base de grafite e

poliuretana (PU) ........................................................................................................................... 35

2 Objetivos ............................................................................................................................................ 39

3 Parte Experimental ........................................................................................................................ 41

3.1 Reagentes e soluções ........................................................................................................... 41

3.2 Preparação dos eletrodos compósitos .......................................................................... 41

3.3 Tratamento mecânico ......................................................................................................... 43

3.4 Equipamentos ........................................................................................................................ 43

3.5 Procedimento para a determinação de tetraciclina e oxitetraciclina em

amostras de água natural .......................................................................................................... 44

3.6 Procedimento para a determinação de oxitetraciclina em urina bovina ........ 46

3.7 Procedimento para a determinação de tetraciclina e oxitetraciclina em urina

humana ............................................................................................................................................. 47

3.8 Procedimento para a determinação de tetraciclina em amostras de leite

bovino e humano .......................................................................................................................... 48

4 Otimização dos parâmetros voltamétricos .......................................................................... 51

4.1 Voltametria cíclica ................................................................................................................ 51

4.2 Voltametria de pulso diferencial ..................................................................................... 52

4.2.1 Otimização dos parâmetros .................................................................................. 52

4.2.2 Estudo do efeito do pH na resposta voltamétrica das tetraciclinas ...... 54

4.2.3 Curvas analíticas para as tetraciclinas em DPV ............................................ 63

5 Determinação de TC e OTC em amostras de água natural ............................................. 68

6 Determinação de tetraciclina e oxitetraciclina em amostras de urina bovina e

humana .................................................................................................................................................. 74

6.1Determinação de OTC em amostra de urina bovina ................................................. 74

6.2 Determinação de TC e OTC em amostras de urina humana ................................. 80

7 Determinação de tetraciclina em amostras de leite bovino e humano ..................... 85

7.1 Preparo da amostra de leite .............................................................................................. 85

7.2 Procedimento de extração em fase sólida ................................................................... 86

7.3 Determinação de tetraciclina em amostras de leite bovino ................................. 91

7.4 Determinação de tetraciclina em amostras de leite humano .............................. 94

8 Conclusões ........................................................................................................................................ 98

Trabalhos futuros ........................................................................................................................... 100

Outras Atividades ........................................................................................................................... 102

Trabalhos apresentados ......................................................................................................... 102

Congressos nacionais ......................................................................................................... 102

Congresso internacional ................................................................................................... 102

Artigos ........................................................................................................................................... 103

Prêmio ........................................................................................................................................... 104

Estágio supervisionado em docência ................................................................................ 104

Referências Bibliográficas ........................................................................................................... 106

Capítulo I - INTRODUÇÃO

Introdução - 15

1 Introdução

1.1 Justificativa

O propósito deste trabalho é desenvolver métodos simples para a determinação de

antibióticos da classe das tetraciclinas em amostras ambientais e biológicas, usando o

eletrodo compósito à base de grafite e resina poliuretana (PU), sem modificação, para

amostras contendo níveis de concentrações de μmol L-1, com menor preparo de amostra

possível e com a mínima geração de resíduos.

A determinação das tetraciclinas foi motivada pelo seu uso amplo nas práticas

médicas em humanos e animais, resultando na possibilidade de contaminação de águas

residuais em indústrias farmacêuticas e, esgotos, assim como em produtos alimentícios,

como o leite.

A determinação voltamétrica das tetraciclinas em eletrodos não modificados

representa um desafio dado aos potenciais relativamente elevados de sua oxidação, a

baixa velocidade de transferência de elétrons, o que leva à sensibilidade relativamente

pequena, devendo o eletrodo ser capaz de contornar ambos os problemas.

Entretanto, as concentrações relativamente elevadas presentes na excreção renal

desses antibióticos, sugerem sucesso na análise voltamétrica das tetraciclinas.

Primeiramente, foi realizada uma tentativa de determinação do antibiótico

amoxicilina (AMX), mas o pico de oxidação deste analito coincide com um pico de

oxidação de grupos funcionais presentes na resina usada na confecção do eletrodo

compósito grafite-PU, o que inviabilizou as medidas quantitativas. Em virtude disso,

optou-se por utilizar os antibióticos da família das tetraciclinas, cujos potenciais de pico

não se situam na região crítica.

Introdução - 16

O eletrodo compósito grafite-PU 60% (grafite, m/m) foi utilizado para investigar o

comportamento voltamétrico dos antibióticos: tetraciclina, oxitetraciclina e da

clortetraciclina, já que essa composição mostrou-se a mais eficiente em trabalhos

anteriores. Foram avaliados os parâmetros relativos ao intervalo de potenciais,

eletrólito suporte, pH, velocidade de varredura e amplitude de pulso. Para cada analito,

foram obtidas curvas analíticas para definição de intervalos lineares de resposta, limites

de detecção, limite de quantificação e sensibilidade.

Após definição destas condições, os procedimentos foram aplicados na

determinação dos analitos nas amostras de água natural, de urina bovina e humana, e de

leite bovino e humano.

Testes de adição e recuperação também foram realizados para uma caracterização

dos métodos analíticos desenvolvidos, quanto a sua exatidão e repetibilidade.

1.2 Determinação de fármacos em fluidos biológicos e/ou amostras ambientais

utilizando técnicas eletroanalíticas

A literatura é rica em métodos voltamétricos e cromatográficos para a

determinação de fármacos em fluidos biológicos e amostras ambientais. A principal

vantagem das técnicas eletroanalíticas residiria no custo das análises e na simplicidade

de procedimentos, aliada aos baixos limites de detecção, uma vez otimizados os

parâmetros de análise e na geração de volumes menores de resíduos, em relação a

outros métodos.

A determinação de fármacos na natureza é motivo de preocupação desde há algum

tempo. Díaz-Cruz e Barceló1 apresentaram um artigo de revisão sobre o assunto já em

2004. Entretanto, devido à intensidade do problema, ele vem sendo abordado pela

Introdução - 17

grande imprensa em veículos de comunicação em massa, como apresentado no Jornal

Nacional, da Rede Globo de Televisão, há algum tempo. 2

A contaminação das águas, por fármacos, pode ocorrer por diferentes fontes como

a excreção humana em esgotos domésticos e de animais, quando drogas de uso

veterinário são usadas em criatórios de grande escala ou despejos industriais. O controle

das águas de rejeito das indústrias farmacêuticas pode ser realizado, pois, neste caso,

são esperadas concentrações maiores que aquelas encontradas nas águas de rios ou

lagos.

Os fármacos utilizados como analitos foram os antibióticos da família das

tetraciclinas: tetraciclina, oxitetraciclina e clortetraciclina.

Neste trabalho a extração em fase sólida (SPE) foi usada para a pré-concentração

do analito e eliminação de componentes da matriz, visando melhorar a seletividade do

método desenvolvido. Em seguida, os analitos foram retomados por eluição com

solvente adequado e determinados por técnicas voltamétricas, usando o eletrodo

compósito à base de grafite-PU, ao invés dos procedimentos cromatográficos,

normalmente empregados.

A extração em fase sólida (SPE) é uma técnica de separação líquido-sólido baseada

em mecanismos de separação da cromatografia líquida de baixa pressão, empregando-se

uma pequena coluna aberta, usualmente denominada cartucho de extração, a qual

contém a fase sólida, denominada fase estacionária em cromatografia. A solução

contendo o analito de interesse é colocada no topo do cartucho e aspirada sob vácuo, de

forma a penetrar no cartucho. Depois de drenada toda a fase líquida, o analito retido no

cartucho é eluído com um pequeno volume de solvente, de forma a coletar o analito em

concentração já apropriada para análise. 3

Introdução - 18

1.3 Antibióticos

O desenvolvimento dessa classe de fármacos se baseou na teoria microbiana das

doenças, baseada nos trabalhos de Louis Pasteur e Robert Koch, que correlacionaram

microrganismos específicos com doenças bem definidas. 4

No século XX, essa teoria microbiana teve um avanço, devido à identificação e a

caracterização de muitos patógenos microbianos e seus mecanismos patogenéticos e a

introdução dos agentes antimicrobianos. 4

Com isso, definiram-se os antibióticos como compostos naturais ou sintéticos,

que, em doses adequadas, podem inibir o crescimento ou mesmo causar a morte de

fungos e bactérias. 5

Um antibiótico ideal deve preencher as seguintes características: 6

apresentar ação antibacteriana seletiva e potente, de preferência sobre

ampla série de microrganismos, ou seja, de amplo espectro;

ser bactericida e não somente bacteriostático;

exercer sua atividade antibacteriana em presença dos líquidos do

organismo e não ser destruído por enzimas teciduais;

não perturbar as defesas do organismo,

não produzir efeitos colaterais graves;

não produzir efeitos de sensibilização alérgica;

não provocar o desenvolvimento de resistência dos microrganismos

sensíveis;

absorção, distribuição, destino e excreção devem ser eficientes, a fim de

obter rapidamente os níveis bactericidas no sangue, tecidos, líquidos

Introdução - 19

teciduais, inclusive no líquido céfalo-raquidiano e na urina, mantendo-se

no organismo pelo tempo necessário para ação;

ser eficaz por todas as vias de administração;

apresentar a possibilidade de ser fabricado em grandes quantidades e a

custo acessível.

Os antibióticos diferem muito nas suas propriedades físicas, químicas e

farmacológicas, no espectro antibacteriano de atividade e nos mecanismos de atuação.

Por isso, é necessária uma classificação desses fármacos, sendo a mais comum aquela

que se baseia na estrutura química e no mecanismo de ação. 7,8

Os antibióticos de origem natural e seus derivados semissintéticos são os mais

utilizados na clínica médica e podem ser distribuídos nas seguintes classes: 5

β-lactâmicos,

tetraciclinas,

aminoglicosídeos,

macrolídeos,

peptídeos cíclicos,

estroptograminas.

As classes de antibióticos de origem sintética incluem: 5

sulfonaminas,

fluoroquinolonas,

oxazolidinonas.

Introdução - 20

1.3.1 Tetraciclinas

Os antibióticos da família da tetraciclina selecionados, foco deste trabalho,

apresentam importância tanto no tratamento de humanos, quanto na produção animal,

podendo aparecer no meio ambiente, pois são fármacos largamente produzidos e

utilizados.

A tetraciclina (TC), 2-(amino-hidróxi-metilideno)-4-dimetilamino-6,10,11,12a-

tetrahidróxi-6-metil-4,4a,5,5a-tetrahidrotetraceno-1,3,12-triona (Tabela 1), é um dos

fármacos mais utilizados no tratamento de infecções bacterianas em humanos e na

medicina veterinária, devido ao seu amplo espectro de atividade contra bactérias

gram-positivas e gram-negativas. 9

As tetraciclinas foram descobertas, em consequência, de uma pesquisa de

amostras de solo, coletadas em várias partes do mundo, com o objetivo de encontrar

microrganismos produtores de antibióticos. 4

A Tabela 1 apresenta as estruturas químicas das principais tetraciclinas

utilizadas nas práticas médicas e veterinárias, incluindo as que foram objeto de estudo

no presente trabalho.

Em 1945, Benjamin Duggar descobriu a primeira tetraciclina, a clortetraciclina

(CTC), que é um produto da fermentação natural de uma bactéria do solo a Streptomyces

aureofaciens. 10 Essa descoberta marcou a introdução do primeiro antibiótico ativo

contra uma variedade de bactérias e de outros microrganismos. 6

A oxitetraciclina (OTC) é um produto da fermentação natural da bactéria

Streptomyces rimosus. Já, a tetraciclina é um derivado semissintético da clortetraciclina,

e a demeclociclina é o produto de uma cepa mutante do S. aureofaciens, enquanto a

metaciclina, a doxiciclina e a minociclina são todos produtos semissintéticos. 9

Introdução - 21

Entre 1950 e 1970, vários antibióticos da família das tetraciclinas foram

desenvolvidos e, neste mesmo período, as tetraciclinas foram os fármacos mais

utilizados nos EUA para o combate de doenças infecciosas. 9

Em 2010, Pereira-Maia et al. 9 apresentaram uma revisão sobre a importância

dessa classe de antibióticos, focando na química de coordenação das tetraciclinas e suas

possíveis aplicações. Uma vez que compostos de coordenação contendo tetraciclinas

poderão ser utilizados, futuramente, na clínica médica no tratamento de câncer e,

também, no tratamento de doenças infecciosas.

Introdução - 22

Tabela 1 - Fórmulas estruturais das principais tetraciclinas

Nome genérico

Fórmula Estrutural

H C

CH3

3

N

O

H

CH3

OH

Tetraciclina

O

C

OH

OH

O

OH

O

NH2

H C

CH

3

3

N

O

H

CH

OH

3

OH

Oxitetraciclina

O

C

OH

O

H

OH

O

O

NH2

H C

CH

3

3

Cl

N

O

H

CH3

OH

Clortetraciclina

O

C

OH

O

H

O

OH

NH

O

2

H C

CH

3

3

N

CH2

OH

OH

Metaciclina

O

C

OH

HO

OH

O

O

NH2

H C

CH

3

3

Cl

N

O

H

CH3

OH

Demeclociclina

O

C

OH

HO

OH

O

O

NH2

H C

CH

3

3

N

CH

OH

3

OH

Doxiciclina

O

C

OH

HO

OH

O

O

NH2

CH

H C

CH

3

3

3

H C

3

N

N

OH

Minociclina

O

C

OH

OH

O

OH

O

NH2

Introdução - 23

Esses antibióticos são classificados como bacteriostáticos, devido ao seu

mecanismo de ação, pois inibem o mecanismo de reprodução das proteínas bacterianas,

através de sua ligação ao ribossomo bacteriano 30S, impedindo o acesso do tRNA ao

local aceptor (A) no complexo mRNA-ribossomo. 4

As tetraciclinas apresentam atividade contra Rickettsia, bactérias gram-negativas

e gram-positivas, aeróbios, anaeróbios e Chlamydia. E também apresentam baixa

toxicidade, baixo custo, e podem ser administradas por via oral. 9

Em virtude dessas características, as tetraciclinas ainda são muito utilizadas na

clínica médica, na terapia animal para o tratamento de infecções e, também, como

aditivos alimentares, a fim de aumentar a eficiência de crescimento de alguns

animais. 9,10

Entretanto, pesquisadores têm revelado o uso inadequado desses compostos, o

que provoca o acúmulo de resíduos desses antibióticos em tecidos animais e no leite,

podendo apresentar efeitos tóxicos diretos nos consumidores. 10

Os resíduos de antibióticos em produtos alimentares podem causar alergia em

alguns indivíduos sensíveis, super infecções e resistência aos antibióticos em pacientes

humanos. 10

Com base nesses fatos, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),

através do Programa Nacional de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em

Alimentos Expostos ao Consumo (PAMVet), determina como limite máximo residual

(LMR) aceitável das tetraciclinas o valor de 100 μg kg-1. 11

Já o Ministério da Agricultura, pela Portaria 193, de 12 de maio de 1998, proíbe

o uso das tetraciclinas como aditivo na alimentação animal. 12

Os limites de tolerância para esses analitos se situam na região de resposta

linear dos eletrodos compósitos à base de grafite-PU e sugerem a possibilidade da

Introdução - 24

aplicação destes dispositivos, sem modificações, minimizando as dificuldades e custo de

análise.

1.4 Comportamento eletroquímico e estabilidade das Tetraciclinas

Para o estudo do comportamento eletroquímico das tetraciclinas, deve-se

considerar que cada TC contem um substituinte fenólico na posição C-10 e um

substituinte dimetilamina na posição C-4, como observado na fórmula estrutural da

tetraciclina: 13

H C

CH3

3

N

O

H

CH3

OH

O

C

OH

OH

O

OH

O

NH2

Fórmula estrutural da tetraciclina.

Segundo Kazemifard et al. 14, a oxidação eletroquímica das tetraciclinas ocorre

no grupo fenol na posição C-10 e no grupo dimetilamina na posição C-4.

Chatten et al. 15 concordam que os grupos fenol e dimetilamina são os prováveis

sítios para ocorrer uma oxidação inicial, em potencial menor que 1,0 V (vs. ECS).

Segundo os autores, o grupo amino é protonado em tampão acetato pH 4,0 e 5,6 e o

núcleo fenólico da molécula se oxida de forma irreversível na presença de 1 elétron.

Por outro lado, Dang et al. 16 observaram somente um pico de oxidação da TC

(E~0,58 V vs. ECS), o qual atribuíram à oxidação do grupo fenol na posição 10. O

mecanismo de oxidação proposto pelos autores, Equações 1 e 2, é baseado na oxidação

Introdução - 25

do grupo fenol a benzoquinona, o qual se adsorve na superfície do eletrodo negro de

acetileno, formando um par redox hidroquinona/benzoquinona.

OH

O

+ H

(1)

2O

+ 4 H+ + 4 e-

O

O

OH

+ 2 H+ + 2 e-

(2)

O

OH

O fato destes autores não observarem o segundo evento, pode estar relacionado

com a atividade da superfície do eletrodo e à aparente baixa velocidade do processo de

transferência eletrônica.

A estabilidade das tetraciclinas em água foi discutida por Loftin et al.17. De

acordo com esses autores, as tetraciclinas se degradam em água, incluindo os processos

de hidrólise e epimerização. Os efeitos da força iônica, pH e temperatura em cada reação

foram apresentados e, para a TC, OTC e CTC a 4 mmol L-1 em tampão fosfato pH 2,0, a

22°C, foram encontrados tempos de meia vida (t1/2) iguais a 306, 1052 e 318 h,

respectivamente.

Introdução - 26

1.5 Revisão bibliográfica de métodos de determinação voltamétrica de

tetraciclinas

As técnicas voltamétricas são caracterizadas pela simplicidade, rapidez e baixo

custo e tem sido usadas na determinação das tetraciclinas. A seguir, estão relacionados

alguns trabalhos sobre a determinação dessa classe de antibióticos usando essas

técnicas em amostras farmacêuticas, ambientais e biológicas.

Caplis et al. 18 apresentaram a primeira determinação de tetraciclina,

clortetraciclina e oxitetraciclina por polarografia de corrente alternada. Neste trabalho,

os autores discutem o efeito do pH e a degradação destes antibióticos na resposta

polarográfica, em comparação com a atividade biológica.

A Tabela 1 apresenta uma resenha de diversos trabalhos descritos na literatura

sobre a determinação eletroquímica de tetraciclinas.

Pode-se observar um uso frequente de eletrodos de trabalho de ouro,

modificados ou não, além do uso de outros materiais eletródicos, cobrindo uma ampla

gama de limites de detecção.

Um eletrodo de ouro não modificado foi utilizado na determinação de

oxitetraciclina por titulação associada a diferentes técnicas eletroquímicas. 19 Também

foram apresentados eletrodos de disco de ouro25, 26, microeletrodo de ouro não

modificado24, e também, um eletrodo impresso de ouro14 com limites de detecção que

variam entre 9,36 x 10-12 mol L-1 a 1,0 x 10-6 mol L-1.

Eletrodos de ouro modificados com polímeros molecularmente impressos21, 22 e

um microeletrodo de ouro modificado com tungstênio23, permitiram obter limites de

detecção entre 6,49 x 10-10 mol L-1 a 1,87 x 10-6 mol L-1.

Introdução - 27

Obviamente os eletrodos modificados apresentam melhores limites de detecção.

Entretanto, com maior dificuldade de regeneração da superfície do eletrodo, quando se

perde a modificação, caso ela superficial, e também não sendo necessárias para

amostras biológicas, em que há excreção em concentrações relativamente altas desses

analito.

Outros tipos de materiais de eletrodo são utilizados na determinação das

tetraciclinas em diferentes técnicas voltamétricas, tais como eletrodos de carbono vítreo

modificados27, 32, eletrodos de diamante dopados/anodizados com boro28, 31, eletrodo

compósito de grafite e resina poliuretana36, eletrodos gotejante de mercúrio33-35, entre

outros, como resume a Tabela 2.

Tabela 2 - Resumo dos resultados descritos para determinação eletroquímica de tetraciclinas, incluindo técnicas, eletrodos, dados analíticos e referências Região linear

LOD

Eletrodo

Analito

Técnica (s)

Referência

(mol L-1)

(mol L-1)

Titulação condutométrica,

Au

OTC

Kurzawa et al.19

potenciometrica e CV

Au-PAMAN

CTC

CV

9,00 x 10-8 - 5,00 x 10-5

4,95 x 10-8

Lian et al.20

Au-MIP

OTC

CV, DPV

0 - 1,0 x 10-7

6,49 x 10-10

Li et al.21

2,0 x 10-6 – 21 x 10-6,

µAu/Tg

TC

CV

1,9 x 10-6

Wang et al.22

21 x 10-6 -208 x 10-6

µAu

TC

CV, FIA-AMP

33 x 10-12 – 915 x10-12

9,36 x 10-12

Norouzi et al.23

1,0 x 10-6 - 500 x 10-6

0,96 x 10-6

SPGE

TC, CTC, OTC

FIA-pAMP

5,0 x 10-6– 50 x 10-6

0,50 x 10-6

Masawat et al.13

1,0 x 10-6 - 500 x 10-6

0,35 x 10-6

Disco de Au

DC, CTC

LSV

1,0 x 10-6 - 0,1 x 10-3

1,0 x 10-6

Charoenraks et al.24

Disco de Au

TC

5,0 x 10-6 - 0,6 x 10-3

1,0 x 10-6

Palaharn et al.25

IL-MWNT-GCE

TC

1,1 x 10-7 - 2,2 x 10-5

3,0 x 10-8

Guo et al.26

Tabela 2 - Continuação

Região linear

LOD

Eletrodo

Analito

Técnica (s)

Referência

(mol L-1)

(mol L-1)

BDD-depositado,

TC, CTC, DC, OTC

CV

Taherpour et al.27

BDD- anodizado

0,1 x 10-6 - 208 x 10-6

2,1 x 10-8

0,1 x 10-6 - 208 x 10-6

2,1 x 10-8

Ni-DIA

OTC, TC, CTC, DC

CV

Treetepvijit et al.28

0,2 x 10-6 - 208 x 10-6

0,1 x 10-6

0,2 x 10-6 - 208 x 10-6

0,1 x 10-6

Ni-DIA

TC

CV

1,0 x 10-6 - 9,0 x 10-6

10 x10-9

Treetepvijit et al.29

0,1 x 10-3 - 50 x 10-3

Wangfuengkanagul

BDD-anodizado

TC, CTC, OTC, DC

CV

10 x 10-9

0,5 x 10-3 - 50 x 10-3

et al.30

5,2 x 10-6 – 166 x 10-6

6,2 x 10-8

5,2 x 10-6 – 166 x 10-6

1,9 x 10-6

Ni-GCE

TC, DC, OTC, CTC

FIA-AMP

Oungpipat et al.31

5,2 x 10-6 – 166 x 10-6

7,1 x 10-7

5,2 x 10-6 – 166 x 10-6

3,8 x 10-8

HMDE

TC, OTC

DCSV, DPSV

1,0 x 10-7 -5,0 x 10-8

Ghandou et al.32

Tabela 2 - Conclusão

Região linear

LOD

Eletrodo

Analito

Técnica (s)

Referência

(mol L-1)

(mol L-1)

HMDE

MC

ACP

1,0 x 10-6 - 5,0 x 10-6

1,0 x 10-6

Tanase et al.33

HDME

OTC, TC, CTC

DPSV

4,1 x 10-8 – 37 x 10-8

6,2 x 10-6-10 x 10-6

Ni et al.34

EGPU

TC

DPV

4,00 -40,0 x 10-6

2,8 x 10-6

Calixto et al.35

Negro de acetileno

TC

ASV

1,2 x 10-7 - 6,0x 10-5

1,2 x 10-8

Dang et al.16

µeletrodo de fibra de

OTC

SWV

1,0 x 10-6 - 1,0 x 10-4

2,9 x 10-7

Agui et al.36

carbono

Obs.:PAMAN: dendrímero de amina poliamida; MIP: polímero molecularmente impresso; Tg: tungstênio; SPGE: eletrodo impresso de ouro; IL: líquido iônico; MWNT: nanotubo de carbono de parede múltipla; GCE: eletrodo de carbono vítreo; DTC: doxitetraciclina; CV: voltametria cíclica; DPV: voltametria de pulso diferencial; FIA-AMP: análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica; FIA-pAMP: análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica de pulso; LSV: voltametria de varredura linear; DCSV: voltametria de redissolução de corrente direta; DPSV: voltametria de redissolução de pulso diferencial; ACP: polarografia de corrente alternada; Ni-DIA: eletrodo de diamante dopado com boro com níquel implantado; BDD: diamante dopado com boro; HMDE: eletrodo gotejante de mercúrio; MC: minociclina; EGPU: eletrodo compósito grafite-poliuretana; ASV: voltametria de redissolução adsortiva; SWV: voltametria de onda quadrada.

Introdução - 31

1.6 Eletrodos compósitos

Eletrodos sólidos foram os primeiros a serem utilizados em eletroquímica. 37,38

Com o advento da polarografia, proposta por Heyrovski nos anos 1920, popularizou- se

o eletrodo gotejante de mercúrio, inicialmente proposto por Kucera em 1903,

apresentando as vantagens de renovação constante da superfície com repetibilidade de

área. 39

Entretanto, devido às suas limitações em potenciais positivos, nos quais o Hg é

oxidado, o desenvolvimento de materiais eletródicos alternativos é um campo de

pesquisa profícuo e importante em eletroquímica e eletroanalítica. 39 Em adição, os

problemas ambientais resultantes da toxicidade do mercúrio, vêm limitando cada vez

mais o seu uso em eletroanálise.

Adams40 propôs o eletrodo de pasta de carbono, (do inglês, carbon paste

electrode, CPE), para ser utilizado como um material eletródico útil no intervalo de

potenciais em que o mercúrio não é adequado, com a vantagem de que esse eletrodo

também poderia ser aplicado em estudos de substâncias orgânicas, com interesse

biológico.

A aplicação dos eletrodos de carbono também oferece vantagens em relação aos

eletrodos metálicos, nos quais, pode ocorrer a formação de óxidos na sua superfície,

além da dificuldade de reprodutibilidade de área superficial entre polimentos sucessivos

e, também, do custo de preparação quando se usam metais nobres como ouro e

platina. 38

Desta forma, os eletrodos a base de carbono voltam a ser uma opção interessante,

apresentando custo relativamente baixo e possibilidade de preparação usando as

diversas formas em que este material se apresenta. 38, 41

Introdução - 32

A literatura apresenta diversas estratégias para a preparação de eletrodos à base

de carbono42, sendo exemplos clássicos os eletrodos de grafite pirolítico, carbono vítreo,

fibras de carbono, além das pastas de carbono utilizando diversos compostos orgânicos

como aglutinantes. Todos apresentam vantagens e desvantagens, as quais também são

descritas na literatura. 43 Dentre estas alternativas pode-se destacar os eletrodos

compósitos sólidos em que os aglutinantes líquidos são substituídos, geralmente, por

polímeros.

Recentemente,

Cavalheiro

et al.44

apresentaram

uma

revisão

sobre

determinações eletroanalíticas de fármacos, na qual os autores deram ênfase à utilização

de materiais à base de carbono nas análises voltamétricas.

Tallman e Petersen45 definiram um eletrodo compósito como “um material

consistindo de pelo menos uma fase condutora aglutinada por pelo menos uma fase

isolante”, como as pastas de carbono e os compósitos sólidos.

A principal vantagem dos eletrodos compósitos reside na estabilidade,

principalmente em solventes não aquosos e aplicações em fluxo, além da resistência

mecânica de tais arranjos, melhoria da relação sinal/ruído, com consequente ganho nos

limites de detecção, relativa simplicidade na preparação e renovação da superfície,

possibilidade de incorporação de modificadores, baixo custo na preparação e relativa

repetibilidade de área ativa. 46 As pastas de carbono apresentam, por sua vez, problemas

de reprodutibilidade de sinal e falta de robustez, principalmente para aplicações em

fluxo e em meio não aquoso, no qual o aglutinante pode ser solubilizado.

A facilidade de preparação desses materiais eletródicos permite preparar

sensores de tamanhos e formas diferentes, além da possibilidade de incorporação de

uma variedade de modificadores no corpo do eletrodo compósito e não somente na

superfície.

Introdução - 33

Um dos polímeros que vem sendo utilizado na confecção de eletrodos compósitos

sólidos é a poliuretana (PU), que foi a utilizada nesse trabalho.

Nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo estudos sobre as potencialidades

analíticas do compósito à base de grafite e poliuretana de origem vegetal, quando

utilizado como material de eletrodos em diversas técnicas eletroanalíticas e na

determinação de vários analitos, desde 2002. 47, 48

1.7 Resina poliuretana (PU)

Em 1848, Wurtz et al.49 descobriram o uretano (ou uretana), produto da reação

química entre um grupo isocianato e um grupo hidroxila, conforme Equação 3.

O

R-N=C=O + HO-R R-NH OR